Name: 在 vivo小鼠创面模型中活性氧的成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学习利用L-012化学发光探针在小鼠切除创面模型中进行活性氧实时成像的技术。该方法可非侵入性监测氧化应激水平，为研究组织修复与再生机制提供重要工具。

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我们感谢纽约大学医学院临床前影像中心的支持，特别感谢Orlando Aristizabal和Youssef Zaim Wadghiri。该中心为共享资源，部分由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助的Laura和Isaac Perlmutter癌症中心支持基金（NIH/NCI 5P30CA016087）以及美国国立卫生研究院国家生物医学成像与生物工程研究所生物医学技术资源中心基金（NIH P41 EB017183）提供支持。本研究由美国糖尿病协会资助。 &#34;糖尿病防治之路&#34; 由 D.C. [资助号 1-16-ACE-08] 和纽约大学应用研究支持基金资助给 P.R.

本文所述所有方法均已获得纽约大学医学院机构动物照护与使用委员会的批准。所有小鼠均饲养在屏障环境中，所有人员均需穿戴适当的个人防护装备。
1. 第0天：小鼠全层皮肤缺损伤口愈合模型的制备
<ol>
	<li>使用吸入式 2% 异氟烷对 8–12 周龄的糖尿病（Leprdb/db）小鼠进行麻醉。通过足垫夹捏试验确认每只小鼠均已充分麻醉。为每只眼睛涂抹无菌眼用润滑剂，以防止因干燥引起刺激。&#160;研究人员在使用异氟烷对动物进行麻醉时，应遵循所在机构兽医人员的指导规范。</li>
	<li>称量小鼠体重并记录每只小鼠的体重。&#160;使用血糖仪检测每只动物的血糖水平，以确认其糖尿病状态。&#160;</li>
	<li>对操作工作区和麻醉设备进行消毒。使用毛发修剪器去除小鼠背部毛发，随后涂抹脱毛乳液以清除残留毛发。使用酒精棉片对暴露的皮肤擦拭两次，并静置晾干。</li>
	<li>采用无菌 10 mm 活检打孔器，按照已建立的切除性伤口愈合技术7,8，制作两个贯穿肉膜层（panniculus carnosus）的 10 mm 全层伤口。所有存活手术过程中均需佩戴无菌手套。手术前将所有手术器械装袋高压灭菌，并仅在手术区域内打开。</li>
	<li>使用带有 10 mm 圆形切口的 0.5 mm 厚硅胶片将伤口固定开放，并用间断的 4-0 丝线缝合固定支架。</li>
	<li>手术后，将动物从麻醉状态中移出，并置于加热垫上以促进正常恢复。需要注意的是，若动物在操作过程中体温下降，可提前将其转移至加热垫上，以尽量减少麻醉期间的热量流失。&#160;持续监测动物状态，直至其清醒并能够自主活动。</li>
	<li>待动物完全恢复后，将其放回单独的笼具中，笼内提供食物和水（确保部分食物放置于笼底，以利于术后丰富化环境）。&#160;提供撕碎的纸巾作为额外的筑巢材料，持续两周。手术后的动物不得与其他动物同笼饲养，以避免不良互动及对伤口愈合状态的干扰。</li>
	<li>为实现术后镇痛，自手术结束后立即开始，按 0.1 mg/kg 体重剂量皮下注射布托啡诺，每日两次，持续 3 天。</li>
</ol>
2. 第1天：Keap1 siRNA的制备
注意：所有处理步骤均需在生物安全柜内进行。
<ol>
	<li>在冰上，于1.5 mL微量离心管中，将37.5 µL低血清培养基与12.5 µL 20 µM Keap1 siRNA（siKeap1）（250 pmol）混合，制备siRNA稀释液。</li>
	<li>在1.5 mL微量离心管中，将25 µL低血清培养基与25 µL脂质体混合液混合，制备脂质体稀释液。</li>
	<li>将50 µL siRNA稀释液逐滴加入50 µL脂质体稀释液中（体积比1:1），并轻轻混匀。</li>
	<li>室温孵育20分钟。</li>
	<li>加入50 µL 2%羧甲基纤维素水凝胶，通过上下吹打轻轻混匀。</li>
	<li>对每只动物分别给予无义siNS（对照组）或siKeap1（实验组）处理。将凝胶涂抹于伤口表面，用透明薄膜敷料包裹动物躯干以固定凝胶，同时保持四肢自由活动以维持其行动能力。</li>
</ol>
3. 第3天：L-012溶液的配制
注意：所有试剂均须在生物安全柜中配制。
<ol>
	<li>在1.5 mL微量离心管中，用1× PBS配制浓度为0.5 mg/100 mL的L-012溶液。</li>
	<li>手动涡旋振荡微量离心管。L-012不会完全溶解于PBS中，但应均匀悬浮于液体中。注意：切勿尝试将L-012溶于水，以免注射后干扰生理电解质平衡。</li>
	<li>使用27 G针头将溶液转移至1 mL注射器中。 
	注意：务必避免L-012溶液暴露于光线下。</li>
</ol>
4. 第3天：In Vivo 成像观察糖尿病伤口
<ol>
	<li>使用吸入式 2% 异氟烷对小鼠进行麻醉。&#160;研究人员在使用异氟烷对动物进行麻醉时，应遵循所在机构兽医人员的指导。通过足垫夹捏试验确认每只小鼠均已充分麻醉。向每只眼睛涂抹无菌眼用润滑剂，以防止因干燥引起刺激。</li>
	<li>轻柔地从小鼠身上移除透明薄膜敷料，避免扰动伤口。</li>
	<li>按顺序将小鼠放入成像室中。为维持室内适当的 O2 水平，将成像系统的进气流量和诱导室的 O2 水平均设置为 1.0 L/min。</li>
	<li>在注射 L-012 化合物前，对小鼠进行基线水平的生物发光成像并拍照。</li>
	<li>用酒精棉片擦拭腹部，并等待其干燥。使用 27 号针头，按每 200 g 体重注射 5 mg 的剂量对小鼠进行腹腔注射 L-012 溶液。例如，一只体重为 20 g 的小鼠应接受 0.5 mg 的 L-012。</li>
	<li>注射 L-012 后立即把小鼠放回成像室中各自的位置。在 60 分钟内，每隔 4 分钟进行一次成像，每次持续 1 分钟。将 10 mm 的伤口定义为用于测定 ROS 水平的兴趣区域。</li>
	<li>手术后，将动物从麻醉状态中移出，并置于加热垫上以促进正常恢复。持续监测动物，直至其清醒并能够自主活动。</li>
	<li>待动物完全恢复后，将其放回单独的笼子中，并维持 1.6 节中先前所述的相同术后饲养环境。&#160;不得将接受过手术的动物与其他动物同笼饲养，以防止发生不良相互作用及影响伤口愈合进程。</li>
</ol>

