Name: 使用纤维素凝块固定 的果蝇 组织用于实时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学习使用纤维素凝块固定果蝇幼虫脑组织进行活体成像的方法。该技术通过凝血酶诱导纤维蛋白原聚合，有效减少样本漂移，便于实时观察神经上皮收缩和神经母细胞分裂等动态生物学过程。

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Januschke 实验室的工作由 Wellcome 信托基金资助，资助编号为 100031/Z/12/A 和 1000032/Z/12/A。组织成像设施由 Wellcome 资助的 WT101468 项目支持。

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<li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+ex+vivo+culture+and+live+imaging+of+Drosophila+larval+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs.</a> PloS One. 11 (9), 0163744(2016).</li>
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<li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flies+without+centrioles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flies without centrioles.</a> Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).</li>
<li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li>
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<li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168(2017).</li>
<li>Martin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+of+the+Drosophila+adult+midgut+reveals+real-time+dynamics+of+division%2C+differentiation+and+loss%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss.</a> eLife. , (2018).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li>
<li>Sabado, V., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+fluorescence+live+imaging+of+Drosophila+circadian+clocks+in+larval+brain+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).</li>
<li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li>
<li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li>
<li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+drosophila+neuroblast+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages.</a> PloS One. 8 (11), 79588(2013).</li>
<li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%3A+An+iIternational+Journal+On+the+Molecular%2C+Supramolecular+and+Evolutionary+Aspects+of+Chromosome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).</li>
