细胞毒性细胞因子诱导的杀伤性T细胞的分离和扩张，用于癌症治疗

我们优化了一种高素质和临床适用的方法，用于扩大PBMC衍生细胞因子诱导的杀手T细胞，并评估其细胞毒性对癌症。该技术的优点是为技术人员和临床医生提供一个标准的操作程序，以量化细胞因子诱导的杀手细胞在科学研究和临床评估中的效力。从文本协议中描述的 CIK 细胞制备开始此过程，然后用 10 毫升无菌 PBS 清洗 CIK 细胞。

在300倍G和18至20摄氏度下离心10分钟。吸升液，用五毫升PBS重新暂停细胞。使用 trypan 蓝色排除测定计算细胞数并测试细胞生存能力。

将 CIK 细胞分成六个灭菌 1.5 毫升管，密度约为每毫升 PBS 5 到 100 万个细胞。标记和对待文本协议中详细显示的单元格。用一毫升消毒移液器轻轻上下移液三次，轻轻地将 CIK 细胞与抗体混合。

在黑暗中的室温下孵育细胞15分钟。在300倍G和18至20摄氏度下离心管10分钟。离心后，吸出上经剂，然后用一毫升PBS重新暂停细胞颗粒，然后用一毫升无菌移液器轻轻移液细胞上下至少三次。

将细胞悬浮液转移到无菌的五毫升聚苯乙烯圆形底部管中，用细胞过滤器盖轻轻移液通过盖，然后将管放在旋转木马上。打开流式细胞仪分析软件并创建一个实验文件夹，然后单击新的试样按钮，向实验中添加试样和管。按文本协议中列出的管道命名。

要为 CIK 细胞群创建散射门控系统，请先选择管一，然后单击点图按钮以创建 FSCA SSCA 图。在 FSCA 阈值大于 5000 的整个细胞群体上绘制矩形门，以排除细胞碎片。选择新点图的 FSCA FSCH 参数，并在所有单个单元格周围绘制多边形门。

选择计数与 FITC 结合 CD3 和计数与 APC 结合 CD56 参数的新直方图图。选择用于新点图的 FITC 结合 CD3 与 APC 结合 CD56 参数，并绘制四个象限门来定义四个子组。记录每个标本中2万个单细胞的数据。

单击加载示例按钮，首先分析空白控件示例。使用 CD56 和 CD3 通道参数确定整个 CIK 信元组。打开包含单个样本统计值的文件，分析 CIK 细胞量，然后重新打印到分析文件中。

为了进行细胞毒性测定，共培养CIK和人类慢性骨髓性白血病K562细胞，将一毫升K562细胞加入六井板中，每毫升密度为500万细胞，然后将一毫升具有或没有CIK细胞的基底培养基加入文本协议中列出的六井板。通过轻轻上下移液至少三次，混合细胞悬浮液。将盘子放在培养箱中 24 小时。

现在，通过添加一毫升基础培养基基，有或没有CIK细胞到六井板，如文本协议中列出的联合培养CIK和卵巢OC-3细胞。通过轻轻上下移液至少三次，混合细胞悬浮液。将盘子放入孵化器 24 小时。

孵育后，将 CIK K562 细胞悬浮液直接收获到 15 毫升无菌管中。要从 CIK OC-3 组收获悬浮细胞和粘附细胞，请先将细胞悬浮液转移到 15 毫升无菌管中。用一毫升的杀菌PBS洗井，收集PBS，并加入管中，然后加入5毫升的细胞分离酶溶液，在37摄氏度下孵育5分钟。

将溶液的一毫升从同一管添加到相应的井中，然后用一毫升无菌移液器上下移液，轻轻混合细胞。收集同一管中的所有细胞。在300次G下离心10分钟。

吸升液，将细胞重新在一毫升无菌PBS中。在300次G下将细胞培养10分钟，然后吸进上那常物，并在100微升无菌PBS中重新产生细胞。在细胞悬浮液中加入5微升的7-AAD染料。

用一毫升无菌移液器上下移液至少三次，轻轻混合细胞。孵育10分钟，在分析前在黑暗中离开。要执行细胞解能力测定，混合细胞悬浮液，并重复流式细胞仪的准备。

单击新的试样按钮，向实验中添加试样和管。按文本协议中列出的管道命名。要为细胞解分析创建散射门控系统，请先选择管一，然后单击点图按钮以创建 FSCA SSCA 图。

在 FSCA 阈值大于 50，000 的所有事件上绘制一个矩形门，以排除细胞碎片。选择新点图的 SSCA CFSE 参数，然后为新点图选择 7-AAD CFSE 参数，并绘制四个象限门来定义四个子填充。单击加载示例按钮，首先分析空白控件示例。

调整 SSCA 和 FSCA 的电压。使用 CFSE 和 7-AAD 通道参数识别死细胞组。记录每个样本中超过 20，000 个 CFSE 阳性细胞的数据。

打开包含每个样本的统计值的文件，分析不可行的细胞群，并将数据导出到分析文件中。通过三个个体的CIK比例统计分析，显示了用于分析健康捐献者CD-3阳性CD56阳性T细胞亚细胞的浇注策略的代表性结果。CD-3阳性CD56阳性细胞比例在扩张14天后显著增加。

这一点通过原始PBMC的65%明显，这增加到27.4%的CIK细胞收获的第14天。在这个培养系统中，与原始数量的PBMC相比，CIK细胞产生大约半百倍的变化。 K562细胞被染色为非荧光染料CFSE，这种染料由细胞内在可行细胞内切割，成为一种高度荧光染料。

说明了 CIK 和 CFSE 阳性细胞的大小和粒度。CFSE染色K562细胞与CIK细胞以0比1、5比1和10比1的比例进行共治疗。这些细胞被染色7-AAD染料作为死细胞排除的生存能力探针。

对CFSE阳性K562细胞的7-AAD阳性细胞进行了全部评估。CFSE染色的OC-3细胞与CIK细胞以10比1的比例进行共治疗。在24小时的孵育后，在这里证明了CIK对OC-3细胞的明显细胞毒性。

据报道，CIK T细胞对癌细胞产生显著的细胞毒性作用，减少手术、放疗和化疗在癌症治疗中的不利影响。免疫疗法是许多癌症的一种有希望的治疗方法。CIK可以通过在GMP级条件下孵化患者衍生的PMBC，在体外有效扩展，以进一步进行自体输注。

按照此协议，我们可以在GTP或GMP级设施中执行免疫细胞治疗，以进一步临床癌症治疗。