<ol><li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+sensitive+chemiluminescence+probe%2C+L-012%2C+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li>
<li>Daiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+NAD%28P%29H+oxidase-derived+superoxide+with+the+luminol+analogue+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012.</a> Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).</li>
<li>Imada, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+reactive+oxygen+species+generated+by+neutrophils+using+a+chemiluminescence+probe+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012.</a> Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).</li>
<li>Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+superoxide+detection+in+vascular+cells+by+the+new+chemiluminescence+dye+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012.</a> Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).</li>
<li>Fuchs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Hypoxia+PET+Imaging+Quantifies+the+Severity+of+Arthritic+Joint+Inflammation+in+Line+with+Overexpression+of+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Enhanced+Reactive+Oxygen+Species+Generation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation.</a> The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).</li>
<li>Asghar, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).</li>
<li>Galiano, R. D., Michaels, J. t, Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+reproducible+murine+model+of+excisional+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).</li>
<li>Soares, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+Nrf2+Signaling+Normalizes+the+Regenerative+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche.</a> Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+ROS+signaling+in+cells+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging ROS signaling in cells and animals.</a> Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).</li>
<li>Kielland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+inflammation+using+the+luminescent+probe+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012.</a> Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).</li>
<li>Balke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Oxidative+Cellular+Stress+Induced+by+Nanoparticles+in+the+Subcytotoxic+Range+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Small. , (2018).</li>
<li>Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+use+of+L-012%2C+a+luminol-based+chemiluminescent+probe%2C+for+detecting+superoxide+and+identifying+inhibitors+of+NADPH+oxidase%3A+a+reevaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).</li>
<li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signalling%22%5BJournal%5D)">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants & Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).</li>
<li>Rabbani, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Nrf2+activation+therapy+with+RTA+408+enhances+regenerative+capacity+of+diabetic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).</li>
<li>Rabbani, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+lipoproteoplex+delivers+Keap1+siRNA+based+gene+therapy+to+accelerate+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing.</a> Biomaterials. 132, 1-15 (2017).</li>
</ol>

我们没有需要申报的利益冲突。

传统的活性氧检测技术受限于复杂的操作流程，通常需要组织提取或类似的侵入性方法。近年来，基于创新成像技术的氧化应激检测已有报道，从而实现了对活性氧的时空动态评估9,10,11。与鲁米诺（luminol）、卢西格南（lucigenin）和MCLA相比，化学发光探针L-012具有多项优势1,4。该化合物无毒、易于吸收，且其生物发光信号强度显著高于鲁米诺或其他类似探针12。尤为重要的是，L-012可在不产生不良反应或对动物模型造成损害的前提下，多次连续给药，适用于长期纵向分析6。该方法无需复杂的专门培训，所需设备在大多数科研实验室中均 readily available，因而具有广泛的适用性。
...

