Name: 划痕迁移分析和背皮折叠室的体外和在Vivo分析伤口愈合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 学习体外划痕迁移分析和体内背皮折叠室伤口愈合检测方法，使用原代成纤维细胞和小鼠模型评估细胞迁移与药物疗效，为创伤修复研究提供可靠技术方案。

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我们感谢 Petra Weissgerber 博士以及萨尔大学医学院 SPF 动物实验中心（SFB 894 项目 P2）和萨尔大学医学院临床与实验外科研究所动物实验中心的工作人员。我们感谢 Andreas Beck 博士对稿件的审阅。本研究由德国研究基金会（DFG）特别研究领域（SFB）894 项目 A3（资助对象：A.B. 和 V.F.）提供资金支持。

所有实验操作均经萨尔州及萨尔兰大学动物福利委员会批准，并依照伦理规范和动物福利要求进行。
1 原代细胞培养与siRNA转染
注意：在所述方法中使用的是原代成纤维细胞。这些细胞在伤口愈合和组织重塑过程中发挥着关键作用11在本实验中， Cacnb3 基因，编码高电压门控钙通道的Cavβ3亚基12 呈下调，从而表明其在体外细胞迁移和体内皮肤伤口修复中的作用4.
<ol>
	<li>siRNA的制备：在重悬siRNA之前，先短暂离心管体，以确保内容物沉降至管底。用以下溶液重悬siRNA： 100 µL RNase-free缓冲液（100 mM醋酸钾，30 mM HEPES，pH 7.5），由制造商提供，浓度为 20 µM这是一份siRNA的储存液。</li>
	<li>将此储备液分装 10 µL 每管（20 µM 浓度）并于 -20 °C 直至使用。</li>
	<li>使用超细永久性记号笔，在6孔板每个孔的底部标记一条水平线，以便始终能够识别相同的划痕区域并追踪其闭合情况。 
	注意：本实验采用6-well培养板，因其尺寸足够大，可提供充足的空间和操作灵活性，便于使用移液器枪头 consistently、reproducibly 且垂直地划出划痕 200 µL 用移液器吸头在细胞单层上轻轻划线。如果细胞数量有限，可选用12孔或24孔培养板，这种方法可能是更经济的选择。</li>
	<li>接种从野生型和β3缺陷型小鼠分离的原代成纤维细胞4，在6孔板中以5 × 10的密度5 每孔加入2 mL添加10%胎牛血清（FCS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），使细胞密度为每孔若干细胞。 
	注意：5 x 105 每孔细胞数量已针对6孔培养板和小鼠原代成纤维细胞确定。若使用12孔或24孔细胞培养板或其他细胞类型（其大小可能不同），可能需要进行测试。细胞操作应在II级生物安全柜等无菌环境中进行。</li>
	<li>用细胞类型、基因型和日期标记6孔板。</li>
	<li>将6孔板放入细胞培养箱中，于37℃、5% CO₂条件下培养细胞 37 °C 和5% CO2 24 小时。</li>
	<li>第二天，从培养箱中取出培养板，吸出孔中的细胞培养基并弃去，然后沿孔壁小心加入2.25 mL新鲜培养基以替换原有培养基。</li>
	<li>为了用siRNA转染成纤维细胞，按照制造商的建议使用基于脂质的转染试剂。</li>
	<li>每次转染时，标记两支微量离心管。在第一支管中加入 9 µL 转染试剂，并用 150 µL 低血清培养基。在第二个试管中，加入 1.5 µL siRNA（小干扰RNA）Cacnb3 siRNA-1 Cacnb3 siRNA-2 或乱序 siRNA 作为阴性对照）并用 150 µL 低血清培养基</li>
	<li>将稀释后的siRNA加入含有稀释转染试剂的离心管中，涡旋混匀2秒。室温孵育5分钟 21 °C.</li>
	<li>用以下之一标记孔板 Cacnb3 siRNA-1 Cacnb3 siRNA-2 或随机对照 siRNA。加入 250 µL 将siRNA-转染试剂混合物逐滴加入细胞中。</li>
	<li>将6孔培养板放回培养箱，并将细胞置于 37 °C 和5% CO2 72 小时。</li>
	<li>为了检测效率 Cacnb3 基因沉默，收集转染细胞，并按照先前所述方法进行免疫印迹分析4.</li>
</ol>
2. 体外伤口愈合实验（划痕迁移实验）
<ol>
	<li>从培养箱中取出细胞培养板，在显微镜下使用10倍物镜观察细胞。只有当细胞达到100%汇合度时，才开始划痕实验。 
