Name: 颅内动脉闭塞允许经普通颈动脉修复再灌注的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 学习一种通过普通颈动脉修复实现再灌注的新型手术技术，用于小鼠实验性中风模型。该方法可减少病变体积的变异性，提高脑血流灌注，并降低实验所需动物数量，从而获得更可重复的实验结果。

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本工作由英国研究用动物替代、优化与减少国家中心（NC3Rs；项目编号 NC/M000117/1，授予 CG）资助。作者感谢莱斯特大学生物医学服务中心工作人员对实验动物的悉心照料，以及 Maria Viskaduraki 提供的统计学建议。代表性结果经许可改编自 Disease Models &amp;#38; 机制11.

本方案及所报告的数据均依照英国《1986年动物（科学程序）法》（项目许可证号 60/4315）以及机构伦理批准的要求进行。所有实验均按照《动物研究：体内实验报告指南》（ARRIVE 指南）16 进行报告。
1. 准备
<ol>
	<li>在手术前至少 48 小时，使成年雄性 C57BL/6 小鼠适应术后护理（例如，环境、垫料、恢复期食物）。 
	注意：MCAO 术后动物在手术后常出现进食和饮水困难。
	<ol>
		<li>为防止手术后体重过度下降，可通过将补水凝胶、凝胶食物以及浸泡/湿润的常规饲料颗粒直接放置在笼底，使动物适应任何 MCAO 术后的饮食。</li>
		<li>将笼具垫料更换为术后专用垫料，例如白色纸屑。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在开始手术准备或操作前，对所有手术器械进行灭菌。
	<ol>
		<li>可通过高压灭菌（至少 121 °C、15 psi，持续 15 分钟）或使用环氧乙烷（按照制造商正确说明，处理 8–10 小时）对器械进行灭菌。</li>
		<li>在准备操作前，对所有表面进行消毒。对手术过程中需要接触的物品，使用无菌手术巾或经高压灭菌的铝箔覆盖表面。在整个操作过程中采用无菌技术。 
		注意：高压灭菌的铝箔可用于覆盖手术中需要手持的器械或设备。在使用无菌手套和无菌技术的情况下，先将铝箔包裹物品，然后将其放入无菌区域。此后，需更换新的无菌手套。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 大脑中动脉阻塞手术
<ol>
	<li>使用成年雄性C57BL/6小鼠，手术时体重为24–31 g。采用5%异氟烷与2 L/min氧气混合诱导麻醉2，置于红色塑料麻醉室中。</li>
	<li>诱导后，降低异氟烷浓度以维持手术所需的适当麻醉深度（例如，70% N中1.5–2%2O230% O₂2），通过面罩给药并结合废气清除系统，以降低外科医生接触异氟烷的程度。 
	注意：一氧化二氮（N2O2) 可与氧气（O2以减少达到适当麻醉深度所需的异氟烷用量。</li>
	<li>术前给予全身镇痛（卡洛芬，10 mg/kg，皮下注射），并在围手术期对切口部位实施局部麻醉（布比卡因，2 mg/kg，皮下注射，用0.9%生理盐水1:10稀释）。</li>
	<li>术前通过腹腔注射给予200 µL无菌预热的0.9% NaCl溶液。</li>
	<li>使用小型电推剪剃除右侧颞区和腹侧颈部的毛发，以暴露皮肤。用5%氯己定溶液对手术区域皮肤消毒3分钟。在两只眼睛上涂抹眼用润滑剂，以防止手术期间眼睛干涩。 
	注意：如需进行脉搏血氧监测以观察血氧饱和度、心率和呼吸频率，可使用脱毛膏清除后肢部位的毛发。用洁净的棉签涂抹脱毛膏，脱毛后用稀释的氯己定溶液清洗该区域。此操作应在术前准备区域进行，以最大限度降低松散毛发污染无菌手术区域的风险。&#160;研究人员可根据当地惯例选择使用其他手术部位准备方法。</li>
	<li>将小鼠转移至手术区域，置于覆盖无菌铺巾的恒温加热垫上，保持俯卧位。维持麻醉状态 通过 鼻锥。插入直肠探头以监测小鼠体温，并维持在37.0 ± 0.6 °C。
	<ol>
		<li>在进行任何外科切口之前，检查后肢足部回缩反射和眨眼反射，以确认麻醉深度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将激光多普勒血流仪（LDF）探头连接至大脑中动脉（MCA）供血区域以记录血流。
	<ol>
		<li>使用解剖体视显微镜，进行切口 &#60; 在右眼与右耳之间暴露的颞部皮肤中点处，使用15号手术刀切开约1 cm。钝性分离覆盖颅骨的皮下组织，轻轻将其从骨面剥离，并用无菌棉签擦干骨面。 
		注意：必须小心操作，避免损伤颞肌。</li>
		<li>握住连接至LDF监测仪的0.7 mm柔性单根光纤探头，使用锋利的手术刀将其末端切割出平整的切面，将该端穿过环形探头支架，然后在光纤末端涂抹少量光学匹配凝胶。</li>