<li>Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+recording+of+centrosomes+and+other+organelles+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts.</a> Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).</li>
<li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li>
<li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li>
<li>Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aPKC-mediated+displacement+and+actomyosin-mediated+retention+polarize+Miranda+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts.</a> eLife. 7, 166(2018).</li>
<li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li>
<li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745(2018).</li>
<li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Busse, B. MultiStackRef [software]. , Available from: 
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<li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li>
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<li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy%2C+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740(2015).</li>
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 <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

对完整 D. melanogaster 幼虫大脑进行活体成像，可在接近生理条件的环境中观察神经干细胞的不对称分裂。本实验方案的第一部分介绍了我们对幼虫大脑解剖的操作方法。如先前所述13，制备过程中的一个关键环节是避免损伤大脑。其中最具挑战性的步骤是在不对外部施加过度牵拉的情况下，将大脑与邻近的成虫盘组织分离。我们提出的“切割而不牵拉”方法是：使用一对镊子的尖端进行研磨式移动，或让一个镊子的尖端沿着另一对镊子的尖端滑动，而后者用于固定组织之间的连接部分（图1A）；相比之下，Lerit 等人描述的是使用解剖针进行类似锯切的动作。我们建议实验人员尝试所有方法，并选择最适合自己操作习惯的一种。我们还建议使用经牛血清白蛋白（BSA）或胎牛血清（FCS）包被的移液器吸头，而非解剖工具来转移分离的大脑组织。包被处理可防止组织黏附于塑料表面，从而在始终保持组织完全浸没的前提下实现安全转移，避免因组织黏附于解剖工具而在转移过程中可能发生的短暂形变。包被吸头还具有其他优势，例如可同时转移多个大脑样本，这在需要严格控制样品在特定培养基中停留时间时尤为有用；该方法也适用于其他组织（包括较脆弱的组织，如脂肪体）的转移；通过选用更大尺寸的吸头或剪切吸头末端，还可适应不同大小的样本。
接下来，本方案描述了使用纤维蛋白原凝固法将幼虫脑组织固定在培养皿盖玻片上的方法。将脑组织置于含有培养基和纤维蛋白原的液滴中并调整方向后，通过加入凝血酶诱导凝固反应。纤维蛋白的形成是渐进的，因此在必要时可在此期间对样品的方向进行精细调整（图2C）。如果需要对样品施加轻微压迫——但我们不建议在幼虫脑组织中采用此操作——也可在步骤3.4.4和3.5.2中通过不同程度地靠近样品按压凝块来实现微调。与Lerit等报道的方法相比，本纤维蛋白原凝固法的主要优势在于可在活体成像过程中更换培养基，后者是将脑组织夹在透气膜与盖玻片之间进行封片。使用透气膜可能具备的一个潜在优势是能够为样品提供更佳的氧气供应，而本方法中由于脑组织被凝块及部分培养基与空气隔开，氧气供应可能相对受限。因此，尽管我们未评估培养皿中培养基用量的影响，但仍建议在确保凝块完全浸没的前提下，尽量减少其上方的培养基体积。
