一种用于监测 ampa 受体贩运的高含量检测方法

在这里，我们展示了一种高含量受体贩运检测，它与原发性神经元培养制剂相容。此方法分别标记表面固定神经元的地窖间受体池。使数据呈现为规范化表面或内化受体密度与该受体总体密度的比率。

高含量和受体贩运测定为测量神经网络内受体贩运特征的体积变化，以响应各种因素提供了一种有效手段。与替代方法相比，消耗的时间和材料少得多。破坏和戒律贩运与多种神经系统疾病有关，并被认为是一个有吸引力的药物治疗目标。

例如，研究表明，阿尔茨海默病的最早迹象之一是突触损失和突触和戒律池减少。这种技术需要许多不同的不同难度步骤。特别是因为处理96井板和操纵井可能证明很难为没有经验的人。

由于实验结果对不当处理非常敏感，因此查看执行的各个步骤非常有用。首先，通过从每一个井中去除100微升的预存在介质来喂养96井板中的神经元。代之以100微升的介质，预热至37摄氏度。

每三到四天体外14天，使用多管道从每井取出100微升介质，并汇集介质。将两个微升 TTX 库存溶液添加到一毫升的池化条件介质中，以创建 TTX 的四微摩尔溶液。

用 100 微升的四微摩尔 TTX 溶液处理每个井中的神经元。如果池条件条件不足，请添加一些以前存储的介质。在37摄氏度的5%CO2培养箱中孵育4小时。

在此之后，去除含有介质的现有TTX，加入200微升预热神经元介质，并在室温下孵育微板15分钟。首先从微板中去除神经元介质。在微板的相应孔中加入50微升的抗gluA1或抗葡萄糖2抗体溶液。

将50微升的神经元介质添加到二级抗体控制井中。在室温下孵育20分钟，允许抗体结合。在此之后，从油井中删除现有介质。

每井用100微升室温神经元介质清洗微板三次，以去除任何未绑定的抗体。然后在每个井中加入100微升100微摩尔DHPG库存溶液。在37摄氏度的5%二氧化碳孵化器中孵育10分钟。

接下来，删除 DHPG 溶液，向每井添加 100 微升神经元介质。再次重复此过程。然后在37摄氏度的5%二氧化碳孵化器中孵育5分钟。

在实验当天，准备了4%的甲醛和4%蔗糖NPBS的溶液。从每一个井中去除介质，代之以 100 微升的准甲醛和蔗糖溶液。对每个添加时间点重复此过程。

在4摄氏度下孵育微板20分钟。然后取出固定剂，向每井添加 100 微升 DPBS。卸下 DPBS，向每井添加 150 微升阻塞缓冲器。

在室温下孵育90分钟。去除阻塞缓冲液，向每井添加50微升的二级抗体溶液。在室温下孵育60分钟，同时防止板免受光线影响。

去除抗体溶液，向每井添加100微升TBS。在室温下孵育五分钟。重复此过程，从添加 TBS 的井中去除介质，并在室温下再孵育四次。

在此之后，从微板上取出 TBS。在每个井中加入 100 微升溶液，其中 4% 甲醛和 4%蔗糖。在室温下孵育十五分钟。

去除甲醛溶液，在每个井中加入100微升TBS，在室温下孵育5分钟。重复此步骤两次。首先准备含有2%皂素的TBS溶液，并短暂地涡旋溶液，以完全溶解皂素粉。

使用 2 微米过滤器，过滤溶液以去除可能导致自荧光的任何颗粒。在每个井中加入150微升这种2%皂素溶液，并在室温下孵育15分钟。然后去除皂素溶液，并在每个井中添加 150 微升的阻塞缓冲液。

在室温下孵育90分钟。在此之后，去除阻塞缓冲液，并添加五十微升的二次抗体溶液到每一井。在室温下孵育60分钟。

然后在每个井中加入100微升TBS，并在室温下孵育5分钟。重复此过程，添加 TBS 并在室温下孵育四次。使用红外激光成像系统成像96井微板根据厂家说明。

将扫描分辨率设置为 84 微米。扫描质量到中等，对焦偏移根据使用96井微板的基本高度。单击"图像工作室"菜单按钮，导出数字媒体的图像，然后以 TIFF 格式以 300 dpi 的分辨率导出图像。

打开图片J斐济的图像。通过单击图像菜单，然后通过颜色拆分通道来拆分颜色通道。然后从分析工具打开 ROI 管理器。

选中 ROI 管理器中标签的框，以便用数字对圆圈进行分类。在 6 80 或红色通道中，通过选择圆工具并绘制一个精确拟合第一个井的圆来选择感兴趣的区域。然后按 Ctrl 加 T，将圆圈拖动到下一个井。

重复此过程，直到所有油井都圈成一圈。从 ROI 管理器单击度量值。选择显示的值，并将它们复制到分布工作表。

接下来单击绿色通道，将选定的 PI 转置到图像中。从 ROI 管理器单击度量值。选择显示的值，并将它们复制到分布工作表。

在此计算文本协议中概述的表面受体表达式的更改之后。在这个程序中，使用高含量的安培受体贩运和测定来检测弧在调节安培受体贩运的持久性。神经元使用钠离子通道阻滞剂 TTX 进行处理，该阻滞剂抑制作用电位并降低电弧水平。

其次是DHPG，它诱导弧形翻译和泛泛化。含有阿帕受体亚基的gluA1和gluA2的表面和内化池在DHPG洗涤后5分钟和15分钟测量。ArcKR神经元显示，与类型神经元相比，使用DHPG治疗时，葡萄糖1内分症增加。

当仅使用 TTX 治疗神经元时，看不到此效果。与威尔型神经元相比，gluA2 亚基的表面表达在短时间内显著增加。指示潜在的子单位替换。

确保细胞为非流动性固定甲醛应在实验当天新鲜准备。在表面受体标记后，必须重新修复细胞。其他方法，如共和显微镜将能够提供单细胞分辨率，以进一步描述神经元结构和受体定位的相关变化。

破坏弧形改变安帕受体贩运的时间动力学，以回应MgluR调解有限公司。 未来的方向将是测量安培受体贩运，以回应其他刺激。这种测定可能适应其他细胞类型，治疗和受体，只要程序经过仔细调整和适当验证。

必须注意确保细胞密度、处理时间、固定步骤、渗透步骤和试剂选择得到优化。为了成功和高效地完成测定，在实验当天准备 DHPG 溶液和 4%半成甲醛、4%蔗糖溶液非常重要。需要用瓦克尔或 TTX 进行良好处理，以确保观察到的效果特定于治疗。

也至关重要的是，包括只使用二级抗体处理的井，以控制非特异性结合产生的背景荧光。