划痕迁移分析和背皮折叠室的体外和在Vivo分析伤口愈合

在这里，我们提出了使用原纤维细胞进行体外划痕测定和小鼠体内皮肤伤口愈合测定的协议。这两种检测都是评估体外和体内伤口愈合的直截了当的方法。

叛乱分子需要治疗皮肤伤口。为了识别药物治疗的目标分子，需要体外和体内测试系统。适当的系统是体外划痕测定，和体内后皮褶皱室。

两者都是直接程序，监测细胞迁移和皮肤伤口愈合，在没有和存在药理活性化合物。虽然这两种技术都是直截了当的，但调查人员应该练习划痕应用。并进行后体皮肤折叠室植入，并损伤获得可靠且可重复的结果。

手术的演示将由临床和实验外科研究所的外科医生和教授马蒂亚斯·拉施克博士完成。在开始该过程之前，使用超细永久标记来标记每个细胞类型一个六井板，每个井的底部有一条水平线来描绘每个培养物的划痕区域。下一盘原纤维爆炸从野生型和β3缺陷小鼠分离，在六井板中，每井浓度为5倍10至第五纤维爆炸。

在2mL的DMEM辅以10%的胎儿牛血清。用细胞类型、基因型和日期标记板。将盘子放在细胞培养箱中24小时。

第二天早上，将每根脂质的转染试剂加入9微升，加入每个管中含有150微升的微离心管，减少血清介质。将 1.5 微升 siRNA 添加到第二个微离心管中，每个转染试剂中每管含有 150 微升的减少血清介质。将每个 siRNA 溶液与单管转染试剂溶液混合。

短暂涡旋后，将混合物在21摄氏度下放置5分钟。在孵育过程中，请小心地更换每一个井中的超生。井边有2.25mL的新鲜培养介质。

在孵育结束时加入250微升的合适siRNA转染试剂混合物，将智慧滴入每个相应的细胞井中。将板返回细胞培养箱72小时。当细胞达到100%汇合时，丢弃每一个井的培养上能。

并使用 200 微升移液器尖端在汇合单元单层中产生划痕。垂直于每一个井底部的标记水平线。然后小心冲洗每个受伤的井2次，每次洗涤2mL的PPS。

从受损的细胞、松动的细胞或碎屑中去除任何释放的因素。第二次洗涤后，加入2mL的新鲜细胞培养培养，并辅以1%或10%的血清到每个井。并在光学显微镜的舞台上捕捉每个板的伤口图像。

刮到 10 倍放大倍率后立即。然后将板返回细胞培养箱。继续在未来 30 小时的适当实验时间点捕获图像。

在实验结束时，在6、10和30小时的培养后量化初始无细胞区域和剩余区域。确定迁移单元格相对于初始暂存区域重新填充的暂存区域的百分比。在确认对趾捏反应不足后，在野生型或贝塔三淘汰C57黑色六只鼠标后，小心剃光头。

在动物的眼睛上涂抹软膏。涂抹脱毛霜，消除任何剩余的头发。10分钟后取出奶油。

要准备钛合金腔室，请用螺母固定对称钛腔架的一部分。在腔室的两个对称部分之间保持 400 到 500 微米。避免皮肤中血囊的压缩。

用70%乙醇对裸露的皮肤进行消毒。在光源前抓住一叠皮肤。将双层皮肤的中间线放置到钛室的植入位置。

用聚丙烯缝合线将皮肤褶皱固定。拧紧金属架上缝合线的另一侧，以抬起折叠的皮肤。并调整机架的高度，让鼠标舒适地坐着。

用聚丙烯缝合钛室的第一帧，其优越的边缘，以背皮褶皱的背面。重新确认后，使用细剪刀在皮肤上做小切口。并通过皮肤褶皱的底座将连接到钛室前半部分的两个连接螺钉。

将鼠标从机架上取下，然后将动物放在横向位置。将钛合金室的后半部分放在 3 个连接螺钉的顶部。并手动施加轻微压力，通过这些螺钉穿过钛框架的后半部分。

折叠的皮肤层现在夹在钛框架的两个对称的两半之间。然后用不锈钢螺母固定两个对称部件。使用标准化的 2mL 直径活检冲孔，在皮肤折叠室的观察窗口内标记皮肤中心的伤口区域。

并使用精细钳子和剪刀去除标记内的整个表皮和真皮。创建圆形伤口。用 0.5mL 的消毒盐水清洁 3 个半到 4 米半的方形伤口。

用玻璃盖玻片盖住伤口使用钛室上的扣环钳将盖玻片固定到位。并立即将鼠标转移到立体显微镜的成像阶段。

然后以 40 倍的放大倍率对伤口进行成像。将鼠标放入带监控的保持架之前，直到完全恢复。如此证明，使用 200 微升移液器尖端创建划痕后，在此代表性实验中，来自两个基因型的细胞迁移到划痕区域并缩小了间隙。

然后，在执行划痕后 6 小时通过迁移单元格重新填充的填充单元格迁移的百分比将单元格迁移量。例如，在这个实验中迁移 Cav beta 3 缺陷纤维爆炸关闭的划痕区域明显早于野生型小鼠的纤维爆炸。为了确认在Cana beta 3缺陷纤维爆炸中观察到的Cana beta 3依赖效应，野生型纤维爆炸与siRNA一起转染，以调节Canaβ3蛋白。

使用 Cav beta 3 特定 siRNA 处理的光纤爆炸的行为类似于 beta 3 缺陷光纤爆炸。为了比较两种基因型之间的皮肤伤口愈合，皮肤折叠室的伤口区域在受伤后被直接拍摄。在接下来的两周里，伤口被成像了。

伤口的大小在图像和伤口区域上测量，在给定的一天，表示为初始伤口面积的百分比。正如预期的那样，与野生类型对控相比，Cav beta 3缺陷小鼠的伤口闭合率有所提高。确保对移液器尖端施加相等的压力，对每个划痕，并尽可能将划痕与板底上的标记线相匹配。

在愈合过程中，可以随时打开后体皮肤折叠室的观察窗口。允许不同药理活性化合物的局部应用。也可以在治疗过程的不同阶段切除受伤区域。

用于分子蛋白生化或组织学分析。