通过炎症过程产生的氧代谢物不仅参与多种信号级联反应，还会导致细胞组分的破坏性改变1。采用灵敏且特异的技术来检测活性氧（ROS）对于研究炎症过程及表征氧化应激的影响至关重要。体内成像因其能够在活体组织中提供动态的空间和时间数据而具有重要价值。L-012是一种合成的化学发光探针，对超氧阴离子具有高度敏感性，在细胞、组织和全血中产生的光强度高于其他荧光探针1,2,3,4。该探针已成功应用于小鼠模型的体内成像，以研究包括关节炎和结肠炎在内的多种炎症性疾病5,6，但尚未在已建立的皮肤创伤愈合模型中应用。检测不同条件下产生的ROS同样有助于评估创伤愈合的进程。该方法具有高灵敏度和非侵入性的特点，使其成为在小鼠模型中研究创伤愈合过程的一种前景良好的技术。
Nrf2 是抗氧化反应的主要驱动因子，是一种对多种抗氧化酶启动子区域中常见的抗氧化反应元件（ARE）具有特异性的转录因子8。在无氧化应激的情况下，Nrf2 被 Keap1 锚定在细胞质中，进而导致其发生泛素化并被降解。Nrf2/Keap1 通路的失衡已被证实与氧化应激增加条件下红ox稳态异常以及伤口愈合延迟有关9。我们先前的研究表明，抑制 Keap1 可增强 Nrf2 活性，并促进糖尿病皮肤伤口病理性愈合过程的恢复9。
本文介绍了一种利用L-012辅助的生物发光成像技术，在皮肤切除伤口愈合模型中检测活性氧（ROS）水平的实验方案，该方法对于揭示ROS与伤口愈合之间的关联至关重要。该技术能够实时显示伤口及其邻近区域氧化负荷的动态变化。此外，该方法可快速评估影响氧化还原调控的干预措施及相关作用机制。本文采用Keap1基因敲低模型以恢复氧化还原稳态，验证本策略的适用性。由于该技术具有非侵入性且不会干扰伤口，同一动物可继续用于后续基于组织学或细胞裂解液的验证性分析。

<table><tbody><tr><td>BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J 小鼠</td><td>Jackson Laboratories</td><td>000642</td><td></td></tr><tr><td>13 cm x 18 cm 硅胶片（0.6 mm）</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>665581</td><td></td></tr><tr><td>3M Tegaderm 透明薄膜敷料</td><td>3M</td><td>88-1626W</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 转染试剂</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Keap1 Stealth siRNA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>1299001</td><td></td></tr><tr><td>Silencer 阴性对照&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>AM4635</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 减血清培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9004-67-5</td><td></td></tr><tr><td>L-012</td><td>Wako Chemicals</td><td>120-04891</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III XR 活体成像系统&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

体内成像小鼠伤口模型中的活性氧

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

活性氧（ROS）的产生是炎症过程的特征之一，但过量的氧化应激广泛参与多种病理过程，如癌症、动脉粥样硬化和糖尿病。我们先前已证明，核因子（红系衍生2）样2（Nrf2）/Kelch样红系细胞衍生蛋白1（Keap1）信号通路导致糖尿病皮肤伤口愈合过程中活性氧（ROS）严重失衡。由于ROS水平是伤口愈合进程的重要指标，因此特异且准确的定量技术具有重要价值。多种 体外 已描述了用于测量细胞和组织中活性氧（ROS）的多种检测方法；然而，这些方法仅能为每个样本提供单一的累积性测量值。近年来，基于蛋白质的指示分子和成像技术的发展使得对ROS进行独特的时空分析成为可能。L-012（C13H8ClN4NaO2是一种鲁米诺衍生物，可用于两者 体内 和 体外 化学发光 检测NADPH氧化酶产生的活性氧。L-012比其他荧光探针发出更强的信号，已被证明在检测活性氧方面具有高灵敏度和可靠性。L-012介导成像的时间序列应用可提供有关炎症过程的宝贵信息，同时减少动物处死需求，整体降低实验动物使用数量。本文描述了一种利用L-012介导的 体内 利用糖尿病小鼠局部Nrf2/Keap1功能障碍的切除性伤口愈合模型，通过成像技术定量氧化应激。