由于血凝块的操作在实验上可能较为困难且耗时，我们建议实验人员首先在不使用样品的情况下练习血凝块的操作。调节盖玻片上培养基与纤维蛋白原混合液滴的体积、纤维蛋白原的浓度，或凝血酶的体积与浓度，可能有助于简化制备过程，并在将该方案应用于其他类型组织时显得尤为重要。在具备足够的血凝块操作经验后，如有需要，可将多个脑组织固定于同一个血凝块中，尽管这会使方向的精细调整变得复杂。在盖玻片上可同时形成多个血凝块，从而例如实现不同基因型样品的成像。此外，也可将同一盖玻片上的不同血凝块暴露于不同的培养基中，但必须注意避免混合覆盖不同血凝块的培养基液滴。一旦幼虫脑组织被固定并准备进行活体成像，我们建议遵循 Lerit 等人13 的建议，以避免过度的光损伤。我们在此基础上补充：不仅应在活体成像过程中使用载物台培养箱将脑组织维持在 25 °C，还应在成像开始前至少预热载物台 30 分钟。据我们的经验，若未系统执行此步骤，将导致严重的焦平面漂移。
在某些情况下，能够在活体成像后进行相关显微观察并对样品进行固定和免疫染色具有优势。然而，使用纤维蛋白凝块的一个局限性在于，几乎不可能在不损伤组织的情况下通过机械手段将脑组织从凝块中分离出来。克服这一限制的可能方法之一是开发利用纤溶酶降解纤维蛋白凝块的技术，或通过添加模拟促进纤维蛋白聚合的“ knob”结构域的肽段来诱导凝块解离28。我们通常将纤维蛋白凝块用于从单个细胞到长达200 µM组织的样品，但也曾成功地将宽度超过3 mm的成年熊蜂脑组织固定于凝块中并进行成像。目前尚待确定的是可被固定于凝块中的样品尺寸上限。类似地，尽管我们通常对固定后的样品进行4至5小时的成像，但我们已成功对原代培养的神经母细胞进行了长达3天的成像，表明凝块至少不会干扰样品的长期存活能力。相反，凝块有助于在无需使用蠕动泵等装置的情况下定期更换培养基，这对于长期成像至关重要。虽然我们尚未测量纤维蛋白凝块的通透性参数，但其纤维状凝胶性质似乎允许细胞可渗透分子穿透。我们发现，细胞松弛素A（Latrunculin A）、秋水仙酰胺（Colcemid）、1-NAPP1、HALO标签配体以及其他细胞生物学中常用的标准染料均能无阻碍地进入纤维蛋白凝块中的细胞，迄今为止尚未遇到会被凝块截留的分子，但这一可能性仍需通过实验验证。
综上所述，使用纤维蛋白凝块为活体成像中固定活体组织提供了一种可靠且相对易于实施的方法。除了在限制侧向漂移方面的实用性外，在活体成像过程中更换培养基的能力，对于我们采用化学遗传学方法研究黑腹果蝇（D. melanogaster）神经母细胞的不对称细胞分裂尤为宝贵21。我们预计，该技术将有助于广泛不同类型组织的研究，特别是涉及化学遗传学或例如蛋白质自标记29的研究。
我们的 MultiHyperStackReg 宏依赖于 TurboReg ImageJ 插件（该插件可对图像栈中连续的帧或切片进行对齐）以及 MultiStackReg ImageJ 插件（该插件允许将变换应用于其他图像栈）。MultiHyperStackReg 的作用仅仅是将这些变换应用于超栈（即具有至少四个维度的图像栈）。由于如我们所描述的 MultiHyperStackReg 使用过程涉及大量操作，可能相当耗时，因此我们还编写了 AutoHyperStackReg 宏，它可自动执行步骤 6.2 和 6.3 中描述的所有操作。然而，与 MultiHyperStackReg 不同的是，AutoHyperStackReg 目前尚不具备基于图像栈的子区域来计算对齐的功能，而我们发现这一选项有时对于实现满意的对齐至关重要。AutoHyperStackReg 的另一个局限性在于，它仅限于平移变换，无法使用 TurboReg 和 MultiStackReg 提供的其他变换类型；而 MultiHyperStackReg 则可根据用户需求，将任意类型的变换应用于超栈。未来版本将实现这些功能，并将在 GitHub30 上发布。最后，我们的旋转线扫描宏提供了一种简便方法，可快速测量延时成像中的皮层信号，即使皮层随时间发生位置或方向变化。其跟踪模式或非跟踪模式哪种更适合分析，取决于皮层信号的质量和稳定性。跟踪模式更易于使用，因为用户无需考虑每个时间点皮层的具体位置，且该模式能够适应皮层在时间和空间上较大的位置与方向变化。然而，该模式仅适用于在整个视频过程中皮层信号始终保持足够强以供检测的情况：一旦检测到非皮层结构（例如靠近皮层的明亮胞质区域），则可能导致后续所有时间点的检测失败（例如，该胞质区域随后远离皮层，而线扫描会持续跟随该错误目标直至视频结束）。非跟踪模式则不存在此缺陷，因为检测被限制在用户最初绘制的线范围内（例如，一个明亮的胞质区域可能导致少数几个时间点检测失败，但当该区域移出检测区域后，皮层的正确检测即可恢复）；但如果皮层的位置或方向随时间发生显著变化，非跟踪模式的表现则不佳。接下来将为跟踪模式开发的新功能（将在 GitHub30 上发布）是允许仅分析指定的时间点，并定义一个参考时间点（而非默认的第一个时间点），在该参考点之前和之后进行检测，从而让用户至少能够避开存在问题的时间点。