	注意：为了保证实验的准确性和可重复性，细胞达到100%汇合度是进行划痕迁移实验的必要条件。因此，必须向各培养孔中接种相同数量的细胞，逐一检查各孔的汇合度，并在同一时间点（第0天汇合）进行划痕操作。细胞达到100%汇合度后若等待时间过长，可能引发不同的细胞反应。</li>
	<li>当细胞达到100%汇合度后，用移液器吸除培养孔中的培养基并弃去。</li>
	<li>使用200 µL枪头，在培养孔底部已标记的水平线垂直方向上，手动穿过孔中央的汇合单层细胞划出一道划痕。</li>
	<li>每孔用2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.5 mM KH2PO4，8.1 mM Na2HPO4，pH 7.4）清洗两次，以去除划痕区域脱落的细胞、松散细胞及碎片。添加PBS时应沿孔壁缓慢加入，避免冲击导致细胞从培养孔壁脱落。</li>
	<li>向每孔中轻轻加入2 mL含10%血清或1%血清的细胞培养基。 
	注意：建议在含10%血清和含1%血清两种条件下分别进行划痕实验，以确认观察到的效应是由细胞增殖与迁移共同引起，还是仅由细胞迁移所致。</li>
	<li>将培养板转移至显微镜载物台上，立即在划痕后（t=0 h）使用光学显微镜10倍放大倍数拍摄无细胞区域的明场图像（每孔两个区域）。为确保每次成像位置一致，请利用步骤（1.3）中预先标记的水平线，分别在线上方和下方各拍摄一张图像。将图像保存为TIFF或JPEG格式。</li>
	<li>由于显微镜载物台无法维持细胞生长条件，需将培养板放回细胞培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下继续培养细胞。</li>
	<li>在划痕后6、10和30小时，再次将培养板转移至显微镜载物台，按照步骤2.6所述方法采集图像。 
	注意：上述时间点是针对本实验描述的操作流程及原代成纤维细胞所确立的。在首次预实验中，曾测试多个时间点以观察成纤维细胞填补空隙的速度。尽管0、6、10和30小时是合理的起始时间点，研究者仍应根据具体应用和不同细胞类型优化并确定合适的时间点。如有条件，更精确的方法是采用活细胞延时成像显微技术。</li>
	<li>使用ImageJ13软件定量分析初始无细胞区域（定义为100%）以及划痕后6、10和30小时的剩余区域（图1）。迁移细胞所填补的划痕区域百分比以相对于初始划痕面积的比例进行计算。</li>
</ol>
3. 划痕区域的分析
<ol>
	<li>打开 ImageJ 软件13。</li>
	<li>通过将图像拖放到 ImageJ 菜单栏中，以 JPEG 格式上传第一幅图像（例如，1360x1024 的 24 位 RGB 图像）。</li>
	<li>选择 自由手选择 按钮，并标记无细胞区域。</li>
	<li>点击 分析，然后选择 测量。将弹出一个结果窗口，其中包含面积值。</li>
	<li>将该数值输入到分析电子表格中。</li>
	<li>对 0 h 时间点的每幅图像重复步骤 3.2–3.5，然后依次对后续时间点 6、10 和 30 h 重复相同操作。</li>
	<li>使用以下公式计算每个划痕在 6、10 和 30 h 后由迁移细胞重新占据的划痕区域百分比： 
	<img alt="细胞迁移分析的划痕实验公式；公式显示重新占据百分比，示意图。" src="/files/ftp_upload/59608/59608eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> 
	a = 初始划痕的无细胞区域，b = 6 h 后的无细胞区域</li>
	<li>计算 6 h 后迁移细胞重新占据划痕区域百分比的平均值及平均值的标准误差（S.E.M.）。以柱状图或散点图形式展示数据。</li>
</ol>
4. 体内皮肤伤口愈合实验
注意：本研究使用 C57BL/6 野生型雄性小鼠（8-12 周龄，体重 22-26 g）以及 Cavβ3 缺陷型小鼠作为对照。
<ol>
	<li>实验开始前一天，将用于皮肤窗室制备的所有手术器械、螺钉、螺母和钛框架进行高压灭菌。 
	注意：钛框架由两个对称互补的半部分组成，具有一个圆形观察窗，伤口将施加于此处，并通过显微镜进行观察（见图2a）。</li>
	<li>通过腹腔注射（i.p.）给予野生型或β3缺陷型小鼠（体重22–26 g）麻醉剂，剂量为每10 g体重0.1 mL生理盐水，其中包含氯胺酮（75 mg/kg体重）和赛拉嗪（25 mg/kg体重）的混合物。通过夹捏脚趾无反应来判断麻醉深度。 
