生产用于单分子观察的DNA折纸纳米结构的Dynein和Kinesin电机组合

我们的协议旨在探索生物物理机制，这些生物物理机制由相同或相反方向的细胞骨骼运动蛋白团队运输货物。通过使用DNA折纸进行分子构造，该方法可以选择精确定义的货物形状上的电机类型、数量和位置。虽然该协议侧重于基于微管的电机二宁和激宁，但它可适应基于行为素的电机明辛，以及其他协同作用的蛋白质系统。

该协议的一个具有挑战性的方面是在整个纯化过程中保持运动蛋白的完整性和活性，因为它们对热和机械力很敏感。为了通过乳糖促进剂诱导运动蛋白的生长和表达，使用无菌接种棒将感兴趣的冷冻酵母菌株条纹在酵母-肽-葡萄糖培养盘上，在30摄氏度下进行为期三到四天的孵化。在培养的第四天，当600纳米的光学密度在1.5至2之间时，通过离心收集酵母细胞，然后在水中重新暂停颗粒，清洗它们，将细胞整合到一个瓶子中。

再次旋转细胞进行收集，将颗粒重新在两毫升的双蒸馏水中重新浇水。然后使用10毫升移液器缓慢地将细胞浆分入液氮中，一次一滴产生冷冻酵母细胞颗粒。对于运动蛋白纯化，使用用液氮预冷却的刀片式咖啡研磨机将冷冻酵母颗粒研磨成细粉，然后将酵母粉转移到冰面上预冷藏的100毫升玻璃烧杯中。

在粉末中加入少量新鲜准备的4X解液缓冲液，使缓冲液的最终浓度不超过1倍，并将烧杯放在37摄氏度的水浴中，用铲子连续搅拌，快速解冻粉末。添加额外的4X缓冲液与补充剂，使最终缓冲液浓度在落酸1X。最终体积通常介于 25 到 30 毫升之间。

然后通过离心收集酵母细胞，将含有上经剂的可溶性蛋白质转移到冰上一个新的50毫升锥形管中。对于IgG亲和纯，在蛋白质提取物中加入200微升洗涤亲和力珠悬浮液，并在4摄氏度下用温和旋转孵育混合物一小时。在孵育结束时，通过相同的色谱柱过滤混合物，用于在摄氏四度时准备珠子，然后两次洗涤，每次在冰上洗涤5毫升洗涤缓冲液。

第二次洗涤后，用五毫升的 TEV 缓冲液冲洗冰上的珠子，使缓冲液从柱中完全排出。对于DNA寡核苷酸标签，盖上色谱柱，用100微升TEV缓冲液孵育运动珠，并在室温下补充10至20微摩尔的纯化苯基瓜宁寡胶10至15分钟，每分钟轻轻重新填充珠子一次。在孵化结束时，每次洗涤用新鲜 TEV 缓冲液洗四次，然后重新填充管底，使电机珠在不超过 200 微升的新鲜 TEV 缓冲液中重新填充。

对于 TEV 裂解，将电机珠悬浮液转移到两毫升、圆底、微离心管中，并在 16 摄氏度下将电机珠悬浮在 16 摄氏度的微升中，用大约 0.3 单位的 TEV 蛋白酶孵育电机珠，然后温和旋转一小时。在孵化结束时，将电机珠离心，并收集管底的混合物。接下来，使用切割 P1000 移液器尖端将混合物转移到旋转柱上，然后像刚才演示的一样使混合物离心。

收集含有 TEV 切割、纯化电机的滤物，并在 50 微升体积中收集滤物，用于微管亲和力纯化。然后闪冻结液氮中的等分，储存零下80摄氏度。对于底盘纯化，在净化前的下午晚些时候，轻轻将80微升的甘油浓度层在离心管中的折纸折叠缓冲液中。

图层之间的边界应稍微可见。在四摄氏度下过夜孵育后，在折纸折叠缓冲液中，在梯度的顶层上加入10%甘油，然后将梯度与底盘离心。在离心结束时，从上到下方向收集梯度的50微升分数，将每个分数的5微升加载到2%的加糖凝胶的单个孔中。

在 70 伏特下 90 到 120 分钟后，使用适合使用 DNA 凝胶染色的条件对凝胶进行图像成像。可以使用适当的标准光谱方法确定所选兴趣分数的量化浓度。SDS-PAGE 分析可用于确认从酵母中成功提取的二宁，因为最终滤金显示在大约 350 千度吨时有一个清晰、锋利的带子。

TEV蛋白酶也存在于最后的过滤中，并在大约50千吨时形成一个清晰的带。微管亲和力纯化后，在350千达吨时，二丁作为一个清晰的单波段出现，而基尼辛可以观察到轻微涂抹，多个波段在约120千达吨。除了 TEV 蛋白酶外，在最终上一代中还可以观察到明显数量的多布林。

DNA折纸结构的折叠可以通过阿加罗斯凝胶电泳进行测定，在纯展开的脚手架链和表示折纸折叠的折叠反应之间移动性发生变化。此外，折叠反应表示存在一些机箱结构的多乘。电机机箱合奏的动能在 TIRF 电影生成的 kymograph 上很容易检测和可测量，因为柔性机箱与七种二宁蛋白结合的 kymograph 以相对一致的速度表现出高度过程性运行。

在程序的每个步骤中，仔细控制运动蛋白的温度至关重要。在纯化运动蛋白和DNA折纸底盘后，这两个组分可以在TIRF显微镜下进行合奏的动能测定。这种方法能够破译控制运动体应急运动的生物物理和生化机制。