体内新生小鼠皮层神经元的双光子成像

我们提出了一种用于成像新生小鼠大脑皮层的活体双光子成像协议。该方法适用于分析皮层神经元的发育动态、控制神经元动力学的分子机制以及疾病模型神经元动力学的变化。

这种方法可以帮助回答神经科学中的关键问题，特别是那些与神经元插座形成相关的问题。该技术的主要优点是研究人员可以分析活体新生儿小鼠个体神经元的形态变化。从麻醉后的第五天幼崽开始，只有在对尾部捏紧测试没有反应的情况下才继续。

首先，用70%乙醇擦拭头皮，对头皮进行消毒。然后，使用用70%乙醇消毒的剪刀去除覆盖头骨的大约20平方毫米的皮肤。接下来，使用无菌钳子和干净的棉签浸泡在皮层缓冲液中，以去除头骨的筋膜。

使用加载尖端将组织粘合剂涂抹在倾斜的皮肤表面，以止血，同时避免要成像的区域。将幼崽放在另一个加热垫上，设置为37摄氏度，并允许它从麻醉中恢复。等待大约 30 分钟，直到组织粘合剂干燥和凝固。

一旦组织粘合剂干燥，开始在重新麻醉小鼠的颅窗准备。将一滴皮层缓冲液涂抹在头骨上，然后用无菌剃刀刀片小心地打开头骨直径一毫米的区域，使杜拉完好无损。应用皮层缓冲液以保持大脑表面湿润。

使用一小块浸在皮层缓冲液中的明胶海绵来止止出血。使用新鲜片来压缩颅骨切除术的一侧，在不接触杜拉的情况下从硬膜表面排出任何缓冲液和血液。这是准备透明窗口的最关键步骤。

杜拉必须完好无损，并且应从暴露的杜拉中去除刷子。接下来，使用移液器尖端涂抹一层薄层百分之一的低熔化红糖，溶解在皮层缓冲液中。将圆形三毫米玻璃盖滑到阿加罗斯凝胶层上。

在盖滑和阿加罗斯凝胶层之间浇注过量的阿加罗斯凝胶，以去除所有气泡。使用钳子去除多余的凝胶，从盖滑下突出。混合水泥粉和水泥液体。

使用移液器尖端将混合物涂抹在头骨凝固之前。然后，使用牙科水泥将定制的钛棒附在颅骨上。对齐钛条，并平行滑动盖滑，轻松捕获图像。

用牙科水泥盖住裸露的头骨。然后，皮下注射镇痛剂。将幼崽放在37摄氏度的加热垫上的恢复笼中一小时，直到牙科水泥凝固。

要开始成像，请先设置双光子激光波长。对于 RFP 激发，请使用 1000 纳米的波长。用 70% 乙醇擦拭盖滑的表面。

使用钛棒将麻醉幼崽连接到成像阶段的钛板上。使用测角表阶段，调整头部，使盖滑与客观透镜平行。使用设置为 37 摄氏度的加热垫在成像过程中保持幼崽的体温，将异氟兰浓度降低至 0.7% 至 1%将成像阶段置于两光子显微镜的 20 倍客观透镜下。

将一滴水涂抹在盖滑上。将软件设置为以 1.4 微米间隔获取 Z 堆栈图像。对于第四层神经元成像，将 Z 宽度设置为 150 到 300 微米，以成像整个树突形态。

使用慢速扫描和平均获得显示神经元形态的清晰图像。通常需要超过20分钟才能获得整个树突状形态。此图显示了P5幼崽的四层皮质神经元的代表性Z-堆栈图像。

箭头指示要分析的神经元。应从分析中删除树突模糊神经元。此图像显示上一图像中指示神经元的较高放大倍率图像。

蓝色箭头指示将在下一个时间点缩回的树突尖，而白色小箭头指示相邻单元格的轴突。4.5 小时后，蓝色箭头的树突尖被收回，带黄色箭头的树突尖被拉长。此处显示了一个具有代表性的树突形态重建，此处显示断开的树突的神经元应排除在分析之外。

在尝试此过程时，在过程中保持 dura 完好无损非常重要。使用这个程序，其他方法，如在推进成像可以执行，以回答与新生儿大脑的神经元活动模式相关的其他问题。