寄生性锥虫锥虫锥虫的 f1-atpase 的分离

F1-ATPase 的纯化基于一种经典的生化方法，这证明对于我们了解其他 ATP 合成器的 ATP 生产机制至关重要。该技术的主要优点是，它产生一种高度纯净的酶，适合通过X射线晶体学或低温电子显微镜进行结构测定。虽然此协议针对 F1-ATPase 与锥形体进行分离进行了优化，但它可以适应其他来源，如组织或培养细胞，以及各种致病性蛋白酶。

这项技术可能导致新药的识别，以治疗严重的人类疾病。例如，结核分枝杆菌F-ATPase是结核病治疗的经过认证的药物靶点。为了开始协议，解冻并轻轻地重新暂停线粒体，也被称为米托皮斯特，以前通过低吨位解解从1倍10到11到2倍10到11个细胞的青霉蛋白锥虫布鲁西在5毫升的冰冷的缓冲剂 A.保持样品冷却。

接下来，根据制造商的说明，确定悬浮液中的蛋白质浓度，即BCA蛋白测定。在超纯水中执行 BSA 稀释系列，以构建标准曲线。用超纯水稀释少量样品 20 至 100 次，以符合 BSA 标准的范围。

计算样本中的总蛋白质量后，通过额外的缓冲器 A 稀释蛋白质浓度，将蛋白质浓度控制在每毫升 16 毫克，然后用声波将米托普斯特片切成倒置囊泡和膜片，每次声波 15 秒，总能量为 70 至 100 焦耳/脉冲，微尖直径为 3.9 毫米。在破碎时，在脉冲之间孵育样品在冰上30秒。声波化后，悬浮液可能会显得稍微暗一些。

在摄氏4度下，以5.4万克的超离心沉淀膜碎片，在4摄氏度下以9.8万克沉积5小时。去干上一样物，然后进行氯仿萃取。根据使用的缓冲区 A 的总量计算缓冲区 B 的体积。

将冷冻沉积物从离心管转移到均质器中。借助小型 Dounce 均质器，在缓冲器 B 中重新吸收线粒体膜的颗粒。将悬浮液转移到 50 毫升锥形管中。

从冰中去除样品，将样品和所有溶液保持室温，以执行其余步骤。然后加入饱和的氯仿，用HCl调整为pH 8.5，一对一。紧闭盖子，用力摇动样品整整20秒。

立即将混合物在8，400克下离心，在室温下5分钟。接下来，将上部、多云水相转移到1.6毫升微管。在样品中加入蛋白酶抑制剂，以取代氯仿处理去除的抑制剂。

在室温下以13，000克离心样品30分钟。旋转后，将上经剂转移到新鲜的微管中，然后重复离心以去除任何剩余的不溶性材料。平衡连接到快速蛋白液相色谱系统的五毫升阴离子交换Q柱，其Q柱缓冲液流量为每分钟5毫升，直到吸收率在280纳米且电导率稳定。

以每分钟一毫升的流速将上流器加载到平衡柱上。等待，直到 280 纳米的吸收度稳定在背景。以每分钟 0.5 毫升的流速，将 Q 柱洗脱缓冲液的 25 毫升线性梯度从 0%到 100%应用，并收集 1 毫升分数。

在pH 8.0的pH8.0下，铂尔曼ATP酶测定，每分微升与ATP水解活性的主要洗脱峰值对应10微升。汇集显示 ATPase 活动的分数。使用具有 100，000 分子量截止 PES 过滤器的旋转柱，通过膜超滤将池样本浓缩到 200 到 500 微升。

然后进行大小排除色谱。以每分钟 0.5 毫升的流速平衡连接到液相色谱系统的 Superose 6 增加柱，其至少 48 毫升的 SEC 缓冲液。将示例应用于列。

以每分钟 0.25 毫升的流速运行色谱，同时收集 0.25 毫升分数。接下来，运行与 SDS-PAGE 上 UV 280 纳米吸收度轨迹峰值对应的 10 微升分数。然后用库马西蓝弄脏样品。

通过铂尔曼 ATPase 测定，检测与包含 ATP 水解活性的 F1 峰值的第一个主要峰值对应的分数和 azide 灵敏度。然后进行 BCA 测定以确定蛋白质浓度。最后，将纯化的 F1-ATPase 保持室温，并在净化后三天内用于下游应用。

这种黄离子交换色谱的洗脱轮廓显示洗脱缓冲液中 280 纳米的紫外线吸收度和氯化钠浓度。选定的分数在SDS-PAGE凝胶上分离，并沾染了库马西蓝色染料。对应于 Anion 交换色谱中主要洗脱峰值并包含 F1-ATPase 的分数被汇集、浓缩，并用作大小排除色谱的输入。

主要污染物是二氢二苯二基脱氢酶，从大小排除色谱柱中脱氢作为离散峰。F1-ATPase 在第一个占主导地位的，主要是对称的峰中。通过 SDS-PAGE 分离纯化的 F1-ATPase 后，典型波段模式的 Coomassie 蓝色染色显示贝塔子单位上方可见的零星弱带，这些弱带表示 alpha 三个 beta 三头饰、200 度和 β 亚单位的寡聚体，并且没有质谱仪可检测到的任何污染物。

在执行氯仿萃取（协议的关键步骤）时，必须大力摇动样品，并立即进行有机和水相的离心分离。按照此过程，通过质谱法可以详细描述隔离的 F1-ATPase。此外，它可用于活性测定或结构研究，无论是自己或存在各种抑制剂或基板类比。