在采用已建立的切除性伤口模型制造双侧伤口后三天图1A），将糖尿病小鼠置于成像室中。在注射L-012之前，先拍摄初始照片并测量生物发光信号，以记录背景信号（图1B）。在腹腔注射L-012溶液后，将小鼠重新放置于成像舱内，随后在伤口中检测到活性氧（ROS）的区域观察到生物发光信号。图1C). 在选择正确的成像和分析设置后，如文中所述 图2，然后进行成像。在60分钟内，每5分钟间隔记录一次生物发光信号，每次持续1分钟（图3）。这表明了感兴趣区域的生物发光信号随时间逐渐达到饱和。在本研究的动物模型中，确定完全达到L-012饱和的最佳成像时间为50分钟，此后生物发光信号无明显变化。该时间会因所使用的动物模型不同而有所差异，应根据伤口模型的大小、动物种类、...

我们介绍一种非侵入性的体内成像方案，该方案流程简化且成本效益高，利用化学发光的鲁米诺类似物L-012，对小鼠全层皮肤缺损伤口模型中产生的活性氧（ROS）进行可视化和定量分析。

活性氧（ROS）的产生是炎症过程的特征之一，但过量时，氧化应激广泛参与多种疾病的发生发展……

该方法有助于解答组织修复与再生领域中的关键问题，即细胞保护通路、氧化应激与伤口愈合反应之间的关联。这一强大技术的主要优势在于，可实时测量伤口中活性氧物质的水平，从而确定其对组织再生的影响。与我共同演示该实验操作的是我实验室的研究助理 Jennifer Kwong。使用血糖仪测量每只8至12周龄麻醉后的糖尿病小鼠的血糖水平。使用毛发修剪器和脱毛膏去除第一只动物背部的毛发。用酒精棉片清洁暴露的皮肤两次，并用布单覆盖动物，仅暴露手术区域。待酒精干燥后，使用无菌的10毫米活检打孔器，按照成熟的切除性伤口愈合技术，在皮肤肌层（panniculus carnosus）上制作两个10毫米全层伤口。使用带有10毫米圆形切口的0.5毫米厚硅胶片将伤口固定于开放状态，并用间断的4/0丝线缝合固定夹板。随后将小鼠置于加热垫上并持续监测，直至完全恢复意识，然后将其放回单独的笼子中，并提供纸巾作为额外的筑巢材料，持续两周。第二天，将对照用无关小干扰RNA凝胶或实验用小干扰Keap1凝胶分别涂抹于每只动物伤口表面，并用透明薄膜敷料包裹躯干，以固定凝胶位置，同时保持四肢自由活动。实验第三天，使用配备27号针头的1毫升注射器吸取新配制的L-012溶液，并用遮光材料包裹注射器以保护溶液免受光照。进行成像时，小心移除每只小鼠的透明薄膜敷料，避免扰动伤口，随后将小鼠放入生物发光成像系统的成像室中进行伤口成像。将成像系统的进气流量和诱导室氧气水平设置为每分钟一升，并在基线水平对小鼠进行生物发光和明场成像。随后，用酒精棉片擦拭小鼠腹部，待酒精挥发后，按每200克体重5毫克的剂量，向每只小鼠腹腔注射一次L-012溶液。注射L-012溶液时必须避免触碰背部皮肤上的伤口，因为任何干扰均会影响伤口愈合进程及数据解读。注射前确保动物牢固地处于仰卧位。注射后立即将其放回成像室中的相应位置，并在60分钟的成像期内每4分钟对动物成像1分钟，将10毫米伤口定义为感兴趣区域，用于测定活性氧水平。然后将小鼠置于加热垫上并进行监测，直至完全恢复，再将其放回各自的饲养笼中。根据已建立的切除伤口模型制备双侧伤口后第三天，在注射L-012之前未观察到生物发光信号。经腹腔注射L-012溶液后，在伤口区域检测到活性氧的位置出现生物发光。在60分钟内每4至5分钟记录一次生物发光，持续1分钟，结果显示感兴趣区域的生物发光信号随时间逐渐达到饱和，完全L-012饱和的最佳成像时间约为50分钟。通过将光强总值除以面积，可计算出在注射L-012前后，经无关小干扰RNA处理或Keap1小干扰RNA处理的小鼠各感兴趣伤口区域的生物发光情况。对第10天伤口组织切片进行分析，通过苏木精-伊红染色验证活性氧水平检测的准确性，结果显示，与经无关小干扰RNA处理的组织相比，经小干扰Keap1处理的伤口细胞浸润减少，表明实验凝胶处理动物的炎症形态减轻。对伤口组织切片中F4/80（一种巨噬细胞标记蛋白）免疫反应性的分析表明，与经无关小干扰RNA处理的伤口相比，经小干扰Keap1处理的伤口中巨噬细胞数量减少，进一步证实了该方法的有效性。进行该实验操作时，务必确认L-012未过期，并将溶液置于避光环境中搅拌。完成该操作后，可采用靶向探针及基于免疫测定的方法来研究活性氧物种的亚细胞定位及其相关因子，从而快速评估影响伤口氧化还原状态的干预措施和作用机制。