	注意：该注射可提供约30分钟的外科麻醉时间，在手术过程中必须通过检查小鼠反射来持续监控麻醉深度。</li>
	<li>为防止眼睛干燥或受损，向双眼涂抹眼用软膏，并在必要时重复涂抹。</li>
	<li>使用电动剃毛器小心剃除小鼠背部毛发，随后在剃毛区域涂抹脱毛膏以去除残留毛发。注意避免损伤小鼠皮肤。脱毛膏保留约10分钟，以彻底清除所有毛发。</li>
	<li>取对称钛框架的一半，将连接螺钉与螺母固定在一侧，完成钛窗室的准备。这些螺母作为间隔物，使窗室两个对称部分之间保持400–500 µm的距离，以避免对皮肤血管造成压迫。</li>
	<li>从小鼠背部清除脱毛膏，并用温水（35–37 °C）清洗无毛区域。</li>
	<li>确保手术操作区域清洁、温暖（37 °C）且保持湿润。</li>
	<li>用皮肤消毒剂对小鼠无毛区域进行消毒。在光源前提起小鼠背部皮肤形成皮肤褶皱，确定钛窗室植入位置，使皮肤双层的中线位于该处。随后，在头侧和尾侧使用聚丙烯缝线固定皮肤褶皱，并将缝线另一端固定于金属支架上，以抬高折叠的皮肤。调整支架高度，使小鼠体位舒适。</li>
	<li>将钛窗室植入小鼠背部皮肤褶皱中，使折叠的背部皮肤层被夹在钛框架的两个对称半部分之间。使用聚丙烯缝线将钛框架的一半沿其上缘缝合固定于背部皮肤褶皱的背面。 
	注意：钛框架上缘有8个孔（图2a），应使用聚丙烯缝线将折叠的皮肤牢固地固定在这八个孔中的每一个上。</li>
	<li>在进入下一步之前，检查小鼠的反射，确保麻醉深度维持稳定。</li>
	<li>在皮肤褶皱基部，将连接在钛窗室第一半部分上的两个连接螺钉从后向前穿透皮肤褶皱。使用精细剪刀在皮肤上做小切口，以帮助螺钉顺利穿入。</li>
	<li>将小鼠从支架上取下，置于侧卧位。将钛窗室的第二个互补半部分覆盖在三个连接螺钉上（见图2a），用手轻轻按压，使螺钉穿过钛框架的第二半部分，然后用不锈钢螺母固定两个对称部分。</li>
	<li>此步骤中需特别注意螺钉的松紧度：若过松，可能导致结构松脱；若过紧，则会挤压皮肤褶皱，减少血流，可能导致组织损伤和坏死。 
	注意：步骤4.5中准备的螺母作为间隔物，用于保持钛窗室两个对称半部分之间400–500 µm的距离。螺母应拧紧至刚好感受到轻微阻力为止。</li>
	<li>使用钳子剪除螺钉的多余部分。 
	注意：此步骤中必须佩戴实验室防护眼镜，以防螺钉意外飞出造成眼部伤害。</li>
	<li>在皮肤窗室观察窗（见图2a）中心的皮肤上，使用标准活检打孔器（直径2 mm）标记伤口区域，以确保伤口大小具有可重复性。</li>
	<li>使用精细镊子和剪刀，在标记区域内去除包含表皮和真皮的完整皮肤，形成圆形伤口。最终伤口面积约为3.5–4.5 mm2，见图2b。用0.5 mL无菌生理盐水（0.9 % NaCl，37 °C）清洗伤口。</li>
	<li>用玻璃盖玻片覆盖伤口，并使用卡环钳将卡环固定在钛窗室上，以固定盖玻片。</li>
	<li>手术完成后，立即将小鼠置于配备相机的体视显微镜成像台上，在光照条件下拍摄图像（第0天），使用40倍放大倍数，并保存图像以供后续离线分析。 
	注意：研究人员应在图像采集后立即检查图像质量，确保其满足后续离线分析的要求。皮肤窗室的制备及皮肤伤口操作全过程约需30分钟。</li>
	<li>麻醉恢复期间，将小鼠置于温暖环境中至少2小时。之后将小鼠转移至单独的笼具中，送回动物房（12小时光照/12小时黑暗循环），并确保小鼠可自由获取食物和饮水。</li>
	<li>伤后第3天，将小鼠放入小鼠固定器中，并将固定器置于成像台上固定。</li>
	<li>将成像台置于配备相机的体视显微镜下，在光照条件下以40倍放大倍数拍摄图像，记录所有图片并保存以供后续离线分析。</li>
	<li>在伤后第6、10和14天重复步骤4.20和4.21。</li>
	<li>使用ImageJ13对伤口图像进行离线分析。将第0天的伤口面积设为100%，绘制随时间变化的伤口闭合率相对于初始伤口面积的曲线。代表性结果见图2c,d。</li>
	<li>使用以下公式计算每个时间点的伤口面积百分比（%）： 
	<img alt="伤口愈合公式：伤口面积百分比，数学表达式，科研分析。" src="/files/ftp_upload/59608/59608eq2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式2"> 
	x：时间点（第0、3、10或14天），a：第0天伤口面积，b：时间点x的伤口面积</li>
</ol>

