哺乳动物轴突再生: 成年小鼠背根神经节体内电穿孔的研究

电穿孔是一种有效的方法, 将兴趣基因传递给细胞。本文应用这种方法对成年小鼠背根神经节的神经元进行了研究, 并对其在体内的轴突再生模型进行了描述。

该方法提供了一种体内基因转染技术，用于纵成年小鼠感觉神经元中的基因表达，用于哺乳动物外再生的未来研究。这种技术的主要优点是它省力省时，并且可以同时和单独过表达和敲低靶基因。要开始此过程，请用细记号笔标记麻醉小鼠髂嵴的两侧。

画一条连接髂嵴两点的线，以方便识别 L5 DRGs 位置。然后，用微型剪刀沿着下背部的中线切开三厘米。之后，将棘旁肌，如多裂肌和腰最长肌，从 L3 至 S1 棘突分离，并暴露 L4-5 和 L5-6 的筋膜关节。

接下来，使用微咬合器去除 L4-5 和 L5-6 的筋膜关节。随后，去除 L4 和 L5 的左神经弓，露出 DRG 的背侧。对于 DRG 注射，将 DNA 质粒或 RNA 寡核苷酸加载到玻璃毛细管移液器中。

然后，小心地将毛细管玻璃移液管的尖端插入 DRG 中，并使用细胞内微量注射分配系统逐渐注入一微升 DNA 质粒或 RNA 寡核苷酸溶液。对于电穿孔，用电极轻轻捏住目标 DRG，然后用电穿孔系统施加 5 个方形电脉冲。随后，闭合肌肉，然后用尼龙缝合线闭合皮肤层。

DRG 电穿孔后两到三天，腹膜内麻醉小鼠，将其四肢贴在软木板上，沿中线向左侧 0.5 厘米处切开一厘米。接下来，纵向切割肌肉，例如臀大肌和梨状肌。然后，暴露坐骨大孔和坐骨切迹之间的坐骨神经段。

用显微手术钳压碎神经 12 秒，并用尼龙神经外缝线标记压碎部位。之后，用尼龙缝合线闭合肌肉和皮肤层。大量后，在解剖显微镜下用微剪刀和微镊子小心地将 DRG 与神经根和坐骨神经分开。

然后，在 4 摄氏度下将坐骨神经直接转移到 4% PFA 中过夜。为了在解剖显微镜下对荧光标记的感觉轴突进行成像和测量，请用微型剪刀和微型镊子小心地剥离固定坐骨神经上的附着组织和膜。然后，用 PVS 清洗神经 3 次。

接下来，将坐骨神经放在载玻片上并保持笔直。在神经周围加入 80 微升抗褪色溶液，然后在其上盖上衬片。用压力压平整个镶样的组织。

之后，将扁平的组织放在倒置落射荧光显微镜下，该显微镜配备了用于马赛克采集和图像处理的附件。在测量再生轴突的长度时，从挤压部位到远端轴突末端追踪坐骨神经中所有可识别的荧光标记轴突。当应用电流体内电穿孔方法研究轴突再生时，坐骨神经被扁平化并成像。

每个具有独特轨迹和可识别远端轴突末端的再生轴突都可以从缝合结指示的挤压部位追踪。白色箭头、箭头和星星表示三个独特的轴突末端，它们都从挤压部位延伸出来。此外，用 EGFP 质粒对 DRGs 进行电穿孔，并收获脊髓。

纵向和矢状投影图像中对脊髓中 EGFP 标记的背柱轴突进行成像和识别。这是背柱轴突的详细视图，这是背根入口区轴突的详细视图。该图像显示了 EGFP 标记的轴突在背柱内的矢状投影。

或者，可以使用显微镜可视化软件处理共聚焦图像以重建 3D 图像。在尝试此程序时，重要的是要记住正确定位 L4 和 L5 DRG，并在不刺穿坐骨神经的情况下在硬脑膜上打一个结，同时用缝合结标记挤压部位。该技术发展后，为轴突再生领域的研究人员探索 PNS、自然轴突再生或可以进一步促进成年小鼠体内再生的基因铺平了道路。