幼虫斑马鱼外系头发细胞的活体钙成像
2018年11月28日
斑马鱼是一个模型系统, 具有许多有价值的功能, 包括光学清晰度, 快速的外部发展, 并特别重要的听力和平衡领域, 外部位于感觉毛细胞。本文概述了转基因斑马鱼如何被用来检测毛细胞机械和突触前功能。
这种方法可以帮助回答听力和平衡领域的基本问题。它描述了如何检测感觉毛细胞功能的两个重要方面，机械转移和预突触活动。这种技术的主要优点是，它使我们能够可视化活体动物中毛细胞的功能，并研究头发细胞的集合如何检测和传输感官信息。
要开始此过程，请使用细钳子和钨丝来设计用于通过头部和尾部固定在硬化的封装剂上的幼虫的针脚。要制作头针，请单手握住一块0.035毫米钨丝。使用另一只手的细钳子，将导线从端弯曲一毫米，达到 90 度。
将钳子更换为细剪刀，并在折弯后切割一毫米，以创建销。然后使用钳子将针脚插入腔室上的硬化封装中。将幼虫放在灌注室的中心，使幼虫平放在硅胶套部上。
使用精细钳子，将 0.035 毫米头固定到垂直于幼虫。将头针插入眼睛和异色囊泡之间，向下插入封装剂。使用第二组钳子稳定幼虫沿着其后侧和腹侧，同时固定。
确保针脚的水平部分接触幼虫，并且不会一直压入包盘。角度针通风口，或稍微指向幼虫的前部，以避免干扰随后的心脏注射和毛细胞成像。使用钳子，将 0.025 毫米尾销插入到尾部，尽可能靠近尾部的尾部。
要将α bungarotoxin注射到幼虫中，使用凝胶加载移液器尖端将溶液的三微升回填到注射针中。将溶液均匀地加载到尖端，无气泡。然后将心脏注射针插入连接到手动微操纵器的移液器支架中。
在立体显微镜下，定位针头，使针头垂直与麻醉幼虫的 AP 轴对齐，向下指向 30 度角。接下来，将移液器支架连接到压力喷油器。将一波α bungarotoxin注射到溶液中，以测试针尖是否清晰。
如果没有看到红色，请非常轻轻地将针尖刮到针刃上，然后重试，直到针清晰。随后，将针头推进到心脏，直到它触及心脏外的皮肤。将针头压入幼虫，并查找心脏前皮肤上色素细胞的凹痕，以确保针头位于相对于幼虫的正确平面上。
然后，将针头推进更远，直到它刺穿皮肤并进入心腔。稍微拉回针头，将α型邦加罗毒素注射到心腔中。寻找心腔的膨胀，或红色染料进入腔。
用一毫升神经元缓冲液轻轻冲洗幼虫三次，以去除残留的MS222。切永远不要去除所有的液体。在灌注室中保持大约1毫微的神经元缓冲液中的幼虫。
在此过程中，使用凝胶加载尖端将 10 微升的神经缓冲液回填到正确断裂的流体喷射针中。将溶液均匀地加载到没有气泡的尖端。然后，将针头插入连接到电动微操纵器的移液器支架中。
将灌注室放入显微镜舞台上的圆形腔室适配器中。移动电动舞台，使幼虫位于视野的中心。随后，转动圆形腔室适配器，使AP进入幼虫与流体喷射针的轨迹大致对齐。
使用透光和差分干扰对比度，将幼虫聚焦到10倍的目标下。然后，提高 10 倍的目标。使用电动微操纵器，将流体喷射针向下进入视场中心，因此被透光照亮，几乎不能接触神经元缓冲液。
降低10倍目标，以专注于幼虫，以确认其位置。将目标放在流体喷射针上。在 x 轴和 y 轴中用微操纵器移动流体喷射针，直到其位置与幼虫的后侧平行。
之后，重新关注幼虫。将针头在 z 轴中向下，将针头沿鱼的后侧放置，离身体 1 毫米远。小心地移动圆形腔室适配器，以确保流体喷射针沿幼虫的 AP 中线对齐。
接下来，切换到60倍水目标。确保目标在神经元缓冲液中被处理。使用精细焦点定位神经瘤。
随后移动motarized阶段，将感兴趣的神经瘤放在视场的中心。保持流体喷射针尖沿鱼的后侧。请勿触摸流体喷射针尖到幼虫或腔室表面。
将流体喷射针与微操纵器一起放置，使其远离神经瘤外边缘 100 微米。然后，专注于尖发的毛发束。流体喷射针的底部应该在这个平面的焦点。
将高速压力夹从手动模式设置为外部模式，以接收来自成像软件的输入。通过按下零按钮将高速压力夹归零，并使用设定点旋钮将静止压力稍微设置为正。使用连接到头级输出的 PSI 气压计确认高速压力夹的静止输出。
要确定刺激发束所需的压力，请应用 0.125 和 0.25 伏输出的测试刺激，输出为 200-500 毫秒。对于每个测试刺激，测量毛束尖的偏转距离，基诺西利亚。选择将束距离移动约 5 微米的压力。
确保基诺西利亚的尖端始终保持焦点。要获取单平面图像，请选择在帧 30 后 30 帧采集期间以 3 秒为单位交付的刺激。要测量机械敏钙反应，请关注毛发束的基座，并开始图像采集。
要测量突触前钙反应，请聚焦在毛细胞底部，然后开始图像采集。此处概述了在模拟过程中，在神经瘤中可视化 GCaMP6S 强度中时空变化的步骤。时间根据时间戳从左到右表示。
顶行显示 70 帧 GCaMP6S F 图像序列中的 14 个时态条中的 5 个。在第二行中，基线已从每个 GCaMP6S F 装箱图像中删除，以创建增量 F 图像。在第三行中，增量 F 图像已从灰度转换为红色热查找表。
在底部行中，第三行已叠加到上行的 F 图像上。在尝试此过程时，请务必记住确保正确固定幼虫并使用适当的控制，如手稿中所述，从数据中排除运动伪影。使用α邦加毒素可能是危险的。
采取预防措施非常重要，例如在处理时戴手套。
概览
本研究探讨了转基因斑马鱼作为研究听觉和平衡相关的毛细胞机械感觉和突触前功能的模型系统的实用性。斑马鱼的光学清晰度和外部感觉毛细胞允许对这些功能进行活体可视化。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 感觉系统
背景
- 斑马鱼为研究听觉处理提供了一个视觉平台。
- 外部感觉毛细胞对听觉和平衡机制至关重要。
- 转基因方法增强了监测细胞功能的能力。
- 研究机械转导和突触前活动对于理解感觉信息处理至关重要。
研究目的
- 评估斑马鱼的毛细胞机械感觉和突触前功能。
- 开发观察这些过程的活体动物技术。
- 增进对感觉信息如何被检测和传递的理解。
使用的方法
- 研究采用转基因斑马鱼作为活体观察模型。
- 通过物理固定和流体喷射刺激技术测量毛细胞机械感觉。
- 主要实验步骤包括幼体固定、心脏注射以测试突触前功能以及毛束成像。
- 精细的显微手术技术使得能够精确应用试剂和可视化神经节。
主要结果
- 该方法在活体成像过程中展示了毛细胞功能的有效可视化。
- 对机械刺激的反应被表征，提供了对感觉处理的见解。
- 获得了与毛细胞功能力学相关的重要发现。
- 建立的方法可能为未来听觉和平衡研究提供途径。
结论
- 本研究强调了使用转基因斑马鱼进行听觉机制详细调查的潜力。
- 能够活体可视化毛细胞功能增强了我们对感觉系统处理的理解。
- 进一步探索可能对听觉障碍的机制见解产生影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
This technique enables real-time, in vivo quantification of mechanotransduction and presynaptic calcium dynamics in hair cells, providing a physiologically relevant readout for sensory function. By leveraging the larval zebrafish lateral-line system, researchers can de-risk target validation in auditory and vestibular pathways using a genetically encoded calcium indicator. The approach supports mechanistic de-risking by linking hair bundle deflection to synaptic output in a live, intact sensory epithelium.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mechanotransduction channel function and presynaptic calcium signaling in native hair cells.
