晚期胚胎 果蝇 性腺的解剖和活体成像

实时成像最容易理解细胞动力学。该协议能够对以前无法可视化的性腺发育阶段进行实时成像。分离性腺所需的精细解剖需要在高倍率下进行精细而精确的作。

只有视觉演示才能传达如何执行每个步骤。刚接触这项技术的人可能会难以在某些步骤中进行快速计时和精细的组织作。我们建议在学习时单独练习此协议的部分。

首先用金刚石刀将 22 x 22 毫米的盖玻片切成四个大小相等的条状。用镊子拿起一条条带，并在条带的两侧涂抹 30 微升庚烷胶溶液。以不同角度倾斜胶条，以便在庚烷蒸发时获得均匀的胶水残留层。

将条带存放在空的盖玻片盒中。设置一个倾斜但直立的位置，以尽量减少与盒子的接触并保持其粘性。然后合上该框。

将老化的去绒毛膜胚胎移植到装有 500 至 750 微升庚烷的小手表玻璃杯中。将胚胎吸入微量移液器的狭窄部分，并在移液管内尖端附近缓慢聚集它们，然后轻轻地将它们移液到载玻片上。将组织湿巾的一角拧成细尖，从载玻片上的胚胎中吸走庚烷，从而更容易将它们捕获在胶水覆盖的条带上。

用镊子拿起一条覆盖着胶水的条带，轻轻地触摸胚胎。将试纸条放入成像皿中，就在 Poly-D-赖氨酸涂层中心外，胚胎面朝上。按压绑在培养皿上的条带，确保其固定到位。

立即用 2 至 3.5 毫升林格氏溶液淹没培养皿，以浸没胚胎并防止它们干燥。在解剖过程中，组织碎片可能会粘在解剖针上。为了去除这些碎屑，请定期将针头抬高到林格氏溶液表面上方。

选择具有三个肠道收缩的 16 期胚胎，形成四个堆叠的肠道段。要开始 devitellinization，请用钨针在前端刺穿选定的胚胎，并从胚胎上剥下卵黄膜。将针头钩在远离性腺的区域穿过胚胎，然后将胚胎转移到盖玻片的聚赖氨酸涂层区域。

将其拖到底部，直到它粘附。同样，将所有脱盐胚胎沿着盖玻片的顶部排成一排，在下面留出足够的空间。将胚胎切成薄片以露出其内部，并通过在性腺之间向后移动针头从其中心切开胚胎。

梳理出一些内部组织，露出性腺，并使其粘附在盖玻片上。用针头切一块组织，包括性腺，并将其与剩余的尸体分开。然后，将此组织拉到涂层盖玻片的新鲜区域，以将其粘附到培养皿上。

小心地引导去除外来组织并将性腺粘附在培养皿的新鲜粘性区域，尽可能多地从性腺中取出周围的组织。确保不要直接触摸 goad，以免损坏它。解剖后，在解剖皿的外部添加套准标记，以帮助稍后在共聚焦显微镜上定位性腺。

一对镊子的底部插脚轻轻插入条带下方，紧握镊子，然后将条带向上倾斜以将其从培养皿中释放出来，从而从培养皿中取出涂胶的条带，从而最大限度地减少对粘附性腺的干扰。使用套准标记将成像培养皿放在载物台支架中，以与解剖过程中相同的方向放置培养皿。使用明场显微镜和低倍物镜来识别并聚焦粘附在盖玻片上的任何组织。

切换 IP 设置以显示荧光，并使用双目目镜系统扫描培养皿，在成像软件中标记每个性腺的位置。轻轻取下整个载物台支架组件，成像盘仍在其支架中，然后将组件放在工作台上。用 P1000 微量移液器从成像皿的内侧上壁架中取出一些林格溶液。

然后使用 P50 微量移液器从表面下去除大约 100 至 200 微升溶液，确保不要去除所有溶液。在剩余的林格氏溶液表面下加入大约 200 微升含有胰岛素的成像介质。将剩余的成像介质添加到培养皿中，从上壁架的最外缘开始。

移液时，向液体的中央圆顶移动，最终通过刷过两者来合并试管。将显微镜切换到更高倍率的物镜并涂抹适当的浸入液。然后更换载物台支架组件。

将焦点调整到标记的性腺位置并开始成像。在共聚焦显微镜上对分离的性腺进行明场可视化，揭示了性腺外围周围的黑影，这是在成像过程中保持性腺完整性的细胞外基质。此处显示了表达标记和体细胞性腺细胞和组蛋白标志物的健康、培养良好的性腺的实例。

如果性腺在成像过程中水分不足，组织就会萎缩。在解剖过程中细胞外基质受损的性腺边界受损，这在性腺范围之外存在性腺特异性细胞就很明显。在压实之前，X-VIVO 培养的性腺中形成的干细胞生态位最初表现为性腺前部体细胞的松散聚集体。

生态位细胞被种系干细胞包围。生态位聚集体最初表现出不规则的边界。在整个成像过程中，单个生态位细胞重新排列它们的位置，使生态位聚集体获得更平滑的边界，从而导致生态位面积减少。

在尝试此方案时，重要的是在将胚胎转移到涂层培养皿时快速工作，并在将性腺从周围组织解剖时保持精细。X-VIVO 培养可以与遗传和药理学作相结合，允许采用多方面的方法来研究男性或女性性腺发育过程中发生的事件。这项技术使我们能够可视化干细胞生态位如何获得其最终结构。

因此，我们现在可以形成和测试关于驱动其形态发生的潜在细胞动力学的假设。