人原发性前列腺组织培养的处理与评价

在这里, 我们提出了一个协议, 以指导人类的原发性前列腺有机体处理, 然后建议终点, 以评估表型。介绍了种子、培养维护、基质凝胶回收、形态定量、嵌入切片、ffpe 切片、全装染色及商业检测的应用。

前列腺器官是研究发育和疾病的令人兴奋的体外系统。他们克服了不朽细胞系的挑战，为动物模型提供了廉价的替代方案。它们可以从人类前列腺细胞中生长，正如我们在该协议中所示，以及小鼠前列腺细胞，作为一个与疾病相关的临床前模型系统。

许多实验室都描述了有用的培养方法和端点。但是，我们希望将这些细节汇集到一个协议中，并展示新用户特别具有挑战性的步骤。随着技术的进步，前列腺癌器官可以从患者样本中生长，作为模拟疾病和治疗反应的精确医学方法。

培养条件是特定于前列腺器官，但许多端点已经适应其他组织类型。用户可以根据感兴趣的单元格类型调整此协议的某些部分。开始这个实验，在矩阵凝胶编码的96孔板中生长上皮细胞，如手稿中所述。

要在12天后从板中收集有机体，请从孔中去除介质，而不干扰基质凝胶。然后立即向每井添加约200微升中性蛋白酶，其基质凝胶与中性蛋白酶的比例约为1比2。在37摄氏度下孵育板20分钟。

然后移液器上下机械分离混合物，并在37摄氏度下再次孵育20分钟。孵育后，将中性蛋白酶基质凝胶细胞混合物从几口孔转移到微离心管中。以300倍g离心使细胞分裂3至5分钟。

取出上一液，并保存有机颗粒，以便随后进行分析。要创建嵌入模具，请切出 1000 微升移液器尖端的一小部分，以制造一个可容纳 50 微升的圆柱体。然后从同一尖端的较宽部分，制作适合第一个模具的第二个较宽的模具。

要创建冷块，请用胶带将冰袋与粘合剂面向上包装。然后将模具垂直附着在胶带上。要将有机体嵌入组织学凝胶塞中进行加工，请先用汉克平衡盐溶液的一毫升清洗先前获得的有机体颗粒。

在300次g下离心3至5分钟后，取出上经剂。然后将30至50微升液体组织凝胶加入有机体颗粒，然后通过上下缓慢移液轻轻混合以重新暂停颗粒。将混合物转移到冷块上的模具中，让试样冷却并凝固成插头。

接下来，使用柱塞将插头从小模具中推出并推入较大模具的中心，并在插头周围通过移液清除 2% 的 agar 来填充。为了标记样品的顶部，移液器组织染料在插头顶部 2%agar。一旦阿加冷却，使用柱塞将插头转移到组织学盒中。

用铅笔给盒式磁带贴上标签，并放入10%中性缓冲的甲醛中，进行隔夜固定。第二天，将盒式磁带从10%中性缓冲形式转化为70%组织级乙醇，然后进一步加工并嵌入石蜡中。首先修剪块的基座厚度为 10 微米。

出现包含插头区域的部分后，停止修剪。锁定微原子转子，将块重新转移到冰上冷却。将刀片移动到新的未使用的部分。

将块重新转移到夹具。解锁机器，开始修剪每节五微米。使用钳子将部分转移到 40 摄氏度的水浴，并允许其扩散。

将滑梯垂直浸入水中，将滑梯转移到其上。然后在明亮的场显微镜下观察幻灯片，以确保该部分存在器官。在45至50摄氏度下烘烤过夜，然后按照手稿中所述进行染色。

开始这一部分的实验与未使用的井的96孔基质凝胶涂层板与有机体。通过对井的一侧进行移液，在介质和基质凝胶之间留下空间，在不破坏有机体培养的情况下小心去除尽可能多的介质。使用修剪的1000微升移液器尖端，用PBS预湿，以绘制一滴含有感兴趣的有机体状的基质凝胶。

将跌落点分配到腔室滑轨的中间。用肉眼，用细尖的移液器从室内滑梯中吸出多余的介质和基质凝胶。促进有机体粘附在玻璃上，防止在随后的洗涤过程中样品丢失。

将幻灯片放在 37 摄氏度的培养箱中 30 至 45 分钟。缓慢移液，以防止脱离菜，加入200微升1XPBS洗风琴在室温下5分钟，轻轻摇动。小心地取出 1X PBS，并加入 200 微升 4% 的甲醛。

在室温下用轻轻的摇动修复30分钟。在 PFA，按照本协议所述，清洗并继续进行后续渗透和染色步骤。立即安装和映像。

未沾污的新鲜剪裁幻灯片清楚地显示了人类原发性前列腺器官，而在未沾污的干滑道中，器官看起来是半透明的，在明亮的现场显微镜下更难检测。与处理良好的器官相比，血氧素和 eosin 染色显示，人类原发性前列腺器官处理不当，如腐蚀性移液、处理方案错误。人类原发性前列腺器官是形式固定，石蜡嵌入，分段，并染色与基底细胞素5和发光细胞素8，基底p63和发光细胞素8，并成像与共体显微镜。

全安装人类原发性前列腺器官被染色的基底细胞素5或发光细胞酮8，并反染色与 phaloidin 和DAPI，并用共和显微镜成像。全安装人类原发性前列腺细胞器官被荧光标记的Ede染色，用霍施特反染色，并用共生显微镜成像。在整个过程中，将你的器官可视化是重要的。

收集各部分后，请确保在幻灯片上显示样品，并确保在整体安装过程中观察到器官。从基质凝胶中收集器官后，您可以将其完整安装并使用商业测定，或分离到单细胞进行流式细胞测量或单细胞测序。3D培养为研究人员提供了一种在实验室培养皿环境中研究组织的新方法。

它可以应用于器官生成，或用于了解患者的疾病的病理学。处理患者样本时，请始终小心谨慎，并处理这些材料，作为血液传播的病原体暴露的潜在情况。