<ol><li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li>
<li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li>
<li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li>
<li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca%282%2B%29+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li>
<li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li>
<li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+wounds+in+the+MRL%2FMPJ+mouse+heal+with+scar%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li>
<li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li>
<li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li>
<li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li>
<li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dorsal+skinfold+chamber%3A+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cell+and+Materials%22%5BJournal%5D)">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li>
<li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li>
<li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion%2C+Spreading%2C+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li>
<li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+migration+inhibitory+factor+%28MIF%29+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li>
<li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound-induced+Ca%282%2B%29+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li>
<li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825(2018).</li>
<li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts%2C+a+Smartphone%2C+and+Off-The-Shelf+Electronics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583(2016).</li>
<li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li>
<li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389(2013).</li>
<li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+starvation%3A+caveat+emptor%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physioliology%22%5BJournal%5D)">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li>
<li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li>
<li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li>
<li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+excisional+wound+model%3A+Contraction+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li>
<li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265(2013).</li>
<li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1%2FCdc42%2FPAK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，我们描述了一种体外和体内伤口愈合实验方法，并对所得结果进行了相关性分析。对于体外实验，我们使用了原代小鼠成纤维细胞4,14,15，这类细胞在伤口愈合和组织重塑过程中发挥着重要作用11。其他以单层形式生长的贴壁细胞类型（例如上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞）也可用于该实验。为了获得准确且可重复的结果，至关重要的是接种相同数量的活细胞且细胞状态健康，并在相同的汇合度下进行划痕操作。强烈建议进行生物学重复和技术重复。本方法中使用了6孔板，但当细胞数量有限时，也可使用12孔或24孔板。若涉及siRNA处理，则每次实验后必须进行免疫印迹分析，以确认目标蛋白被有效下调。在开始迁移实验前，应针对每种细胞类型测试并选择合适的转染试剂和转染时间窗口。以成纤维细胞和Cacnb3基因为例，通常需要3至4天才能达到理想的蛋白下调水平。相比之下，划痕迁移实验所需时间较短（6小时至24小时）。为避免划痕...