		<li>在探头支架的底边周围涂抹少量防水超强黏合胶，待其部分干燥并变得黏稠。</li>
		<li>在颞骨上方干燥颅骨，并在骨面上涂抹少量表面组织粘合剂，呈环形，用量以固定探针架为宜。</li>
		<li>将已安装光纤探针的探针固定器置于该区域（冠状缝前6 mm，外侧2 mm）。</li>
		<li>等待胶水干燥；干燥并固定后，开始记录激光多普勒血流仪（LDF）数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轻轻将动物翻转至仰卧位，注意支撑激光多普勒探头，防止其脱落。使用微孔医用胶带轻轻固定两只前爪，并在颈部下方插入一对棉签（或类似物品，如闭合的镊子），以抬高该区域并形成张力。用无菌铺巾覆盖小鼠，以维持无菌状态。</li>
	<li>开始分离并暴露颈总动脉（CCA）。
	<ol>
		<li>使用15号手术刀片在暴露的颈部腹侧正中做1.5 cm切口。</li>
		<li>使用轻柔的钝性分离技术，将唾液腺轻轻向两侧牵拉，暴露气管。</li>
		<li>使用钝性分离法，将颈总动脉从周围组织和迷走神经中游离出来。 
		注意：避免直接触碰迷走神经，因为迷走神经的任何损伤都可能影响运动、摄食和呼吸功能。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在颈总动脉（CCA）下方、血管背侧和迷走神经腹侧，穿过两段短（2 cm）不可吸收的6-0缝线。将其中一段丝线拉至术者侧，紧靠近端结扎颈总动脉（近端结扎）。另一段丝线松松地结扎于颈内动脉/颈外动脉（ICA/ECA）分叉方向（远端结扎）。</li>
	<li>开始分离颈外动脉（CCA）的一段时，在远端结扎线稍上方放置一个微血管夹，但不要阻塞分叉处。&#160;使用微型 Vannas 剪刀在颈总动脉（CCA）上剪出一个小孔。 
	注意：ECA 必须始终保持通畅。CCA 切口宽度不得超过血管直径的 40%，且应位于易于操作的腹侧位置；这将在 MCAO 术后的血管修复阶段发挥重要作用。</li>
	<li>将一根7-0硅胶涂层单丝缝合线插入颈总动脉（CCA），并向微血管夹方向推进。 
	注意：手术前必须根据小鼠的体重确定丝线规格；请参考制造商的使用说明。
	<ol>
		<li>收紧远端结扎线，力度以固定尼龙线且不造成损伤为宜。使用动脉夹持器移除微血管夹。 
		注意：此时不应看到有血液流失。如果出现血液反流，说明结扎尼龙线的结扎不够紧密。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将导丝推进至颈内动脉（ICA）。&#160;
	<ol>
		<li>确保纤维丝保持在颈内动脉（ICA）内，不进入翼腭动脉（PPA）。可通过轻轻提起并利用其中一根丝线将颈总动脉（CCA）向动物体外侧牵拉，引导纤维丝绕过朝向内侧的PPA开口。 
		注意：一旦进入大脑中动脉分支起始处，其供血区域的相对血流量将出现下降，该变化可在激光多普勒血流仪（LDF）数值上观察到；此现象可确认缝线位置正确。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用远端的丝线固定尼龙线，结扎得更紧一些，并在整个阻塞期间保持原位。 
	注意：根据个体实验方案的不同，在缝合伤口后，可将动物转移至恢复笼中使其苏醒，或在缺血阻断期间持续维持麻醉状态。若采用后者，需使用无菌预热的0.9% NaCl生理盐水防止伤口干燥。&#160;</li>
</ol>
3. 闭塞后
<ol>
	<li>在MCAO实验结束时，立即回撤栓线，直至白色栓线头部清晰可见。</li>
	<li>然后，稍微松开远端颈总动脉结扎线，使尼龙线头部大部分退出血管。 
	注意：如果外科医生有信心能够快速结扎远端以防止失血，则此时可完全移除导丝。</li>
	<li>在颈总动脉分叉处远端结扎线旁水平放置一枚显微血管夹。松开远端结扎线，完全取出栓线。在近端颈总动脉结扎线下方朝向术者方向再放置一枚显微血管夹。 
	注意：确保血管充分插入至钳子的夹口深处，以防止任何滑脱。夹子的位置至关重要，需便于后续步骤中使用夹子移除工具进行操作。可利用夹子提起血管，以便更好地留出空间并放置组织补片，将夹子水平置于周围肌肉上。</li>
	<li>使用Dumont #5镊子或显微Vannas剪刀小心移除两条丝线，并用无菌棉签擦干该区域。 
	注意：必须小心操作，避免切穿或切入血管。</li>
	<li>在无菌培养皿中，加入纤维蛋白原和凝血酶封闭剂溶液1和2（参见 材料表），确保两种物质保持分离，以便后续混合。 