Drosophila 一直是研究广泛生物学问题的重要模式系统，在数十年来推动了多个学科领域的知识进步。其中一个尤为突出的特点是，它特别适合进行活体成像。实时监测亚细胞过程或细胞与组织行为的能力，持续为细胞生物学和发育生物学中的关键概念提供重要贡献。不同研究团队已开发出许多成功的实验方案，用于维持 Drosophila 样本的活性与健康状态，以实现实时观察样本行为及荧光分子动态。例如，果蝇的成虫盘1,2、幼虫脑3,4,5,6、成年雌性个体的卵室7,8,9 或成年肠道10 等器官和组织，均可被分离并置于培养环境中，通过延时显微镜进行成像观察。活体成像的一个关键挑战在于，必须确保样本紧贴成像表面以获得最佳分辨率，同时保持固定不动，而又不损害样本完整性——后者可能对机械冲击较为敏感。以研究 Drosophila 幼虫脑中的神经干细胞（即神经母细胞）或神经元为例，可通过将样本置于密封成像腔室中并覆盖培养基的方式，使其贴近成像表面11,12,13。然而，这种方法难以实现培养基的更换，从而限制了实验操作的灵活性。另一种替代方案是将样本制备后置于经处理以增强细胞黏附的盖玻片上，可在开放培养皿中进行多点重复观察和长时间活细胞成像，该方法具备更换培养基的潜力，但在更换培养基过程中却难以有效防止样本漂移或丢失14,15。
最初为研究活体摇蚊精母细胞减数分裂而开发的纤维蛋白凝块法16特别适用于解决上述问题。将纤维蛋白原溶解于相应的培养基中，将样品放置并定向于成像玻璃表面培养腔内该溶液的一滴中，随后加入凝血酶，从而迅速形成不溶性纤维蛋白凝块。这种黏性纤维网状结构可牢固附着于玻璃表面和样品，同时确保样品与培养基的充分接触。此后可在不扰动凝块或样品位置的情况下更换培养基。例如，在原方法中需要添加抑制剂、进行洗脱或脉冲追踪实验，或在活细胞成像过程中需加入荧光染料但需保持细胞和组织位置不变时，成像过程中更换培养基尤为必要。纤维蛋白凝块同样适用于果蝇（Drosophila）组织以及单个细胞的成像13,17。此外，纤维蛋白凝块还可用于辅助样品定向：对于因形状或其他特性通常难以按所需方向摆放的样品，可通过调节其在纤维蛋白凝块内的位置以及凝块本身的形态来实现理想定向。
在此，我们更新了当前基于纤维蛋白凝块的成像方法，并提供了基于分割的图像分析工具，重点介绍该方法在研究发育中果蝇大脑神经母细胞分裂中的应用。我们常规使用纤维蛋白凝块法，在同一培养皿的不同凝块中同时追踪多个样本，从而实现：i）对中心体行为或mRNA定位等亚细胞事件进行活体成像18,19，ii）在相同的成像设置下，利用多点访问显微镜监测不同基因型样本在药物处理后的行为变化20，iii) 研究急性抑制酶活性的影响21 以及 iv) 通过靶向激光消融，在生理环境下研究细胞分裂方向变化时，最大限度地减少漂移22尽管凝血酶、纤维蛋白原及纤维蛋白凝块的非预期效应需针对每种样本进行实证测试，但该方法原则上适用于固定任何需通过活细胞成像分析的样本类型，并可用于 果蝇 已成功用于研究神经母细胞生物学的多个方面5,19,20，还涉及雌性生殖系干细胞的细胞传感器突起的动力学过程23 急性抑制卵泡细胞中aPKC后极性的变化 果蝇 雌性卵室21.
延时荧光成像会产生复杂的、时间分辨的三维数据集，需要特定方法来提取其中的定量信息。本文介绍了我们对基于 ImageJ24 的宏程序的进一步开发，这些宏可用于校正超堆栈（hyperstacks）中的漂移，并介绍了自行设计的 ImageJ 宏，可实现对细胞皮层多通道荧光信号的半自动化定量分析，用于定量分析果蝇（Drosophila）幼虫大脑神经母细胞或原代细胞培养中单个神经母细胞的皮层蛋白。