皮肤损伤后，皮肤伤口愈合立即启动，以恢复皮肤的完整性并保护机体免受感染。伤口愈合过程经历四个重叠的阶段：凝血、炎症、新生组织形成和组织重塑1。细胞迁移在这些阶段中至关重要。炎症细胞、免疫细胞、角质形成细胞、内皮细胞和成纤维细胞在不同时间点被激活并侵入伤口区域2。体外和体内研究伤口愈合的方法不仅对于理解其潜在机制具有重要意义，而且对于测试新药以及开发旨在改善和加速皮肤伤口愈合的新策略也备受关注。
为了监测和分析细胞迁移，可以使用划痕迁移实验。该实验常被称为体外伤口愈合实验。此方法需要具备细胞培养设施。3这是一种简单的实验方法，无需高端设备，大多数细胞生物学实验室均可开展。该实验通过机械划痕破坏融合的单层细胞（优选上皮样细胞、内皮样细胞或成纤维细胞），形成无细胞区域。划痕边缘的细胞会迁移以重新填充该空白区域。通过定量测定随时间推移无细胞区域的减少程度，可反映细胞的迁移速率，并指示细胞完全闭合划痕所需的时间。实验可采用野生型小鼠或缺乏特定目的基因的小鼠来源的原代分离细胞。4，或来自可靠细胞库的永生化细胞。划痕实验可用于研究药理学活性化合物，或转染的cDNA及siRNA对细胞迁移的影响。
在体内，伤口愈合是一个复杂的生理过程，需要多种细胞类型共同参与，包括角质形成细胞、炎性细胞、成纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞，以尽快恢复皮肤的物理完整性1。过去已开发并使用了多种研究体内伤口愈合的方法5,6,7,8。本文所述的背部皮肤褶夹层模型此前已被用于伤口愈合检测9，本研究采用的是适用于小鼠的改良型背部皮肤褶夹层制备方法。该改良型皮肤褶模型具有多项优势：1）可最大限度减少皮肤收缩，避免干扰对伤口愈合过程的观察，并可能影响小鼠的伤口修复；2）该夹层通过使用玻璃盖玻片覆盖伤口，减少组织感染和干燥，从而防止愈合过程延迟；3）可直接监测血流和血管生成情况；4）允许重复局部施用药理活性化合物和试剂，以治疗伤口并加速愈合过程9,10。
我们通过两种独立的实验方案——体外划痕迁移实验和体内背部皮肤折叠室模型，鉴定出高电压门控钙通道的β3亚基（Cavβ3）是影响皮肤伤口愈合的潜在靶分子。在体外实验中，我们使用了原代成纤维细胞，这些细胞表达编码Cavβ3蛋白的Cacnb3基因，但缺乏去极化诱导的Ca2+内流或电压依赖性Ca2+电流。我们描述了Cavβ3在这些成纤维细胞中的一种新功能：Cavβ3与肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3R）结合，并限制内质网中的钙释放。在小鼠中删除Cacnb3基因会导致IP3R对IP3的敏感性增加、细胞迁移能力增强以及皮肤伤口修复加快4。