	注意：仅需使用极小体积的试剂（&#60; 每次0.25 mL）。保持两种溶液分开，以防止两者过早发生反应。确保盖子按原方式盖回，以避免两个注射器之间发生交叉污染，否则会导致试剂在注射器内发生反应并凝固。使用前，将溶液储存在-20 °C。首次手术前，将密封剂解冻至室温。切勿重新冷冻密封剂；解冻后应保持在室温下，并可在此条件下储存。该注射器可用于多次手术，具有成本效益；但建议同一瓶试剂使用时间不超过1周，以防止污染。</li>
	<li>使用Dumont 5号镊子和显微Vannas剪刀沿胸锁乳突肌进行钝性分离，获取一层用于组织垫的薄层腹侧肌肉组织，确保切片厚度不超过1 mm，并沿肌肉上部肌纤维方向分离。 
	注意：切勿横切肌肉，否则将显著影响其功能。组织应足够大，以确保能轻松覆盖颈总动脉切口。</li>
	<li>使用Dumont #5镊子取组织垫，并将其在两种纤维蛋白原和凝血酶密封剂溶液之间均匀混合，使组织在两种试剂间形成通道。凝固过程将迅速发生；一旦开始凝固，立即将组织垫移至颈总动脉切口处。用中等力度将组织垫平整地贴附于创面，镊子保持张开状态。
	<ol>
		<li>迅速移除远端&#160;在轻柔固定组织垫的同时，使用微型血管夹。 
		注意：这允许少量血液反流，以进一步激活纤维蛋白原和凝血酶封闭剂试剂。只需施加足以固定垫片但不完全阻塞血管的压力即可。</li>
		<li>缓慢减轻组织垫的压力，使血液能够流经切口区域下方。随后，缓慢而轻柔地松开近端微血管夹，并完全移除。</li>
		<li>注意：为了确保血管完全通畅，放置组织垫和移除微血管夹必须迅速进行，以防止组织垫与颈总动脉（CCA）内壁粘连。然而，如果出现少量血液渗漏，可重新施加轻微压力于组织垫上，以延长凝血和封闭的时间。如果血液渗漏量较大或组织垫似乎未能有效封闭，应持续施加压力以防止失血，并重新安装两侧 CCA 微血管夹，以隔离切口并防止进一步出血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如果组织垫未能与血管密封，可按照步骤 3.3–3.7.3 重新尝试一次。</li>
	<li>血管封合后，使用可吸收的6-0缝线缝合伤口。&#160;如果在整个手术过程中持续进行激光多普勒血流监测（LDF），则需移除颅骨上的LDF探头，并使用可吸收的6-0缝线缝合伤口。</li>
</ol>
4. 术后护理
<ol>
	<li>将动物放入预热的恢复笼中（置于35 °C的加热架/垫上，或加热舱内）。 
	注意：研究人员可根据本地操作习惯选择其他温度和持续时间。</li>
	<li>术后立即、术后4小时以及之后每24小时2次，连续72小时，为所有动物皮下注射200 µL预热的0.9% NaCl生理盐水。 
	注意：预热0.9% NaCl的给药应根据动物状况决定。如需要，可增加补液量以确保良好恢复。</li>
	<li>在恢复笼中，为动物提供湿软饲料颗粒、干燥饲料颗粒、再水化凝胶和凝胶食物，并自由饮水（ad libitum）。</li>
	<li>术后24小时重复皮下注射卡洛芬（见步骤2.3）。 
	注意：所有动物接受相同剂量的卡洛芬；其可能的神经保护作用极小，可忽略不计。</li>
	<li>术后48小时内定期进行小鼠面部疼痛评分17，以评估疼痛水平，辅助判断是否需要追加镇痛治疗。</li>
	<li>在手术前立即称量动物体重，术后每日称重一次。每日进行观察并填写动物福利记录表，监测其食物和水摄入量及临床症状。</li>
	<li>在术后24小时和48小时进行功能行为观察。采用局灶性神经功能缺损评分量表对小鼠进行评估，检测其身体对称性、强迫性转圈、步态、45°网格攀爬能力、转圈行为、前肢不对称性以及触须刺激反应18,19,20。</li>
</ol>
5. 磁共振成像与图像处理
<ol>
	<li>使用结构性磁共振成像（MRI）测量病灶体积（LV）。 
	注意：以往曾使用其他方法，例如三苯基四氮唑氯化物（TTC）组织学染色，其结果与结构磁共振成像（MRI）数据具有相关性。然而，该方法仅可用于研究终点，无法进行纵向评估。采用纵向MRI扫描可减少研究所需的动物数量。
	<ol>
		<li>48小时后，在MCAO诱导完成后，使用异氟烷（5%异氟烷，1 L/min氧气）麻醉小鼠2 用于诱导，1.5–2% 异氟烷用于维持）。</li>
		<li>将小鼠转移至MRI扫描床，放置于呼吸传感器上以监测其呼吸频率，并插入直肠温度探针以在扫描期间监测体温。将2通道小鼠脑部射频接收线圈置于脑部上方以接收信号，随后将扫描床放入9.4 T水平孔径磁共振扫描仪中。 
		注意：此处射频发射采用内径为72 mm的体积线圈。</li>
		<li>使用快速自旋回波序列获取T2加权扫描图像。设置重复时间（TR）为3,000 ms，回波时间（TE）为40 ms。采用18 mm × 18 mm的视野（FOV），采集矩阵为256 × 256，层厚为18 mm × 0.8 mm，信号平均次数为3次，扫描时间约为10分钟。</li>
