利用流细胞测定人类白细胞测定阿斯珀吉鲁斯紫锥体烟曲的噬菌体

该协议意义重大，因为它定量测量人类白细胞标记的阿斯佩吉卢斯熏蒸器康尼迪亚的噬菌体，以及康尼迪亚与细胞的附着，以及流式细胞学缺乏相互作用。这种方法的主要优点是，它便于快速分析大量的细胞。此外，细胞标记的标签允许在同一样本中分离对嗜中性粒细胞和单核细胞的评估。

在任何这种技术可用于分析其他临床相关的真菌，如木瓜。相反，红血球可能被用作噬菌体。要开始此过程，请用消毒剂将纸巾弄湿，然后放入生物安全柜中。

将一盘生长的 Aspergillus fumigatus 放在纸巾上，以防止挥发性 Conidia 过度分布。在真菌上加入含有0.01%洗涤剂的10毫升PBS，并使用Drigalski铲将液体铺在盘子上，擦掉深色的康迪迪亚。通过 30 微米过滤器将 Conidia 悬浮液转移到 50 毫升，这将去除任何残留的 mycelia。

再加入10毫升的PBS，用洗涤剂加入板中，用铲子铺开，然后通过过滤器将其转移到同一管中。接下来，准备0.1摩尔碳酸钠的无菌溶液，溶解在PBS中。并在此碳酸钠溶液中准备0.1毫摩尔菲特粉末溶液。

在此 FITC 溶液的 5 毫升中，在 15 毫升管中重新悬浮 1 亿或更少的 Conidia。在37摄氏度的旋转器中孵育20分钟。要膨胀到康迪迪亚，重新暂停在五毫升的 RPMI 介质中标记的 FITC 标记的 Conidia，并辅以 10%FCS。

并在37摄氏度的旋转器中孵育所需的时间。在生物安全柜中，将五毫升的布菲大衣放入50毫升的管子中。用EL缓冲液填充管子，并反转三次。

水平孵育五至八分钟，直到混合物的乳白色外观变清。然后，在300倍G下离心，在室温下10分钟。丢弃上流液，通过移液将颗粒重新在一毫升 EL 缓冲液中。

再加入24毫升EL缓冲液，并多次反转管子。在300倍G下离心，在室温下离心5分钟。丢弃上一提液，将细胞重新在一毫升的RPMI介质中，辅以10%FCS。

首先，将200万白细胞和400万个标有 FITC 的 Conidia 在 1.5 毫升的 RPMI 中，辅以 10%FCS，转移到 12 孔培养板。包括仅对没有 Conidia 的单元格进行控制，以及对未标记的 Conidia 的细胞的控制。在加湿的二氧化碳培养箱中孵育板，温度为37摄氏度，达到所需时间。

当孵育完成时，使用细胞刮刀收集细胞，并将它们转移到15毫升管。首先，将每个样品的 100 微升和控制装置放入 96 井 V 底板的一个井中。加入 150 微升 PBS，含有 2 毫摩尔 EDTA 洗涤。

对于颜色补偿，将一百万个无 Conidia 的细胞放在板的其他孔中。包括一个将不受约束的细胞井。在每个井中加入 150 微升 PBS，其中含有 2 毫摩尔的 EDTA。

接下来，用粘合箔盖住板，在300倍G和室温下离心5分钟。然后，取出铝箔，快速、有力地将盘子倒置一次，或在水槽或一次性纸巾上丢弃上一遍。将细胞重新在100微升抗体混合物中，通过移液混合良好。

对于颜色补偿，在含有两毫升EDTA的100微升PBS中重新填充各自的细胞，并在每个井中加入一种抗体类型，其量与抗体混合物中使用的相同。用胶箔盖住，在黑暗中室温下孵育20分钟。之后，取出铝箔，将含有两毫升EDTA的150微升PBS加入每井进行清洗。

再次用粘合箔盖住板。在300倍G下离心，在室温下离心5分钟。然后取出铝箔，快速、有力地将盘子倒置在水槽或一次性纸巾上，然后丢弃上一杯。

将含有2毫摩尔EDTA的200微升PBS中的细胞重新悬浮，将细胞悬浮液从每一个井转移到一个单独的圆形底部管中。启动流动细胞仪，让它预热。在采集软件中，创建新的实验，并设置新样本并标记新样本。

设置适当的荧光团的参数和探测器，如文本协议中所述。在此软件中，显示文本协议中概述的适当点图。只使用细胞样本，获取一些细胞，并在白细胞周围设置门。

基于白细胞门，CD45正细胞的门，从SSCCD45图中与康尼迪亚分离。在点图中，CD14、CD66b、门中性粒细胞和单核细胞分别。在此之后，从仅细胞样本更改为未标记的 Conidia。

在点图中，反 FITC、APC FITC 在用于反 FITC 的设置象限中显示嗜中性粒细胞，以及 FITC 信号。打开统计视图并调整象限，允许象限 Q1、Q2 和 Q4 中最多 1% 的单元格。对单核门重复此过程。在白细胞门中，记录所有至少有2万个事件的样品。

从统计学中可以读取由人类嗜中性粒细胞标记的 FITC 标记的 Conidia 的噬菌体。本研究中，采用快速流动细胞测量方法测量阿斯佩吉卢斯熏蒸器与大量原生人类白细胞的相互作用。使用适当的抗体和此处显示的浇注策略，FSC 和 SSC 特征对人白细胞进行一般浇注，随后由泛白细胞标记 CD45 分离自由 Conidia 中的白细胞。

Conidia可以在流式细胞测量时达到几乎细胞大小，特别是在使用肿胀的康迪迪亚时，或长时间的孵育时间，因此可以买我们分析。由于人类原发性单核细胞和中性粒细胞对 Conidia 的影响不同，因此该协议允许基于与成熟的细胞系标记进行染色、单核细胞的 CD14 和用于嗜中性粒细胞的 CD66b 来单独分析这些细胞群体。人类原发性噬细胞内化的柯尼迪亚的百分比在献血者中变化很大，但也取决于实验因素，如孵化时间和康尼迪亚的膨胀状态。

孢子内化可以在0.5小时的共育后检测到，并随着时间的推移而增加。即使潜伏时间很短，预膨胀的康尼迪亚也比休息孢子更容易。如果康尼迪亚用甲醛固定，与本地康迪迪亚相比，噬菌体病会减少。

按照这个程序，伊丽莎可以收集和分析共同孵化免疫细胞和康尼迪亚的超级细胞，以检查相互作用是否引起免疫细胞释放细胞因子。请记住，人类血液可能传播传染病。这项工作需要接种乙型肝炎疫苗，使用生物安全柜，以及戴手套在实验室外套。