监测三D培养中的癌细胞入侵和T细胞毒性

这些方法可以提供免疫细胞中培养的肿瘤细胞毒性和3D环境中的侵入性行为的机械洞察。该技术的主要优点是，这种3D球体共培养模型不需要在后续论文中传输球类。演示这个程序将是阿普斯拉纳西尔，一个博士生从我们系。

在细胞培养罩中使用无菌技术生成球体，将500微升熔融的黄糖加入81微井橡胶模具，注意避免气泡。当加糖凝固仔细弯曲橡胶模具，弹出阿加罗斯铸成12孔板的个别孔。为了平衡铸件，将2.5毫升的细胞培养基，并辅以10%的胎儿牛血清进入每个井中，并将板放入细胞培养箱一小时。

在孵化结束时倾斜板，首先去除周围细胞培养培养，然后在播种室中仔细播种190微升，准备将肿瘤细胞悬浮液滴入每个细胞播种室。在细胞培养箱中孵育15分钟后，在2.5毫升的培养物中加入到铸件的外侧，并将板回孵化器48小时。要建立T细胞共培养重新暂停适当数量的T细胞在190微升的不适当的T细胞培养，中培养每井直到12个井板，允许去除周围阿加罗斯铸就的细胞培养基。

然后在播种室中，在不去除球体的情况下，使用光学显微镜检查任何球体是否被吸气，并按住P200加载的移液器，每个铸件上方约半厘米，小心地将T细胞播种到铸件上，而不使球体不被递离。当所有铸件都经过种子精心将板返回到细胞培养箱15分钟，然后添加新鲜细胞培养剂，并辅以胎儿牛血清到每个铸件的外侧再孵育48小时。将 3D 共培养物嵌入第一型胶原蛋白稀释库存胶原蛋白中，用血清自由基基介质，最终工作浓度为每毫升 3 毫克，并加入 11 微升 10X PBS，每 100 微升胶原蛋白添加 1.2 微升氢氧化硅钠。

在冰上中和胶原蛋白溶液一小时后，去除周围和每个铸件内的细胞培养。如所证明的。小心地将中和的胶原蛋白以滴滴的方式添加到每个铸造中，并立即将板返回到细胞培养培养箱五分钟，然后反转板，在孵化中再加热一小时。在孵化结束时，将板右侧放在生物安全罩中，并慢慢在每一个井的一侧添加一个新的细胞培养介质。

然后将板返回细胞培养箱48小时。对于嵌入式3D共培养物的免疫荧光染色，可修复每个整条黄糖铸件，包括5.4%的球状物，在加湿室的室温下过夜。第二天，去除阿加罗斯铸件周围的形式，并使用圆滑的尖钳抓住每个胶原蛋白基质的角落，让铸件在单个流体运动中从播种室中剥离。

将每个胶原蛋白贴片放入八井室滑梯的单口井中，并在每口井中加入 250 微升 0.5% 八氧醇。在室温下一小时后，用250微升的阻尼溶液将八氧醇更换。在室温下一小时后，向每井添加250微升的原抗体鸡尾酒，并在室温下将幻灯片放在黑暗的加湿室中过夜。

第二天早上，从每口井中去除原抗体，用300微升的 IF 缓冲液洗三次，每次洗涤室温下洗涤五分钟。上次洗涤后，在每井中加入250微升不适当的二次抗体溶液，在室温下孵育一小时，防止光线。在孵化结束时，取出抗体，用 IF 缓冲液洗三次，如所示。

最后一次洗涤后，每口井用 300 微升 PBS 冲洗样品，并小心地拆下腔室滑轨的墙壁。因此，只有底部的玻璃幻灯片仍然存在。将 200 微升安装介质添加到玻璃幻灯片中，小心地将盖板滴放到样品上，而不产生气泡，然后将安装的样品存放在黑暗干燥的地方过夜，然后通过共声荧光显微镜进行成像。

将3D培养基嵌入第一型胶原蛋白中，通过图像监测和分析入侵J.In对两种原发性穆林、胰腺癌细胞系的不同球形形状和侵入性行为进行了分析。第一个细胞系一展示了一个更紧凑的球体形成和尖刺入侵，类似于观察到的单细胞入侵。而第二细胞系形成球状体，更松散，并表现出集体入侵模式。

联合培养可以同时与两种不同的肿瘤克隆细胞系进行，或在肿瘤球状形成或随后的肿瘤T细胞相互作用评估后与肿瘤和T细胞进行联合培养。为了对侵入性行为进行详细评估，可以以高通量的方式进行免疫荧光染色和共焦成像。agarose铸件允许将整个3D培养系统嵌入石蜡中，用于序列分段和免疫组织化学染色，以量化肿瘤和T细胞之间的空间关系。

例如，T细胞渗透可以识别和特征细胞表面标记染色。该技术允许分析患者样本，以及使用刺激和阻断药物来探测肿瘤细胞T细胞相互作用。