		<li>使用快速自旋回波序列采集扩散张量成像（DTI）数据。设置重复时间（TR）为 1,730 ms，回波时间（TE）为 35 ms，视野（FOV）为 20 mm × 20 mm，采集矩阵为 128 × 128，层厚为 16 mm × 1 mm，信号平均次数为 2，扩散编码方向为 14 个，以及最大 b1,024 s/mm²2.</li>
		<li>使用图像显示和测量软件包，在T2加权图像上测量左心室（LV）。测量病变区域，汇总各数值以计算总病变体积，同时考虑磁共振成像（MRI）切片厚度（在MRI扫描期间设定）。</li>
		<li>在测量完整的对侧和同侧大脑半球时，需考虑任何水肿情况以及病灶体积所占的百分比。采用先前所述的间接方法校正因水肿引起的脑肿胀，以测量病灶体积。21,22仅包含根据标准小鼠脑图谱确认为皮层组织的切片，避免包含额叶或小脑组织，以防止过度校正。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量病灶的弥散参数，并获取核心区域和半暗带感兴趣区域。
	<ol>
		<li>使用适当的磁共振成像分析软件，从扩散张量图像生成表观扩散系数（ADC）和分数各向异性（FA）图。</li>
		<li>使用能够执行图像线性配准的适当图像分析软件，将DTI图像与T2加权图像对齐。配准完成后，将扩散加权成像的病灶掩膜（缺血核心）从T2加权成像的病灶掩膜（缺血核心与半暗带）中减去，以估算半暗带区域。将所得的掩膜（核心与半暗带）应用于ADC图和FA图，以量化核心区和半暗带内的扩散参数。</li>
		<li>将同侧的核心区和半暗带掩模沿脑中线进行翻转，以获取对侧的ADC和FA值用于比较。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在啮齿类动物中通过线栓法诱导大脑中动脉阻塞（MCAO）是目前最常用的实验性脑卒中模型，因其可实现对受损区域的再灌注，从而模拟临床缺血性脑卒中发生后的病理过程7。本文报道了一种不同于传统线栓法诱导小鼠短暂性MCAO的替代手术方法。该替代方法包括镇痛处理、避免结扎颈外动脉（ECA）以及修复颈总动脉（CCA）切口，在使用磁共振成像（MRI）和组织学染色方法评估时，结果显示其可减少梗死体积（LV）的变异性11。
传统的MCAO诱导方法主要依赖于ECA的切断或至少结扎，已有研究表明，在大鼠中该操作会影响饮水行为，并导致MCAO术后体重下降增加14。本研究在小鼠中建立的方案避免了ECA结扎并加入了镇痛处理，结果显示MCAO术后体重下降减少，且对梗死体积无影响。由于镇痛可能对实验结果产生混杂效应，大多数实验性脑卒中研究中均避免使用或至少未报告使用镇痛。然而，完全避免镇痛并不总是合理的，有必要在满足动物福利需求与实现科学目标之间取得平衡。
动物体型、品系和脑血管解剖结构的差异，以及线栓的尺寸和类型变化，均被认为会影响卒中结果23,24. 此处所述的替代方法避免了再灌注过程中对基底动脉环（CoW）的依赖，从而至少在一定程度上减少了动物间梗死体积的变异性。小鼠的CoW解剖结构具有高度变异性，尤其是在C57BL/6品系中。6 品系，常用于实验性脑卒中研究。90%的C57BL/6小鼠由于后交通动脉（PcomA）通畅性存在变异，具有不完整的脑底动脉环（CoW），这可能因大脑中动脉（MCA）供血区域以外的结构灌注不足，而影响缺血性损伤的体积13,25修复小鼠的CCA（如图所示）可恢复血流 通过 CCA 到缺血区域，如先前在大鼠中所述15代表性数据表明，颈总动脉（CCA）修复后血流再灌注增加，尽管未直接测量 CCA 的血流。然而，外科医生可在血管修复后观察到 CCA 恢复血流，表现为从修复部位近端至远端的整个血管主干重新呈现搏动且充盈的状态。这种视觉确认，结合激光多普勒血流仪对缺血区域的血流读数，可用于确认血管修复成功。应用组织垫与移除 CCA 上血管夹之间的时间间隔可能影响 CCA 的最终通畅性，缩短组织垫应用至夹闭钳移除之间的时间可防止组织垫黏附至 CCA 对侧壁。尽管该替代性 MCAO 操作技术上具有挑战性，但其所需技能并不超过小鼠 MCAO 手术诱导所必需的基本操作技能。
传统上，实验性脑卒中研究的结果测量值变异度较高，可能导致统计效能不足。伦理和动物福利要求，结合经济和实际因素，可能进一步加剧研究的统计效能不足问题。通过降低结果的变异性，从而在实验组内获得更一致的病灶结果，可进行更有效的功效计算，最终实现研究样本量的合理设计。
总之，在小鼠中采用这种替代的CCA修复方法，可在实验性脑卒中后产生更小的病灶体积变异，从而在使用适当的功效计算时，减少检测治疗效应所需的实验组数量。

脑卒中的一个主要原因是大脑中动脉供血区域的局灶性缺血。尽管已开展大量针对缺血性脑卒中的临床药物试验，目前唯一具有确切疗效的药物治疗仍为组织型纤溶酶原激活剂（tPA）。1,2然而，由于安全性问题以及较窄的治疗窗（&#60; 4.5 小时），仅有约 15% 的卒中患者符合接受 tPA 治疗的条件，且血管再通率可能 &#60; 50%3,4.
