从妇科和乳腺癌肿瘤获得癌症干细胞球

该协议允许使用功能测定和表型表征，以稳健的方式识别和分离癌症干细胞。从肿瘤样本中分离癌症干细胞可以作为一个平台，指导特定疗法在单个肿瘤的临床应用，预测耐药性和随后的复发。为了准备非粘附悬浮培养物，首先将细胞培养容器涂上50微升，每毫升聚HEMA为15毫克，然后将容器放入37摄氏度的干燥炉中至少两天。

当容器完全干燥时，用 PBS 清洗 80% 至 90% 的汇合癌细胞系培养，然后用 1 到 2 毫升的三辛 EDTA 分离细胞。在37摄氏度下5分钟后，用2到4毫升的新鲜细胞培养所阻止反应，通过离心洗涤分离的细胞。将颗粒重新悬浮在新鲜培养基中进行计数，并在每培养皿浓度的500至2000个浓度下稀释含有2%甲基纤维素的新鲜球体中的细胞。

为了确保球体一元性，在无锚定环境中以低密度播种每个细胞系。然后将细胞播种到聚HEMA涂层板上，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育5天，每毫升表皮生长因子增加10毫微克，每毫升10毫微克的基本成纤维细胞生长因子每两天添加到细胞培养基。电镀后三到十二天，应通过光显微镜观察三维球形细胞菌落。

为了获得衍生的粘附群体，在原始癌细胞系的适当培养条件下，将球体转移到新的培养皿中。经过一到两天的培养，应观察到细胞单层生长在附着球体周围，其形态与细胞起源系相似。为了确定感兴趣的癌细胞系的球体形成能力，在完成球体形成协议后，通过离心收集球体。

以新鲜介质轻轻重新暂停球体颗粒，并使用血细胞计计算直径大于 40 微米的球体数量。然后计算获得的球体与最初镀的细胞数的百分比。要确定感兴趣的细胞系的自我更新能力，通过离心收集球体，并在 trypsin EDTA 中轻轻重新暂停球体颗粒，在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。

在孵育结束时，在管中加入酶和活化介质，并移液溶液获得单细胞悬浮液。使用血细胞计和 trypan 蓝色排除法，计算悬浮液中的可行细胞，并镀多HEMA涂层板中的细胞进行球体形成测定，正如刚刚演示的。八天后，使用血细胞计计算直径超过 40 微米的球体数，并计算获得的球体与最初镀光的细胞数的百分比比率。

要评估球体所占用的区域，请将培养皿放在装有图像采集模块的倒置显微镜的舞台上，然后选择 100X 到 400 倍的放大倍率。获取每个条件至少 10 个随机字段的图像，并使用适当的图像分析软件程序绘制球体周围感兴趣的区域。然后以像素为单位测量每个感兴趣区域的面积，并计算球体投影区域作为测量的像素的均值区域。

造球干细胞的球体形成能力、自我更新和投影区域的功能特征允许比较其远距离血统和起源组织。球体形成协议允许球状菌落从几个子宫内膜和乳腺癌细胞系的悬浮液中获取，或在从人类肿瘤样本中温和地酶消化组织后获得球状菌落。子宫内膜和乳腺癌球体在电镀后一到两天产生与细胞起源系相似的细胞单层。

在这些具有代表性的实验中，激素受体阳性乳腺癌MCF-7细胞表现出比三阴性HCC1806乳腺癌细胞更高的球体形成能力、自我更新能力和投影面积。除了通过球体形成协议富集癌症干细胞外，我们建议使用流细胞学等补充方法进一步评估其干细胞的茎。在这项从子宫内膜细胞系获得的球体的代表性分析中，通过流式细胞学，在每个细胞系中确定了四个表达癌症干细胞标记的细胞群。

通过其他分子生物学技术对肿瘤球体的评价可以证实干细胞的干细胞的可塑性和可塑性，并促进靶向疗法的发展。温和的球体收获后，西方的印迹分析也揭示了一个癌症干细胞表型的体外生成的球体。这种分离协议有助于我们理解癌症干细胞的意义，临床上转化为理解复发、转移和治疗阻力。