in-vivo-imaging-of-reactive-oxygen-species-in-a-murine-wound-model

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在 vivo小鼠创面模型中活性氧的成像

本文介绍了一种高效的方法，用于深入研究旁分泌来源的活性氧（ROS）诱导内皮细胞Ca2+信号的可视化。该方法利用共培养模型，检测旁分泌来源的ROS所触发的血管内皮细胞内Ca2+动员。...

由旁分泌来源的活性氧触发的血管钙2+信号转导的可视化

NADPH 氧化酶是吞噬细胞中活性氧（ROS）的主要来源。由于 ROS 具有短暂存在的特性，因此在活体动物中测量和监测 ROS 水平十分困难。本文描述了一种在活体小鼠中连续定量检测 ROS...

不同动物模型中NADPH氧化酶活性的生物发光成像

利用数字活体表层荧光显微镜观察腹股沟肌微循环中毛细血管后微静脉，是研究白细胞-内皮细胞相互作用的便捷方法 体内...

实时数字成像技术观察大鼠提睾肌缺血-再灌注损伤（IRI）中白细胞与内皮细胞的相互作用

一种可用于在生理和病理生理条件下评估治疗化合物的皮肤伤口愈合小鼠模型。...

小鼠伤口愈合模型

小鼠背侧皮肤折叠窗模型展示了一个肌皮瓣急性持续性缺血区域的可视化图像。活体落射荧光显微镜技术可用于对微血管系统进行直接、重复的观察，并实现血流动力学的定量分析。形态学与血流动力学结果还可进一步与组织学及分子生物学分析结果进行关联。...

小鼠背侧皮肤折叠窗模型中的缺血性组织损伤：一种用于研究急性持续性缺血的皮瓣模型

本方案描述了利用磁夹钳在小鼠耳部皮肤上建立缺血-再灌注（IR）模型的方法。通过使用自行构建的活体成像模型，我们开展研究 体内...

在小鼠耳部皮肤诱导缺血-再灌注损伤以进行活体多光子成像观察免疫反应

本文阐述了利用可激活光学成像探针进行荧光成像的应用，以可视化目标分子 体内...

非侵入性 体内 利用可激活荧光成像探针进行炎症性基质金属蛋白酶活性的荧光光学成像

本实验方案的目的是在小鼠皮肤中诱导产生非致死水平的活性氧（ROS），从而进一步促进组织中的生理反应。...

通过可切换的原卟啉IX依赖性原位活性氧生成刺激小鼠皮肤干细胞微环境及组织再生

本研究旨在建立一种小鼠烧伤创面愈合模型。使用预热的黄铜模板在小鼠背部皮肤上诱导产生热力烧伤。烧伤组织经清创后，覆盖取自遗传背景相似的供体小鼠尾巴的皮肤移植物。...

一种利用同种异体皮肤移植物重建的烧伤创面小鼠模型

本实验方案描述了一种利用定性成像和定量流式细胞术检测小鼠肠道类器官中活性氧（ROS）的方法。该方法可进一步扩展至其他荧光探针，用于检测特定化合物对活性氧的影响。...

利用活性氧敏感型荧光探针对小鼠肠道类器官中的氧化应激进行分析

本文介绍了一种用于评估癌症和伤口愈合的临床前模型的氧敏感动态对比增强光声成像（OS-DCE OAI）方案。OS OAI 可对氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白进行成像，从而绘制组织氧合图；DCE-OAI...

利用OS-DCE OAI在癌症和伤口愈合的临床前模型中评估氧合与血管灌注

学习利用L-012化学发光探针在小鼠切除创面模型中进行活性氧实时成像的技术。该方法可非侵入性监测氧化应激水平，为研究组织修复与再生机制提供重要工具。

体内成像小鼠伤口模型中的活性氧

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