<table><tbody><tr><td>牛血清白蛋白，BSA</td><td>Merck</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，适用于细胞培养</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>人血浆纤维蛋白原</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish 细胞培养皿 - 35 mm，23 mm 孔</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>PP1 类似物 (1NA-PP1)</td><td>Merck Millipore</td><td>529579</td><td></td></tr><tr><td>带九个凹孔的 Pyrex 点滴板</td><td>Sigma</td><td>CLS722085-18EA</td><td></td></tr><tr><td> Schneider's 昆虫培养基</td><td>Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆凝血酶</td><td>Merck</td><td>T4648</td><td></td></tr></tbody></table>

固定化技术的应用 果蝇 用于活体成像的含纤维蛋白凝块的组织

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila 是研究广泛生物学问题的重要模式系统。可从果蝇不同发育阶段提取多种器官和组织，例如成虫盘、幼虫大脑、成年雌性个体的卵室或成年肠道，并将其置于培养环境中进行延时显微成像，从而为细胞生物学与发育生物学研究提供宝贵信息。本文详细描述了我们目前解剖 Drosophila 幼虫大脑的实验方案，随后介绍了利用纤维蛋白凝块将幼虫大脑及其他组织固定并定向于玻璃盖玻片上的现有方法。该固定方法仅需在培养基中添加纤维蛋白原和凝血酶即可实现。该方法适用于在同一培养皿中对多个样本进行倒置显微镜下的高分辨率延时成像，可显著减少多点成像过程中因显微镜载物台移动所导致的横向漂移，并允许在成像过程中随时添加或更换试剂。我们还展示了日常使用的自定义宏程序，用于校正图像漂移，并从延时成像分析中提取和处理特定的定量数据。

固定化 果蝇 活体成像过程中含有纤维蛋白凝块的组织及培养基更换。 
在按照步骤2所述程序解剖后（图1）并按照第3步所述程序固定在同一盖玻片上的纤维蛋白凝块中（图2），表达GFP标记的Bazooka（Baz::GFP）的幼虫大脑——果蝇中极性蛋白Par-3的同源物——通过时间延时多点共聚焦成像进行了30分钟的成像观察。Baz::GFP与 apkcas4，一种等位基因，可通过添加小分子ATP类似物1-NAPP1实现对非典型蛋白激酶C（aPKC）的急性抑制20因此，按照步骤4中所述程序，将1-NAPP1加入培养基中，并继续进行2.5小时的活体成像。携带激酶aPKC野生型的对照大脑对ATP类似物无反应，而额外携带aPKC类敏感突变的大脑（apkcas4) 显示神经上皮收缩，以及神经母细胞及其子代细胞中Baz蛋白的明亮簇状聚集（图6, 视频 1）。在延时成像过程中，神经母细胞持续分裂，表明组织保持良好的活性；尽管更换了培养基，脑组织漂移程度很小，说明其固定效果良好。类似地，在按照前述方案解剖分离后27，表达 Baz::GFP 的卵管在同一盖玻片上的纤维蛋白凝块中固定并成像 8 分钟，随后施加 1-NAPP1 诱导收缩 apkcas4 突变的滤泡细胞而非对照组的滤泡细胞（图7, 视频 2).
使用 MultiHyperstackReg 校正侧向与焦平面漂移。 
一个同时显示侧向漂移和焦平面漂移的超堆栈（视频 3，左侧面板）首先通过 MultiStackReg 插件和 MultiHyperstackReg 宏进行侧向漂移校正（步骤 6.2，图 3，视频 3，中间面板），然后进行焦平面漂移校正（步骤 6.3，图 4，视频 3，右侧面板），最终显著减少了原始超堆栈中观察到的运动现象。
使用旋转线扫描测量皮层信号 
表达 Baz::GFP（绿色）和经红外荧光蛋白标记的跨膜蛋白 CD4（CD4::mIFP，红色）的神经母细胞在一次有丝分裂过程中被成像。通过线扫描方法利用 CD4::mIFP 信号作为参考，检测神经母细胞不同区域的细胞皮层（步骤 7， 图5, 图8A–C）并在检测到的位置测量 Baz::GFP 信号 图 8D）。在分裂过程中，神经母细胞通过建立不同的、相对的皮层区域而短暂地极化：即顶端极和基底极。Baz 定义了顶端极，与此一致的是，Baz::GFP 信号在神经母细胞分裂期间于顶端极增强，而在基底极减弱。图8C，D）。在整个延时过程中，皮层的位置被满意地追踪。图8C, 视频 4）。该 果蝇 品系和基因型在文中被引用 补充表 1–2.
