从胚胎小鼠小脑分离的神经元的主要培养

进行体外实验以尽可能充分地反映体内状况并非易事。使用原发细胞培养物是了解整个生物体中细胞生物学的重要一步。提供的协议概述了如何成功生长和培养胚胎小鼠小脑神经元。

原发性神经元细胞培养是研究体外培养分离神经元的理想模型系统。使用此方法的优点是能够保持分离细胞的细胞特征，如机理、功能和体外形态条件，尽可能接近体内条件几个星期。将圆形盖板放在生物安全柜下的 24 井板中。

在每个盖滑上添加 90 微升聚 L- 奥尼辛。关闭盖子，轻轻地将盘子放在37度培养箱中两天。准备培养介质和播种介质，并保持在四摄氏度。

在 DMEM/F12 中准备工作尝试素溶液，并保持在四度。将培养培养培养物和播种培养在37度的培养箱中。把 24 井板从培养箱中取出。

用双蒸馏水清洗盖滑三次。将盖滑至少保持两个小时，以完全干燥。准备三个装满冷 PBS 的培养皿、三个装满冷 HBSS 的培养皿和五个装满冰冷解剖介质的培养皿。

切除子宫角，在冰面上用冷PBS清洗三次。从这里，所有步骤应在冰上进行，以尽量减少组织损伤。在最后的洗涤步骤后，将幼崽与HSS中的子宫分离，并转移到冷解剖介质中。

在解剖介质中，用剪刀斩首幼崽。打开从前空大号到轨道腔的劣等边界的卡路里。使用一对细钳，取出头骨底座，将头骨从大脑上剥开。

小心地从中小脑和庞的横向表面开始切除小脑的脑膜。切开两个小脑，把小脑和大脑的其他部分分开。立即将收集的脑管放在充满DMEM/F12的无菌15mL锥形管中。

在 DMEM/F12 中，以 4 度 1000 g 将管以 1，000 g 离心一分钟。重复三次，每次用移液器轻轻去除上流液，并在新鲜的 DMEM/F12 中重新悬浮颗粒。加入两毫升预热的三辛和轻轻地移液器混合在一起。

将管子放在37度水浴中12分钟。孵育后，将管子带到安全柜，并加入10mMEM/F12，使试管灭活。将混合物在1，200克中离心5分钟。

丢弃上经，再用新鲜介质重新暂停，然后离心三次。使用 DMEM/F2 预湿无菌塑料移液器。在同一管中加入3.5毫升的DNAse工作溶液。

用移液器多次缝合组织，直到液体达到均匀的乳色。将 10 mL 的冷 DMEM/F12 添加到混合物中，然后进入离心机。将样品在4度时以1200克离心5分钟。

小心地取出上一液，而不干扰颗粒。从培养箱中取出播种介质。加入500微升预预热播种介质，并使用移液器混合。

使用血细胞计计算细胞。用播种介质稀释细胞悬浮液，使每毫升50万细胞的密度。将混合物的90微升添加到盖玻片中心的每一个井中。

将板放在37度的培养箱中，三到四个小时。孵育后，每井中加入500微升预谋培养的培养。将板以 37 度更换到培养箱中。

七天后，用新鲜培养基二、准备一个单独的24井板，并为每个井添加100微升PFA4%。在培养中达到所需天数后，轻轻从原始培养板的井中取下盖滑，并将其放入上一步中描述的 PFA 板的相应孔中。将 PFA 添加到孔中，以完全浸入盖滑。

将 PFA 板保持 4 度 30 至 120 分钟。孵育后，将板恢复到室温。用 PBS 轻轻清洗盖滑五分钟三次。

文本中的图 2 显示了从 E18 开始的小脑细胞培养。卡宾丁的免疫荧光显示Purkinje神经元与气突扩展三天体外。在体外7至10天，树突过程是显而易见的。

在21天，复杂的树突分支存在。文本中的图三显示了从各种胚胎期开始的小脑细胞培养。卡宾丁的免疫荧光检测显示Purkinje神经元在体外18天后才具有早期轴突。

Purkinje 神经元培养从 E14 和 E15 开始，将发展树突，但从未像 E18 成为起点时那样复杂。文本中的图四显示，在体外 21 天后，从 E18 培养物中发展出不同的细胞类型。卡尔宾丁绿色免疫荧光显示Purkinje神经元。

B 和 C 中帕伐布明的红色免疫荧光显示抑制性内性。E和F中钠电压门通道的红色免疫荧光显示颗粒神经元。本协议具有成本效益，易于执行。

在视频的末尾，您将能够收集和培养小脑神经元，并在所需的DIV上修复它们。