胃肠癌DNA甲基化基因组全谱分析
2020年9月18日
在这里，我们描述了胃肠道癌症DNA甲基化全基因组分析的程序。该程序与研究基因甲基化模式与导致胃肠癌致癌因素之间的关系的研究有关。
因此，利用LA平台对人类基因组中DNA甲基化的复杂畸变进行DNA甲基化全基因组分析，可以提供胃肠道癌表观遗传生物标志物的重要信息。虽然这个LA平台用于人类基因组中DNA甲基化的复杂畸变，但它在成本和基因组覆盖率方面是最佳的。因此，演示这个程序将是Hirotaka莫莫斯，一个研究生从我的实验室。
首先，准备10微米未污染的固定石蜡嵌入部分。将幻灯片放在玻璃滑梯架中，并加满盐水，确保幻灯片上的所有组织都被淹没。将幻灯片留在二甲苯中 15 分钟，然后倒出二甲苯，同时用移液器尖端握住幻灯片，这样它们不会脱落。
将更多的二甲苯倒入与之前相同的水平，并重复孵育。倒出二甲苯，用100%乙醇填充滑轨架，确保滑梯上的所有组织全部浸没。将幻灯片留在乙醇中三分钟，然后用新鲜乙醇代替乙醇，并允许它们再孵育两分钟。
倒掉乙醇并取出幻灯片。小心地把它们放在干净的纸巾上，让它们干燥10分钟。用 80 微升的解液缓冲液填充 1.5 毫升一用聚丙烯管，并在缓冲液中放入干净的移液器尖端。
根据适当的H&E染色部分确定肿瘤区域最适合大切除的肿瘤组织的癌症组织，然后根据标记部分对癌症组织进行宏观切除。拿一把干净的剃刀刀片，轻轻地刮掉幻灯片的癌组织，试图把它留在一块。使用移液器尖端将刮伤的组织转移到解液缓冲瓶中。
对幻灯片的其余部分重复此过程。所有组织都在管中后，使用尖端确保组织完全被淹没，并且不会粘在墙壁上。将20微升的亚蒂林相关丝氨酸蛋白酶添加到小瓶中，轻轻轻拂混合。
将小瓶放在55摄氏度的加热块中至少4小时或过夜，确保两小时后稍微涡流。根据制造商的说明，使用双硫化转化套件对消化组织的 45 微升进行双硫化处理。在样品中加入5微升稀释缓冲液，在37摄氏度下孵育15分钟。
同时，在一管CT转化试剂中加入750微升蒸馏水和210微升稀释缓冲液，准备双硫基转化试剂。通过涡旋混合管10分钟，然后将100微升的制备CT转换试剂添加到每个样品中，然后通过反转混合。在黑暗中在50摄氏度下孵育样品12至16小时。
孵育后，将样品放在冰上10分钟。添加 400 微升的绑定缓冲液，通过上下移液混合每个样品。将每个样品加载到旋转柱中，然后将柱放入两毫升收集管中。
全速离心样品一分钟，然后丢弃流经。将 200 微升的洗涤缓冲液添加到每列中，以全速旋转一分钟，然后丢弃流式处理。在每个列中添加 200 微升脱硫缓冲液，使柱在室温下站立 15 分钟。
孵育后，全速旋转柱一分钟，然后丢弃流经。每次洗涤后，用 200 微升的洗涤缓冲液以全速将柱进行两次清洗。在每个柱子中加入46微升蒸馏水，并将其放在新的无菌1.5毫升一用聚丙烯管中。
旋转管两分钟以脱氧核糖核酸并丢弃柱。DNA现在已准备好进行分析。使用双硫化改性DNA作为定量甲基化特异性PCR的模板，在每个基因分析中评估启动子区域的甲基化。
将文本手稿中描述的试剂组合在一起，并使用 96 井实时 PCR 仪器运行热循环协议。培训组48名胃癌患者的特点如下。患者的平均年龄为74岁，其中男性38岁，女性10岁。
首先，所有48个样本都加载，用于识别异常值。两个样本给出的峰值大于两个标准偏差，这些偏差从其他样本中移出，这些样本被移除。由此产生的热图被分成两组，基于高甲基化和低甲基化。
此热图允许在差分甲基化分析中转录启动位点 1，500 个基对内对前 50 个探头进行可视化。当临床病理因子在多变量分析中用作协变量时，癌症的类型和淋巴结转移的存在成为重要的独立预测因素。最后，发现EPB41L3基因与在微阵列分析中将训练组编成高低甲基化组有强烈关系。
对试验组EPB41L3的微阵列分析结果进行了定量甲基化特异性PCR的验证。在单变量分析中，PGC组织中EPB41L3的RMV明显高于残余胃癌。同样，淋巴结转移样本中的RGV明显高于无淋巴结转移的样本。
因此，根据适当的H&E染色部分，对最适合大手术的癌症组织进行鉴定，才能成功执行此方案。
概述
本文描述了一种用于胃肠癌症DNA甲基化全基因组分析的程序，重点关注甲基化模式与致癌过程之间的关系。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因组学
- 表观遗传学
- 癌症研究
背景
- DNA甲基化是一种参与基因调控的关键表观遗传修饰。
- 了解甲基化模式可以提供对癌症发展的洞察。
- 本研究利用了一种用于分析复杂DNA甲基化异常的经济高效的平台。
- 由于其普遍性和影响，胃肠癌是一个重要的研究领域。
研究目的
- 建立一种可靠的方法来分析癌症组织中的DNA甲基化。
- 识别与胃肠癌相关的表观遗传生物标志物。
- 将甲基化模式与癌症患者的临床结果相关联。
使用的方法
- 福尔马林固定石蜡包埋组织切片的制备。
- 癌症组织的宏观解剖以提取DNA。
- DNA的亚硫酸氢盐处理以进行甲基化分析。
- 定量甲基化特异性PCR评估基因启动子甲基化。
主要结果
- 识别癌症样本间甲基化模式的显著差异。
- EPB41L3基因在胃癌中显示出与甲基化状态的强关联。
- 淋巴结转移等临床因素可以预测甲基化模式。
- 结果通过独立队列中的定量PCR得到验证。
结论
- 建立的协议有效地识别了胃肠癌中的甲基化变化。
- 研究结果有助于理解表观遗传学在癌症生物学中的作用。
- 基于甲基化谱的靶向治疗开发的潜力。
常见问题
Executive Industry Relevance
Genome-wide DNA methylation analysis enables biomarker discovery in gastrointestinal cancers by identifying epigenetically altered genes linked to disease progression. This approach supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by correlating methylation patterns with clinical phenotypes such as lymph node metastasis. The method provides quantitative, reproducible epigenetic data that can inform biomarker-led screening and preclinical validation strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates epigenetic dysregulation to prioritize genes like EPB41L3 with strong association to methylation-defined cancer subtypes.