可重复且具有临床相关性的脑卒中动物模型被认为是推动新型潜在脑卒中治疗手段开发的关键。然而，由于动物模型在实验结果的一致性和变异性方面存在担忧，因此仍有必要优化现有的体内模型，以提高从临床前研究向临床应用的转化效果。潜在治疗方法在临床前实验中虽显示疗效，却难以转化为临床应用，这一问题在脑卒中研究中持续存在5。转化失败的原因可能是多方面的，可能与试验设计、治疗延迟、临床脑卒中的异质性以及所用动物模型的局限性等因素有关6。脑卒中研究面临的一个关键挑战仍是开发安全且有效的治疗手段。
通过血管内线栓插入法阻塞大脑中动脉（MCAO）是实验性脑卒中最常用的in vivo啮齿类动物模型。该模型可在诱导缺血后恢复血流，模拟人类脑卒中发生时的病理过程7。然而，即使采用标准化的手术方案，特别是在小鼠中，仍常出现梗死体积差异较大且标准差不一的情况8,9,10。典型表现为出现小范围纹状体梗死和大范围纹状体-皮层联合梗死的双峰分布11。为诱导缺血，通常通过颈总动脉（CCA）或颈外动脉（ECA）切口插入线栓，术后该血管被永久结扎12。CCA的永久性结扎阻止了血液重新流入颈内动脉（ICA），进而影响大脑中动脉（MCA）供血区域。这使得再灌注只能依赖Willis环（CoW）内的侧支循环供血。然而，CoW的结构在不同个体动物之间存在解剖学变异，尤其是在C57BL/6小鼠中尤为明显——该品系是in vivo脑卒中研究中最常用的品系之一13。另一种经ECA插入线栓的方法虽可保留CCA的持续灌注，但该方法会破坏ECA供血区域的动脉血供，已有研究表明，在大鼠中该操作会对动物健康状况产生不利影响14。
在已建立的MCAO模型中，对前交通动脉（CoW）依赖以实现侧支供血和再灌注，可能是导致梗死体积在阻塞后存在变异性的部分原因。我们描述了一种替代的小鼠外科手术方法，该方法避免了颈外动脉（ECA）结扎，并对颈总动脉（CCA）切口进行修复，从而允许通过颈总动脉实现再灌注，而不依赖于前交通动脉（CoW）。先前在大鼠中的研究已表明，修复颈总动脉切口可成功实现经颈总动脉的再灌注15。我们已在小鼠中成功应用了这一方法11，并在本文中报告该实验方案，该方案可显著降低梗死体积的变异性，而梗死体积是实验性脑卒中研究中最主要的结局评估指标。
在本方案中，我们演示如何通过颈总动脉（CCA）血管插线法实施大脑中动脉阻塞（MCAO），随后进行颈总动脉血管修复，该过程包括使用组织垫片并应用封闭剂以实现再灌注。

<table><tbody><tr><td>0.7 mm 柔性单光纤探头</td><td>Moor Instruments，英国</td><td>P10d</td><td>与主探针代码 VP10M200ST 一起使用</td></tr><tr><td>7-0 硅胶涂层单丝线</td><td>Doccol，美国</td><td>701956PKRe</td><td>根据动物体型和体重而定——请参考生产商指南。本文所示代表性结果使用了此处的产品编号。</td></tr><tr><td>9.4T 临床前 MRI 系统</td><td>美国加利福尼亚州圣克拉拉市安捷伦科技公司</td><td>MY11520101</td><td>配备适用于小鼠脑成像的梯度线圈和射频线圈</td></tr><tr><td>动物监测与门控设备</td><td>美国纽约州石溪 SA Instruments</td><td>22124005</td><td>MRI兼容的温度与呼吸监测</td></tr><tr><td>布比卡因</td><td>英国斯托克-昂-特伦特国家兽医服务中心</td><td>512345</td><td>Marcaine</td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>查尔斯河实验室，英国牛津</td><td>B6JSIMA49D</td><td></td></tr><tr><td>卡洛芬</td><td>Norbrook Laboratories</td><td>143658</td><td>卡泊来弗 5% w/v 小动物注射液</td></tr><tr><td>4% 氯己定手部清洁液</td><td>VWR International Ltd，Lutterworth，英国</td><td>MOLN10008780</td><td>HibiScrub 抗菌洗手液，Molnlycke Health Care</td></tr><tr><td>棉签</td><td>英国斯托克-昂-特伦特国家兽医服务中心</td><td>213512</td><td>任何塑料材质的物体、棉签头部，经高压灭菌后均可使用。</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>卡尔·蔡司</td><td>OPMI99</td><td>常驻设备&lt;br/&gt; 任何能够提供1至5倍放大倍数的双目解剖立体显微镜均适用。</td></tr><tr><td>可吸收6-0缝合线</td><td>英国斯托克-昂-特伦特国家兽医服务中心</td><td>9544</td><td>可吸收缝合线 Ethicon Coated Vicryl 6/0（Ethicon 货号：W9981）</td></tr><tr><td>甜甜圈探头支架</td><td>Moor Instruments，英国</td><td>PHDO</td><td>小鼠探针固定器，与单根光纤探针配合使用，用于激光多普勒血流仪。</td></tr><tr><td>dumont #5 镊子</td><td>World Precision Instruments，英国赫特福德郡</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>纤维蛋白原和凝血酶密封剂</td><td>Baxter，伯克郡，英国</td><td>1502243</td><td>TISSEEL 即用型封闭剂溶液 2 mL</td></tr><tr><td>凝胶食物</td><td>Datesand 组，英国曼彻斯特</td><td>72065022</td><td>饮食凝胶恢复</td></tr><tr><td>图像显示与测量软件包</td><td>3D Slicer</td><td>https://www.slicer.org/</td><td>版本 4.0</td></tr><tr><td>图像显示与测量软件包</td><td>美国马里兰州国立卫生研究院</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td><td>NIH/ImageJ</td></tr><tr><td>LDF 监测仪</td><td>Moor Instruments，英国</td><td>moorVMS-LDF</td><td></td></tr><tr><td>微型Vannas剪刀</td><td>InterFocus Ltd，Linton，英国</td><td>15000-08</td><td>其他显微血管剪也可作为替代品使用，但需具备精细的尖端。