<img alt="NAPP1处理对细胞结构的影响；荧光显微镜；对照组与aPKCΔ54随时间变化；实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：在活体成像过程中对固定幼虫大脑施加ATP类似物。（A）两个表达Baz::GFP的幼虫大脑在同一个盖玻片上固定并进行活体成像。在0分钟时，培养基更换为含10 µM ATP类似物1-NAPP1的溶液。对照组大脑未明显响应ATP类似物，而携带aPKC模拟敏感突变（aPKCAS4）的大脑则显示出神经上皮的收缩（箭头）以及神经母细胞及其子代中明显的Baz蛋白簇。图像为23 µM深度范围内33个切片的最大强度投影。比例尺：20 µM。（B）神经上皮的放大图像。比例尺：10 µM。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞对10 µM NAPP1随时间变化的显微镜分析；对照组与aPKC突变体的比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：在活体成像过程中将ATP类似物应用于固定化的卵室。在同一盖玻片上固定的两个表达Baz::GFP的卵泡进行活体成像。在0分钟时，培养基更换为含有10 µM ATP类似物1-NAPP1的溶液。对照组卵室对ATP类似物无明显反应，而携带aPKC类敏感突变（aPKCAS4）的卵室则表现出上皮收缩（箭头），最终导致黏附连接明显解体。图像为27 µM深度范围内33个切片的最大强度投影。比例尺：20 µM。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞膜动态的延时显微成像；图表显示随时间变化的信号强度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 8"> 
图 8：使用旋转线扫描测量皮层信号。（A）活体表达 Baz::GFP（绿色）和 CD4::mIFP（红色）的 D. melanogaster 神经母细胞。青色线：初始扫描线，垂直于不同皮层区域以进行测量。比例尺：5 µM。（B）利用皮层线扫描和 CD4::mIFP（红色）作为参考通道识别皮层（深蓝色线）。青色线：由“围绕测量”参数定义的区域（此处为 2 个像素），在检测到皮层后在此区域内测量信号。比例尺：2 µm。（C）青色：通过旋转线扫描法在神经母细胞分裂过程中识别出的皮层区域，基于（A）中显示的初始扫描线，并以 CD4::mIFP（红色）作为参考通道。比例尺：5 µM。箭头：顶端极；箭头末端：基底极。（D）在（C）中由旋转线扫描识别出的两个对应区域中，Baz::GFP 信号强度随时间的变化。在有丝分裂期间，Baz::GFP 暂时富集于神经母细胞的顶端极，而在相对的基底极则减少。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
视频 1：活体成像过程中对固定幼虫大脑施加培养基更换以添加抑制剂，见 图 6，比例尺：20 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 2：在活体成像过程中对固定的卵室进行培养基更换以添加抑制剂的应用，如 图 7 所示，比例尺：20 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 3：使用 MultiHyperStackReg 校正横向和焦平面漂移。 表达膜探针 PH::GFP 的神经母细胞的活体成像。Xy：单个焦平面。Xz：正交重切面。左侧：漂移校正前。中间：校正横向漂移后。右侧：校正横向和焦平面漂移后，比例尺：10 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 4：使用旋转线扫描检测皮层，见 图 8，比例尺：5 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充表 1：成像的 Drosophila 组织的基因型。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表 2： 所用转基因的来源。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充代码文件 1：所用转基因的来源。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件 2：所用转基因的来源。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充编码文件 3：所用转基因的来源。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了使用纤维蛋白凝块固定样品的应用，可限制样品漂移，并允许在活体成像过程中添加和洗去试剂。将样品转移至盖玻片表面含有纤维蛋白原的培养基液滴中，随后通过加入凝血酶诱导聚合反应。

