哺乳动物细胞质膜修复效率的高通量测定

该实验旨在解决细胞质膜生物学领域中的关键问题，并确定受损细胞修复其质膜的效率。该技术可用于高通量地测量细胞质膜修复的效率，并鉴定介导质膜修复的特定蛋白质及相关信号通路。首先，将20毫升浓度为每毫升2.5 × 10⁵个HeLa细胞的生长培养基悬浮液加入无菌移液管盆中，使用10毫升血清移液管充分混匀细胞。

接下来，使用多通道移液器在96孔平底、透明底、黑色聚苯乙烯组织培养处理板中每孔接种100微升细胞，每个实验组设三个复孔。请注意，均匀的细胞分布对实验成功至关重要，因为所有实验条件之间的比较均需基于相等的细胞数量。将细胞在37摄氏度、5% CO2的加湿细胞培养箱中孵育24小时后，预热酶标仪至37摄氏度，并将光学配置设为单色器，读数模式设为荧光，读数类型设为动力学模式。

在波长设置下，选择9纳米的激发带宽和15纳米的发射带宽。对于使用碘化丙啶的检测，将激发波长和发射波长分别设置为535纳米和617纳米。在板类型下，选择96孔板的板型格式，并选择与黑色壁透明底板相对应的预设板配置。

在读取区域中，选中将在整个动力学检测过程中进行分析的孔。在PMT和光学设置中，将每次读取的闪光次数预设为六次，并勾选从底部读取的选项。在时间设置中，对于30分钟的动力学检测，总运行时间输入0小时30分钟0秒，间隔时间输入0小时5分钟0秒。

确认设置信息中指定的参数，然后点击“确定”。接着点击“读取”以启动动力学运行。在设置模式下配置成像参数时，将光学配置设为MiniMax，读取模式设为成像，读取类型设为终点法。在波长设置中，选择透射光以及与实验激发和发射波长相对应的适当荧光通道。

设置平板类型和读取区域，如上所述；在孔区域设置下，设定每孔内需要成像的位点数量。在GFP的图像采集设置中，设定设备以每张图像20毫秒的曝光时间对整个孔进行成像。对于透射光，以8毫秒的曝光时间采集每个孔中心的单张图像。

对于碘化丙啶，使用20毫秒的曝光时间，在每孔的中心位置采集单张图像。然后在设置信息中确认参数，点击“确定”并点击“读取”以开始成像。为了建立基于荧光的高通量修复许可条件检测，每孔用200微升37摄氏度的M1培养基洗涤两次，弃去第二次洗涤液后，每孔加入100微升新鲜的37摄氏度M1培养基，并补充30微摩尔的碘化丙啶。

在修复限制性条件下，每孔先用 200 微升含 5 毫摩尔 EGTA 的 37 摄氏度 M2 培养基洗涤细胞一次，随后再用 200 微升 M2 培养基单独洗涤一次。弃去第二次洗涤液后，每孔加入 100 微升新鲜的 37 摄氏度 M2 培养基，并补充 30 微摩尔碘化丙啶。然后按照前述方法在透射光、GFP 和 PI 下对培养板进行成像。

在对培养板进行成像的同时，将一个96孔圆底聚丙烯微量培养板置于冰上，并按照之前培养板的设置方式配置该板。对于允许修复的条件，每孔加入100 µL冰上预冷的M1培养基（含60 µmol/L碘化丙啶），随后每孔加入100 µL冰上预冷的M1培养基，可选择性添加或不添加4倍浓度的单增李斯特菌溶血素O。对于限制修复的条件，每孔加入100 µL冰上预冷的M2培养基（含60 µmol/L碘化丙啶），随后每孔加入100 µL冰上预冷的M2培养基，可选择性添加或不添加4倍浓度的单增李斯特菌溶血素O。

必须在动力学检测开始前约五分钟，在冰上将单核细胞增生李斯特菌溶血素 O（listeriolysin O）配制至适当的实验浓度，此时第一块酶标板应置于冰上，同时准备第二块酶标板。当第一块板完成成像后，立即将其转移至冰上铺有铝箔的表面。五分钟后，从第二块板的每个孔中转移 100 µL 溶液至第一块已冷却板中相应位置的孔内，移液时应将吸头插入各孔溶液的弯月面以下，再推出液体，过程中不进行混合，以确保毒素的正确分布。

让毒素与宿主细胞结合一分钟，随后立即将第一块培养板转移至酶标仪，使用荧光分光光度计模式进行动力学后检测。在动力学检测结束后，立即对培养板进行动力学后成像，成像方法与动力学前成像所示方法一致。为根据细胞核荧光确定细胞数量，在微孔板细胞计数软件的设置中选择重新分析，并在图像分析设置中选择离散对象分析，使用541作为寻找对象的波长。

在“查找对象”选项中，使用“在图像上绘制”的查找方法，选择细胞核，然后单击“应用”，再单击“确定”并读取，以启动细胞计数算法。无论是否存在李斯特溶血素O处理，GFP表达均不会干扰碘化丙啶的强度测量。碘化丙啶的表达可能会渗漏到GFP荧光信号中，这一点可通过在动力学成像分析后与动力学分析前相比，HeLa H2B-GFP细胞中GFP荧光强度的增加得到证实。

然而重要的是，这种交叉信号不影响细胞计数，因为细胞核计数所涉及的分割过程不受GFP荧光增强的影响。在无单核细胞增生李斯特菌溶血素O（listeriolysin O）的情况下，无论培养基中是否存在细胞外钙离子，细胞膜完整性均保持不变；而在添加钙离子的培养基中经listeriolysin O处理后，碘化丙啶荧光强度呈现持续上升趋势。然而在缺乏细胞外钙离子的条件下，碘化丙啶荧光强度上升更为显著，反映出细胞膜无法有效修复。

或者，可使用远红光区具有荧光的碳菁类核酸结合染料替代碘化丙啶，以尽量减少与绿色荧光蛋白（GFP）的光谱重叠。此外，远红光染料具有更大的激发系数，可提供更高的信噪比，并在允许修复与限制修复条件之间实现更佳的分辨效果。在进行该实验操作时，建议在实验前一天对所有离心管进行标记，以便在实验当天能够充分准备所有试剂。

采用此方法后，还可进行其他实验，例如图像流式细胞术，以回答更多问题，比如成孔毒素是否对所有细胞造成均匀损伤，或某些细胞是否比其他细胞更易受到损伤。该技术建立后，为传染病和细胞质膜修复领域的研究人员探索不同孔径大小对各类细胞修复效率的影响奠定了基础。