</td></tr><tr><td>微血管夹</td><td>World Precision Instruments，英国赫特福德郡</td><td>15911</td><td>10 G 血管夹</td></tr><tr><td>微血管夹持器</td><td>World Precision Instruments，英国赫特福德郡</td><td>14189</td><td></td></tr><tr><td>MRI 数据采集与分析软件</td><td>美国加利福尼亚州圣克拉拉市安捷伦科技公司</td><td>VnmrJ 版本 4.2</td><td>修订版 A</td></tr><tr><td>15号手术刀</td><td>英国诺丁汉 Scientific Laboratory Supplies 公司</td><td>INS4678</td><td>无菌15号手术刀——产品编号P305，其他供应商也可提供。</td></tr><tr><td>不可吸收6-0缝线</td><td>英国斯托克-昂-特伦特国家兽医服务中心</td><td>W529</td><td>Ethicon Mersilk 缝合线</td></tr><tr><td>眼用润滑剂</td><td>英国斯托克-昂-特伦特国家兽医服务中心</td><td>847288</td><td>Lacrilube (5100G13)</td></tr><tr><td>光学匹配凝胶</td><td>英国 Moor Instruments 公司</td><td>PMG</td><td></td></tr><tr><td>脉搏血氧仪读取器</td><td>Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA</td><td>MouseOx</td><td>MouseOx - 大鼠 &amp;和小鼠脉搏血氧仪 &amp;和生理监测仪&lt;br/&gt; 与小鼠大腿传感器配合使用。</td></tr><tr><td>补水凝胶</td><td>Datesand 组，英国曼彻斯特</td><td>70015022</td><td>HydroGel</td></tr><tr><td>小型毛发剪刀</td><td>vetproductsuk.com</td><td>HS61</td><td>Contura 无线修边器/剪刀</td></tr><tr><td>无菌0.9% NaCl溶液</td><td>VWR International Ltd&lt;br/&gt; 英国卢特沃思</td><td>LOCA3528286</td><td>0.9% w/v 氯化钠静脉输注液 BP，500 mL，Ecoflac 容器&amp;frac12; PLUS</td></tr><tr><td>无菌培养皿</td><td>VWR International Ltd，Lutterworth，英国</td><td>5168021</td><td>50 mm 无菌培养皿。任何品牌均可，直径至少 50 mm。</td></tr><tr><td>局部组织粘合剂</td><td>World Precision Instruments，英国赫特福德郡</td><td>503763</td><td>GLUture 局部组织粘合剂</td></tr><tr><td>防水超级胶水</td><td>Loctite</td><td>Loctite 超能胶 Precision Max</td><td>大多数五金店有售。</td></tr><tr><td>白皮书芯片</td><td>Datesand group，英国曼彻斯特</td><td>CS1BPB</td><td>Pure-O'Cel</td></tr></tbody></table>

小鼠经颈总动脉修复实现再灌注的中脑动脉闭塞模型

Middle Cerebral Artery Occlusion Allowing Reperfusion via Common Carotid Artery Repair in Mice

缺血性脑卒中是全球成人长期残疾和死亡的主要原因。目前可用的治疗方法有限，仅组织型纤溶酶原激活剂（tPA）被批准用于缺血性脑卒中的药物治疗。当前缺血性脑卒中领域的研究重点在于深入理解卒中的病理生理机制，以开发并探索新的药物靶点。可靠的实验性卒中模型对于潜在治疗方法的推进至关重要。大脑中动脉闭塞（MCAO）模型具有临床相关性，是啮齿类动物缺血性脑卒中最常用的手术模型。然而，该模型的结果（如病灶体积）存在较大幅度的变异性，尤其是在小鼠中更为显著。本文所述的替代性MCAO模型通过使用含纤维蛋白原密封剂的组织垫修复血管，实现颈总动脉（CCA）的再灌注以及大脑中动脉（MCA）供血区域的灌注增加，同时避免结扎颈外动脉（ECA），从而改善小鼠的福利状况。该方法减少了对 Willis 环的依赖，而 Willis 环在小鼠中已知具有高度的解剖学变异。代表性数据表明，与传统MCAO方法相比，采用这种替代性手术方法可降低病灶体积的变异性。

本研究共使用24只成年雄性C57BL/6小鼠，手术时体重为24–31 g。其中一只动物在大脑中动脉闭塞（MCAO）后死亡，另一只因手术并发症被剔除。本文所展示的数据来自作者此前已发表的研究工作11，用于说明血管修复对MCAO结果的影响。所有数据均以均值 ± 标准差表示。采用D'Agostino-Pearson综合正态性检验对数据进行正态性统计评估。参数数据使用Student t 检验（两组均值比较）和单因素方差分析结合Sidak检验（多组均值比较）进行比较。非参数数据采用Mann-Whitney U检验进行比较。参数数据的变异性通过F检验进行评估，非参数数据的变异性则采用Levene检验进行评估。
通常在MCAO手术中，将阻塞尼龙线插入CCA，并结扎ECA，以防止尼龙线进入ECA而非ICA。避免结扎ECA并添加镇痛处理后，在相同手术者采用相同MCAO时间的既往研究数据对比下，显示出术后48小时体重减轻程度有所降低的趋势；而LV似乎未受影响，见图1。
小鼠接受60分钟MCAO诱导的缺血，随后通过CCA血管修复或典型的CCA结扎方法进行再灌注。图中展示了结扎与未结扎修复CCA的示意图。 图2.