<table><tbody><tr><td>0.9 % NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>活检打孔器</td><td>Kai Industries</td><td>48201</td><td>2 mm</td></tr><tr><td>Cacnb3 小鼠 siRNA 寡核苷酸双链（基因位点编号 12297）</td><td>Origene</td><td>SR415626</td><td></td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td></td><td></td><td>任意品牌的脱毛膏</td></tr><tr><td>5% 泛醇（BEPANTHEN）</td><td>拜耳</td><td>3400935940179.00</td><td>（BEPANTHEN）</td></tr><tr><td>盐酸二羟甲苯噻嗪（赛拉嗪）</td><td>Bayer Health Care</td><td></td><td>Rompun 2%</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco by life technologies</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco by life technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>六角全螺母</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>Zoetis</td><td></td><td>KETASET</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Keyence, 大阪, 日本</td><td>BZ-8000</td><td>可使用类似型号的显微镜</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>显微镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠固定器</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>普通剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>尼康</td><td>plan apo 10x/0.45</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 培养基</td><td>Gibco by life technologies</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯缝合线</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>螺丝刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>皮肤消毒剂（Octeniderm）</td><td>Sch&amp;uuml;lke &amp;amp; Mayr GmbH</td><td>118212</td><td></td></tr><tr><td>开槽盘头螺钉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>卡簧</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>卡簧钳</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带摄像头的手术显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica M651</td><td></td></tr><tr><td>皮肤窗植入用钛合金框架</td><td>IROLA</td><td>160001</td><td>Halteblech M</td></tr><tr><td>金属丝钳</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