- Operational Value: Provides a quantifiable, stimulus-evoked calcium readout for assessing target engagement in sensory pathways.
- Predictive Value: Supports functional confirmation of gene or drug effects on hair-cell activity prior to mammalian model testing.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates reproducible, spatially resolved calcium signals at apical and basal hair-cell compartments.
- Quantitative Output: Delivers delta F/F metrics that report relative changes in mechanosensitive and presynaptic calcium activity.
- Scalability: Compatible with high-speed imaging and fluid-jet stimulation for controlled sensory input delivery.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Zebrafish lateral-line hair cells share functional and structural homology with mammalian inner ear hair cells.
- Mechanistic De-risking: Allows dissection of sensory stimulus detection and transmission steps in a live animal.
- Translational Continuity: Facilitates target-to-phenotype alignment in hearing and balance disorder models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows by providing functional validation of targets involved in mechanosensation and synaptic transmission, bridging genetic perturbation to physiological output in a sensory epithelium.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of genes or compounds affecting hair-cell mechanotransduction or presynaptic function.
- Screening: Enables assay development for stimulus-evoked calcium responses with spatial resolution at subcellular compartments.
- Analytics: Produces time-resolved delta F/F readouts that quantify stimulus-locked calcium dynamics in live cells.
- Translational Research: Connects molecular perturbations to functional outcomes in a conserved sensory system relevant to human hearing.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal assessment of sensory hair-cell function across genetic or pharmacological conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic insight into sensory transduction and synaptic signaling in native hair cells.
- Operational Value: Standardizable immobilization, stimulation, and imaging workflow for reproducible calcium imaging.
- Strategic Value: Reduces biological uncertainty in target validation for auditory and vestibular therapeutics.
- Portfolio Impact: Informs go/no-go decisions by providing functional data on target modulation in a physiologically intact system.
Implementation Considerations
- Expertise in larval zebrafish handling, microsurgery, and confocal microscopy is required.
- Instrumentation includes a perfusion chamber, motorized micromanipulator, fluid-jet stimulator, and high-speed pressure clamp.
- Standardization across labs requires consistent larval staging, pinning technique, and stimulation parameters.
- Adaptation to other models is limited by the unique accessibility of zebrafish lateral-line organs.
- Motion artifacts and skill-dependent variability necessitate training and quality controls for reliable data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:33
Immobilizing Larva to Imaging Chamber
2:06
Injection of α-Bungarotoxin into the Heart Cavity to Paralyze Larva
3:47
Alignment of Larva and Fluid-jet
7:03
Single-plane Imaging Acquisition
7:34
Results: Spatiotemporal Visualization of Presyntaptic GCaMP6s Signals During Fluid-jet Stimulation
8:22
Conclusion