采用激光多普勒血流仪检测大脑中动脉（MCA）阻塞期间及颈总动脉（CCA）血管修复前后MCA区域的血流灌注情况。图3显示，撤出栓塞线5分钟后，MCA脑区的局部脑血流量（rCBF）显著升高。在血管修复前，灌注维持在一定水平；CCA血管修复后，MCA区域的灌注进一步增加，表明与仅依赖Willis环供血相比，CCA修复可为缺血区域提供更充分的血液灌注。
在MCAO术后48小时，采用T2加权MRI测定总梗死体积（LV），并采用DTI扫描测定核心梗死体积（LV）。图4A显示，修复组与结扎组之间的总梗死体积或核心梗死体积均无显著差异。然而，根据Lavene's检验（用于非参数数据）或F-检验（用于参数数据）评估，总梗死体积和核心梗死体积的数据变异性在颈总动脉（CCA）修复组中显著降低。总梗死体积进一步分为皮层和皮层下梗死体积，如图4B所示。在颈总动脉修复组中，皮层部分的变异性显著降低，而两组间皮层下部分的梗死体积未受影响。
功效分析表明，采用颈总动脉修复术治疗MCAO后，每组更少的动物数量即可证明左心室（LV）减少30% 与 典型的CCA连接程序，参见 表1假设检验效能 1-β = 0.8，显著性水平 α = 0.05，并预测假设的对照组与实验组之间左心室容积（LV）减少 30%，据此进行效能分析。此外，假设各组间方差相等。 表1 显示了使用传统的CCA结扎方法或本文所述的改良CCA修复方法时，实验组和对照组所需的动物数量。请注意，实验组指假设的经处理动物组，对照组指假设的对照动物组；两组均将接受MCAO手术。
<img alt="MCAO术后ECA结扎组与非结扎组的体重和病灶体积比较，实验图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58191/58191fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：联合镇痛治疗及MCAO术后省略ECA结扎对预后的影响。（A）两组动物在MCAO术后前2天体重均下降，以MCAO术前体重的百分比表示。未行ECA结扎组（MCAO术中接受镇痛治疗但未行ECA结扎）在术后第2天体重下降程度呈现减轻趋势。（B）该图显示了MCAO术后48小时通过标准三苯基四氮唑氯化物（TTC）染色法测定的病灶体积（mm3）。数据以均值±标准差表示。ECA结扎组：n = 17；ECA未结扎组：n = 10。本图经Trotman-Lucas等11修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58191/58191fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="动脉切开术的标准与修复方案示意图；血管切口及带有密封剂的组织垫。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58191/58191fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：示意图显示了MCAO后标准的颈总动脉（CCA）处理方法与替代性CCA修复方法。 （A）该示意图展示了一种使用不可吸收缝线在颈总动脉切口两侧进行结扎的方法，从而实现右侧颈总动脉的永久性结扎。（B）该示意图展示了替代性的颈总动脉修复方法。采用一小块涂有纤维蛋白原和凝血酶密封剂的组织垫覆盖颈总动脉切口，以封闭切口，使右侧颈总动脉恢复完全灌注。本图经Trotman-Lucas et al.11修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58191/58191fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示MCAO期间与MCAO后、CCA结扎与修复时LDF信号变化百分比的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58191/58191fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：MCAO后局部脑血流（rCBF）参数变化。 在MCAO线栓移除后5分钟，CCA结扎组与CCA修复组的rCBF均较MCAO期间测得的rCBF发生变化（MCAO后）。本图展示了CCA血管修复前（修复前）及修复后5分钟（修复后）的rCBF数据。两组在MCAO后5分钟均显示出rCBF显著升高。在CCA修复组中，CCA修复后（修复后）rCBF进一步升高。MCAO后5分钟与修复前之间的rCBF无显著差异。所示数据由分析所得的时间过程数据浓缩而来，报告关键时间点，以均值±标准差表示。CCA结扎组：n = 10，CCA修复组：n = 10；**P &lt; 0.01，***P &lt; 0.001，ns：无显著性差异。本图经Trotman-Lucas等11修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58191/58191fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="病灶体积分析，T2与DTI核心；CCA修复/结扎对比；柱状图，脑部图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58191/58191fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：通过磁共振成像技术获得的病灶体积分析。 (A) 该图显示了病灶体积（LV；mm3) 在MCAO后48小时，通过T2加权MRI图像获得的总病灶体积（Total LV），以及通过DTI扫描与分析获得的核心病灶体积（Core LV）。代表性图像显示了T2扫描切片图像上的总病灶体积，并叠加了DTI核心病灶体积的掩膜。两组在总病灶体积（Total LV）方面的组内变异度均显著降低P = 0.015，CCA 修复： n = 10，CCA连接： n = 10, F-测试）和核心左心室（LV）P = 0.043，CCA 修复： n = 9，CCA连接： n = 6，使用Lavene检验）评估 F- 对参数数据进行t检验，或对非参数数据进行Levene检验。B) 该图显示了MCAO后48小时的LV，数据来自T2加权MRI图像，并分为皮层和皮层下损伤区域。CCA修复显著降低了数据的变异性（P = 0.03, F在病灶的皮质部分显示出显著性差异（-test），但对病灶的皮下部分数据变异性无影响。CCA修复： n = 10，CCA连接： n = 10. 所示数据为平均值 ± 标准差。 #P &lt; 0.05 (F-测试）， xP &lt; 0.05（Levene 检验）。该图改编自 Trotman-Lucas 等11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58191/58191fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>方法</td>
			<td>病灶体积 
			(LV; mm3; 均值 ± 标准差)</td>
			<td>检验效能</td>
			<td>显著性水平</td>
			<td>预期差异</td>
			<td>所需组样本量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCA 结扎（传统方法）</td>
			<td>94.08 ± 53.79</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.05</td>
			<td>30%</td>
			<td>n = 58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCA 修复（新方法）</td>
			<td>51.73 ± 22.78</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.05</td>
			<td>30%</td>
			<td>n = 35</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：传统CCA结扎法与本文所述替代性CCA修复法的代表性功效分析比较。 该表格展示了为计算检测左心室（LV）显著差异所需的预期组样本量而进行的功效分析，比较了对照组、传统或替代（新）方法组以及预测的实验组。表格显示了在假设功效为0.8、显著性水平为0.05，且预测实验组与对照组相比LV存在30%差异的情况下，所需各组的样本量。该表列出了两种MCAO方法（CCA结扎法与CCA修复法）的结果，以评估为获得LV 30%差异所需动物数量是否存在差别。对于两种方法，均假设实验组与对照组之间的方差相等。此图经Trotman-Lucas et al.11修改。

大脑中动脉内栓线阻塞是啮齿类动物实验性脑卒中最常用的体内模型。本文采用一种可实现颈总动脉修复的替代性外科手术方法，能够恢复颈总动脉的血流，并实现大脑中动脉供血区域的完全再灌注。

缺血性卒中是全球成人长期残疾和死亡的主要原因。目前可用的治疗方法有限，仅组织...