体外与体内伤口愈合分析的划痕迁移实验与背侧皮肤折叠腔技术

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

皮肤伤口愈合受损是糖尿病患者和老年人面临的主要问题，亟需有效的治疗方法。为了发现可改善皮肤伤口愈合过程的新药物靶点分子，建立合适的体外和体内研究方法至关重要。我们通过两种独立的实验方法——体外划痕迁移实验和体内背部皮肤折叠室模型，鉴定出电压门控钙通道的β3亚基（Cavβ3）是一种潜在的调控伤口愈合的靶分子。实验中使用了从野生型（WT）小鼠和Cavβ3基因敲除小鼠（Cavβ3 KO）急性分离的原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），或从野生型小鼠急性分离并用siRNA处理以降低编码Cavβ3的Cacnb3基因表达的成纤维细胞。在融合的单层细胞上制造划痕，随后在设定的时间点拍摄显微图像，追踪迁移细胞重新填充划痕区域的过程，直至完全闭合。对这些图像进行分析，并计算每种条件下的细胞迁移速率。在体内实验中，我们在野生型和Cavβ3基因敲除小鼠身上植入背部皮肤折叠室，制造一个直径为2 mm的圆形伤口，用玻璃盖玻片覆盖伤口以防止感染和干燥，并随时间监测宏观的伤口闭合情况。结果显示，Cacnb3基因缺陷小鼠的伤口闭合速度显著更快。由于体内和体外实验结果高度一致，因此体外实验可用于在利用体内伤口愈合模型进行验证之前，进行高通量筛选。本研究中针对野生型和Cavβ3缺陷小鼠或细胞所展示的方法，也可能适用于除Cavβ3以外的其他特定分子的研究。

在野生型和β3缺陷型MEF的融合细胞单层上进行了划痕实验（图1c）。使用200 μL移液枪头制造“划痕”后，两种基因型的细胞均迁移到划痕区域并闭合间隙。分别在6、10和30小时后拍摄图像（图1a）。细胞迁移能力以划痕后6小时迁移细胞重新占据的划痕区域百分比（%）进行量化。与野生型小鼠MEF相比，Cavβ3缺陷型MEF显著更早地闭合了划痕区域（图1a,b）。为排除细胞增殖的影响，划痕迁移实验分别在含10%或1%胎牛血清（FCS）的条件下进行。在10% FCS条件下，细胞增殖和迁移两种过程均存在，而在1% FCS条件下细胞增殖被最小化。在10%（图1b，左）或1% FCS（图1b...