- Operational Value: Enables functional target validation through methylation-specific PCR confirmation in independent cohorts.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking methylation biomarkers to clinical outcomes such as metastasis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, bisulfite-converted DNA templates suitable for high-throughput methylation-specific PCR assays.
- Operational Value: Uses cost-effective LA platform with broad genomic coverage for scalable epigenetic screening.
- Assay Readiness: Generates quantitative methylation readouts (RMVs) that enable comparison across sample groups.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase methylation signatures to clinical-pathological factors in patient cohorts.
- Biomarker Alignment: Identifies EPB41L3 as a methylation-associated gene with potential as a diagnostic or prognostic biomarker in GI cancer.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables stratification of preclinical models by methylation status to improve predictive confidence.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by generating epigenetic data that informs target selection, assay development, and biomarker validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of epigenetic drivers in gastrointestinal carcinogenesis.
- Screening: Enables assay standardization through bisulfite conversion and quantitative PCR readouts.
- Analytics: Delivers methylation quantification and clustering outputs for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects methylation patterns to clinical variables like lymph node metastasis for biomarker relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable epigenetic profiling workflow applicable across GI cancer subtypes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking epigenetic changes to cancer phenotypes.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized tissue processing and bisulfite conversion steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by validating biomarkers in independent test cohorts.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets with strong methylation-clinical correlations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epigenetics, tissue macrodissection, and bisulfite conversion techniques.
- Dependent on instrumentation for bisulfite treatment, spin-column purification, and real-time PCR.
- Necessitates cross-team standardization of H&E staining and tissue selection protocols.
- Adaptation considerations include varying DNA quality across FFPE sample sources.
- Practical limitation: RNA degradation risk during prolonged heat incubation steps.