该方法有助于解答实验性脑卒中领域中的关键问题，例如如何降低与这些模型相关的变异，并如何提高实验结果的可重复性。该技术的主要优势在于，它允许通过颈总动脉实现再灌注，因而不依赖于Willis环，而Willis环在不同动物之间可能存在解剖学差异，这可能是导致实验结果变异的原因之一。对该方法进行可视化演示至关重要，因为颈总动脉血管修复步骤技术难度较高，尤其是在使用封闭剂确保修复后颈总动脉完全通畅的过程中，学习掌握该操作较为困难。首先，根据实验方案准备小鼠并进行麻醉。然后使用15号手术刀片在暴露的颈部腹侧正中做一条1.5 cm的切口。采用钝性分离技术，轻轻将唾液腺向两侧牵开，以暴露气管。然后将颈总动脉（CCA）从周围组织和迷走神经中游离出来。接着，将两段不可吸收的6-0缝线分别穿过颈总动脉下方、位于颈总动脉背侧且迷走神经腹侧的位置。将其中一根丝线拉向术者一侧，并在颈总动脉上松松结扎。然后在颈内动脉与颈外动脉分叉处附近松松地结扎第二根丝线。接着，在远端结扎线的上方放置一个微血管夹，确保不阻塞分叉部位。使用显微静脉剪刀在颈总动脉（CCA）上剪一个小孔。将一根7-0硅胶包被的微丝插入颈总动脉（CCA），并向前推进至微血管夹位置。然后收紧远端结扎线以固定微丝。使用夹持器移除微血管夹。接下来，将线栓推进至颈内动脉（ICA）。当线栓头部通过远端结扎处后，拉紧结扎线以防止出血。利用远端的丝线，将颈总动脉（CCA）提起并拉向小鼠身体外侧，引导线栓通过弯曲处，越过翼腭动脉（PPA）的开口。将尼龙线放置到位后，通过进一步收紧远端丝线结扎来固定。在MCAO期结束时，回撤尼龙线直至白色线头清晰可见。然后稍微松开远端颈总动脉（CCA）结扎线，使尼龙线头大部分退出血管。接下来，将血管内的栓子完全取出。随后，在颈总动脉分叉方向、远端结扎线旁水平放置一个微血管夹。然后，在近端颈总动脉结扎线下方朝向术者方向放置另一个血管夹。使用Dumont 5号镊子小心地移除两条丝线结扎线，并用无菌棉签擦干该区域。然后将纤维蛋白原和凝血酶密封剂溶液一和溶液二加入无菌培养皿中。使用微型静脉剪刀和钝性分离技术，获取一块较薄的胸锁乳突肌腹侧切片。然后，使用Dumont 5号镊子夹取组织垫，并将其均匀混合于纤维蛋白原和凝血酶密封剂溶液中。此处需确保组织垫足够大，以完全覆盖颈总动脉切口。当两种溶液混合后，必须立即将其覆盖在切口上，以防止过度凝固和粘附不良。将两种溶液混合后，将组织垫移至颈总动脉切口处。用中等压力将组织垫平整地按压在切口上，并松开镊子。迅速移除远端微血管夹，同时保持组织垫位置不变。接着，缓慢减轻组织垫的压力，使血液流经切口区域下方。随后，缓慢而轻柔地松开近端微血管夹的压力，然后完全移除。移除顶端夹子可使少量血液接触并激活密封剂。缓慢松开远端夹子，可使切口部位压力逐渐增加，进一步激活密封剂并有助于防止修复失败。最后，待血管完全封闭后，使用可吸收的6-0缝线缝合伤口。在本实验方案中，对24只成年雄性小鼠进行了大脑中动脉闭塞（MCAO）。避免结扎颈外动脉（ECA）并添加镇痛处理，在MCAO术后48小时显示出减轻体重下降的趋势。撤除栓线5分钟后，大脑中动脉供血区域的局部脑血流量显著增加。灌注维持至颈总动脉（CCA）血管修复完成，在修复后观察到大脑中动脉（MCA）供血区域的灌注增加。这表明，与仅依赖 Willis 环供血相比，CCA 修复有助于增加缺血区域的血流灌注。在大脑中动脉阻塞（MCAO）后 48 小时，采用 T2 加权磁共振成像（MRI）评估总体梗死体积（LV），并采用弥散张量成像（DTI）扫描确定核心梗死体积（LV）。这两个组之间没有显著差异。有趣的是，CCA修复组的总左心室（LV）和核心左心室变异性显著降低。我们的分析表明，与典型的CCA结扎手术相比，在MCAO后采用CCA修复手术，要证明LV减少30%，所需每组处理的动物数量更少。进行该操作时，需注意确保组织垫的尺寸足够大，能够覆盖颈总动脉切口。此外，操作速度也很重要，以免在将垫片放置到颈总动脉之前，封闭剂发生过度凝固。

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颅内动脉闭塞允许经普通颈动脉修复再灌注的研究

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大脑中动脉闭塞（MCAO）的管腔内模型是实验性缺血性卒中模型中最常用的模型。本文将结合激光多普勒血流仪的引导，详细演示该模型的全部操作步骤及其典型结果。...

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