本文介绍了一种利用原代成纤维细胞进行体外划痕实验的方法，以及一种在小鼠中进行的体内皮肤伤口愈合实验方案。这两种实验均为评估体外和体内伤口愈合的简便方法。

糖尿病患者和老年人的皮肤伤口愈合障碍是一个重要问题，亟需一种有效的……

治疗皮肤伤口的迫切需求。为了确定药物治疗的靶向分子，需要体外和体内测试系统。合适的系统包括体外划痕实验和体内背部皮肤折叠室。这两种方法均可直接用于监测细胞迁移和皮肤伤口愈合，无论是否存在药理活性化合物。尽管这两种技术操作简便，研究人员仍应练习划痕操作、背侧皮肤折叠室的植入以及伤口制作，以获得可靠且可重复的结果。该操作流程将由来自临床与实验外科研究所的外科医生兼教授Matthias Laschke博士进行演示。在开始操作前，使用超细永久性记号笔为每种细胞类型标记一个六孔板，在每个孔的底部画一条水平线，以界定每种培养物的划痕区域。接下来，将从野生型和β3缺陷型小鼠中分离得到的原代成纤维细胞，以每孔5×10⁵个成纤维细胞的浓度接种于六孔板中。在含有10%胎牛血清的2 mL DMEM培养基中。用细胞类型、基因型和日期标记培养板，并将培养板放入细胞培养箱中孵育24小时。次日早晨，将9 µL 每种感兴趣的脂质转染试剂分别加入含有150 µL 低血清培养基的各个微量离心管中。将1.5 µL siRNA 加入另一组对应的微量离心管中，每管含有150 µL 低血清培养基，每种转染试剂对应一管。然后将每种siRNA溶液与一管转染试剂溶液混合。短暂涡旋振荡后，将混合物置于21摄氏度下孵育5分钟。孵育期间，沿孔壁小心地用2.25 mL新鲜培养基替换每孔中的上清液。孵育结束时，将250 µL相应的siRNA转染试剂混合物逐滴加入每孔细胞中，并将培养板放回细胞培养箱中继续培养72小时。当细胞达到100%汇合度时，弃去每孔中的培养上清液。使用200微升移液枪头，在融合的细胞单层中垂直于每个孔底部标记的水平线划痕。然后，用2 mL PBS轻轻冲洗每个划伤的孔，每次冲洗2 mL，共冲洗2次。为了去除受损细胞释放的因子、脱落的细胞或刮擦区域的碎片，需进行第二次洗涤。第二次洗涤后，向每个孔中加入 2 mL 新鲜细胞培养基，培养基中需添加 1% 或 10% 血清。随后在光学显微镜载物台上对每块培养板中的伤口区域进行成像。划痕后立即在10倍放大倍数下拍摄图像，然后将培养板放回细胞培养箱中。在接下来的30小时内，于适当的实验时间点持续采集图像。实验结束时，定量测定培养6、10和30小时后的初始无细胞区域及剩余区域面积。计算迁移细胞重新占据的划痕区域占初始划痕区域的百分比。在确认小鼠对足趾挤压无反应后，对野生型或β3敲除的C57黑六小鼠背部进行仔细剃毛。将药膏涂抹于动物的眼睛。涂抹脱毛膏以去除残留的毛发，10 分钟后将脱毛膏清除。准备钛金属腔室时，使用带螺母的连接螺钉固定对称钛金属腔室框架的一个部分，使腔室两个对称部分之间的距离保持在400至500微米之间，以避免皮肤中血管受到压迫。用70%乙醇消毒暴露的皮肤。在光源前方捏起一褶皮肤。将双层皮肤的中线对准钛质腔室将要植入的位置。用聚丙烯缝线将皮肤皱襞在头侧和尾侧固定。将缝线的另一端收紧在金属支架上，以提起折叠的皮肤。调整支架的高度，使小鼠能够舒适地坐立。使用聚丙烯缝线将钛制腔室的第一帧固定在其背侧皮肤褶皱后部的上缘。重新确认动物处于镇静状态后，用精细剪刀在皮肤上制作小切口，并将连接在钛制腔室前半部分的两根固定螺钉穿过皮肤褶皱基部。将小鼠从鼠架上取出，使动物呈侧卧位。将钛质腔室的第二个互补半部分放置在3个连接螺钉的上方，并手动施加轻微压力，使这些螺钉穿过钛框架的第二个半部分。折叠的皮肤层现在被夹在钛框的两个对称半部分之间。然后用不锈钢螺母固定这两个对称部分。使用标准的2 mL直径活检打孔器，在皮肤皱襞腔观察窗内的皮肤中央标记伤口区域。使用精细的镊子和剪刀去除标记范围内的全部表皮和真皮，以形成一个圆形伤口。用 0.5 mL 无菌生理盐水清洁 3.5 至 4.5 mm² 的伤口。用玻璃盖玻片覆盖伤口。使用钛质腔室的卡环钳固定盖玻片。立即将小鼠转移至体视显微镜的成像载台。然后以 40 倍放大倍数对伤口进行成像。在将小鼠放入笼中并监测直至完全恢复之前。在本代表性实验中，使用 200 微升移液器枪头划痕后，两种基因型的细胞均迁移至划痕区域并闭合了间隙。随后通过测量划痕后6小时迁移细胞重新占据的划痕区域百分比，来定量细胞迁移能力。例如，在本实验中，Cav beta 3 缺陷的成纤维细胞比野生型小鼠的成纤维细胞更早地闭合了划痕区域。为验证在Cav beta 3 缺陷成纤维细胞中观察到的Cav beta 3 依赖性效应，将野生型成纤维细胞转染siRNA以下调Cav beta 3 蛋白的表达。经Cav β3特异性siRNA处理的成纤维细胞表现与β3缺陷型成纤维细胞相似。为比较两种基因型之间的皮肤伤口愈合情况，于皮肤褶皱腔内造成伤口后立即拍摄伤口区域，并在随后的2周内对伤口进行成像观察。通过图像测量伤口大小，并将特定日期的伤口面积表示为初始伤口面积的百分比。与野生型对照组相比，Cav beta 3 缺陷型小鼠的伤口闭合速率有所增加，这符合预期。每次划痕时务必对移液器吸头施加相同的压力，并尽可能使划痕与培养板底部标记的线条对齐。在愈合过程中的任何时间，均可打开背侧皮肤折叠室的观察窗，以便局部施加不同的药理活性化合物。此外，还可以在愈合过程的不同阶段切除受损区域。用于分子蛋白生化或组织学分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

划痕迁移分析和背皮折叠室的体外和在Vivo分析伤口愈合

迁移能力是多种不同类型细胞的关键功能，包括间充质基质细胞（MSCs）。然而，量化损伤后迁移能力的变化具有挑战性。本方案描述了一种易于调整的迁移检测方法，该方法采用严格的统计学手段来量化损伤后MSC迁移能力的变化。...

优化划痕损伤实验以检测可溶性香烟烟雾提取物损伤后小鼠间充质基质细胞迁移能力的变化

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体外与体内伤口愈合分析的划痕迁移实验与背侧皮肤折叠腔技术

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