果蝇是研究广泛生物学问题的重要模式系统。来自不同发育阶段的多种器官和组织……

本方案描述了使用纤维蛋白凝块进行样品固定的步骤。将样品转移至盖玻片表面含有纤维蛋白原的培养基液滴中，随后通过添加凝血酶诱导聚合反应。在解剖显微镜下，使用毛刷将L3期幼虫转移至含有PBS的九孔硼硅酸盐玻璃培养皿中。搅拌以使大部分果蝇食物从幼虫上脱落，并将其转移至另一孔中，该孔含有培养基。用镊子夹住幼虫体长中段的整个直径部位，将其转移至另一含有 200 µL 新鲜培养基的硼硅酸盐板孔中。不要松开幼虫。为了将幼虫沿其整个直径切成两半，可以使用镊子尖端进行横向研磨以切断被夹住的部位，或者将另一把镊子的一个尖端插入夹住幼虫的两把镊子尖端之间。用镊子夹住幼虫的角质层，并用另一把镊子将角质层剥离，注意不要牵拉脑组织。重复此操作，直至暴露出从脑部发出的神经，并能够接触到连接脑与口器的器官。用镊子夹住从大脑发出的神经，用另一把镊子剪断大脑与口器之间的连接，从而将大脑与其余体壁组织分离。通过腹神经索延伸出的轴突固定大脑，并轻轻牵拉周围器官，将其从大脑周围剥离。然后用另一把镊子夹住眼成虫盘与大脑之间的连接处，在不牵拉大脑的情况下剪断该连接。确保脑组织已适当清除其他组织且未受损伤。若脑组织出现损伤迹象，则应弃用。使用P20移液器将包被液反复吹打吸入和排出，以润洗枪头，然后用包被后的枪头吸取脑组织及3 µL培养基，将其转移至另一含有200 µL新鲜培养基的孔中。重复此步骤直至解剖出足够数量的脑组织，期间可偶尔更换进行解剖操作的孔中的培养基。使用带有涂层的P20枪头，将解剖好的脑组织转移至另一含有200 µL培养基和纤维蛋白原的硼硅酸盐培养板孔中。吸取一个脑组织及9 µL的培养基和纤维蛋白原混合液。将移液枪尖端几乎接触细胞培养皿的盖玻片底部，缓慢排出液体，使培养基离开枪头后立即接触盖玻片。使用一对镊子中的单个镊子尖端，或闭合的一对镊子，轻轻推动并调整脑组织在培养基和纤维蛋白原液滴中的位置。若需成像脑组织的腹侧部分，应诱导纤维蛋白原凝固，以使脑组织在凝块中正确朝向。将脑组织推至液滴的一侧。用移液枪头接触与脑组织相对一侧的液滴边缘，加入一微升凝血酶。等待一到两分钟，使纤维蛋白原开始聚合，在液滴的一侧形成浑浊的沉淀物，然后轻柔地推动并包裹脑组织进入纤维蛋白凝块中，确保腹侧面尽可能贴近盖玻片，同时不造成脑组织变形。用移液器吸取一微升凝血酶溶液，滴加在未嵌入纤维蛋白凝块的大脑侧边附近。等待两到三分钟，使第二个纤维蛋白凝块凝固，然后轻压凝块边缘，使其更牢固地黏附于盖玻片上，注意不要使大脑变形。如果大脑看起来距离盖玻片过远，可通过将纤维蛋白凝块向大脑方向轻压，使大脑更靠近盖玻片。为了在成像时形成纤维蛋白凝块以观察脑的背侧部分，将脑组织置于液滴中央，使背侧朝向盖玻片。使用P2移液器，将枪头接触脑组织对侧的液滴边缘，加入1 µL凝血酶。等待两到三分钟，使纤维蛋白原开始聚合，形成浑浊的纤维状沉淀物，然后轻轻按压凝块边缘，使其更牢固地附着在盖玻片上，注意不要使脑组织变形。将移液枪头末端置于血凝块上方约0.5厘米处，缓慢逐滴加入390微升不含纤维蛋白原的培养基至血凝块表面。切勿将培养基加至血凝块周围，以免使其从盖玻片上脱落。为洗去多余的凝血酶，从培养皿中移除300微升液体，随后加入300微升新鲜培养基，并确保血凝块始终完全浸没于液体中。为避免温度变化引起焦距改变，应将含有试剂的溶液与培养皿保持相同温度。打开培养皿盖时，注意不要移动培养皿本身。为便于操作，可在成像前将35毫米培养皿的皿盖倒扣在培养皿上。将 P1000 移液器吸头置于培养皿内培养基表面附近，轻轻将适量试剂溶液释放到培养基中，避免产生强流冲击导致凝块脱落。为使培养皿内的溶液混匀，使用 P200 移液器缓慢吹打溶液 5 次，每次吸入和排出少量液体。盖上培养皿盖子时不要移动培养皿，随后继续成像。当向表达GFP标记Bazooka蛋白且纤维蛋白固定化的幼虫大脑中加入一种NAPP1时，携带aPKC模拟敏感突变的大脑表现出神经上皮收缩，以及神经母细胞及其子代中明显的Baz蛋白簇。神经母细胞在整个延时成像过程中持续分裂，表明组织保持健康状态。尽管更换了培养基，大脑样本几乎未发生漂移。类似地，将一种NAPP1应用于表达GFP标记Bazooka的卵泡细胞时，可诱导对类似敏感的aPKC突变型滤泡细胞发生收缩，但对照组细胞则无此反应。对于同时显示侧向漂移和焦平面漂移的超堆栈，应首先校正侧向漂移，然后校正焦平面漂移，从而显著减少原始超堆栈中观察到的运动。在尝试本方案时，重要的是在纤维蛋白凝块部分聚合后、仍具可塑性但已足够坚固以稳定固定脑组织时，将脑组织埋入凝块中。通过操作空凝块并在其聚合过程中轻轻探查，以评估其坚固程度。

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