使用纤维素凝块固定 的果蝇 组织用于实时成像

该方案描述了使用纤维蛋白凝块的样品固定。将样品转移至盖玻片表面的一滴含纤维蛋白原的培养基中，然后通过添加凝血酶诱导聚合。在解剖显微镜下，使用刷子将 L3 幼虫转移到含有 PBS 的 9 孔硼硅酸盐玻璃培养皿中。

搅拌以从幼虫中分离大部分果蝇食物，并将其转移到另一个含有培养基的孔中。使用镊子在其体长中间的整个直径上抓住幼虫，并将其转移到含有 200 微升新鲜培养基的硼硅酸盐板的另一个孔中。不要释放幼虫。

要将幼虫的整个直径切成两半，可以通过镊子尖端的横向移动来研磨抓取区域，或者将另一对镊子的一个尖端滑动到固定幼虫的两个镊子尖端之间。用镊子抓住幼虫的角质层，用另一对镊子在不拉扯大脑的情况下剥开角质层。重复此作，直到可以看到源自大脑的神经，并且可以接触到连接大脑和口器的器官。

在用镊子夹住源自大脑的神经的同时，用另一对镊子切断大脑与口器之间的连接，将大脑与角质层的其余部分分开。抓住从腹侧神经索出来的轴突握住大脑，轻轻地将周围的器官从大脑中拉出。然后用另一对镊子抓住眼睛想象盘和大脑之间的连接，并在不拉扯大脑的情况下切断这个连接。

确保大脑中的其他组织被适当清除并且没有受损。如果大脑有受损迹象，请丢弃它。用 P20 吸取涂层溶液的吸管和移液，以涂覆移液器吸头，然后用涂层吸头和 3 微升培养基吸出大脑，并将其移出另一个含有 200 微升干净培养基的孔中。

重复此过程，直到解剖出足够的大脑，偶尔更换进行解剖的孔的培养基。使用带有涂层尖端的 P20 移液器将解剖的大脑转移到硼硅酸盐板的另一个孔中，其中包含 200 微升培养基和纤维蛋白原。吸出一个大脑以及 9 微升培养基和纤维蛋白原。

在吸头末端几乎接触细胞培养皿的盖玻片底部的情况下，移出内容物，使培养基在离开移液器吸头后立即接触盖玻片。使用一对镊子的一个尖端或一对闭合的镊子，轻轻推动并定位在培养基和纤维蛋白原滴剂中。如果必须对大脑的腹侧部分进行成像，则诱导纤维蛋白原凝血以正确定位凝块内的大脑。

将大脑推到液滴的一侧。用移液器吸头触摸大脑另一侧的液滴边缘，并加入 1 微升凝血酶。等待一到两分钟，让纤维蛋白原开始聚合，导致在液滴的一侧形成浑浊沉淀，然后轻轻地将大脑推入纤维蛋白凝块中，确保腹侧尽可能靠近盖玻片，而不会使大脑变形。

在靠近大脑一侧的地方吸出一微升凝血酶溶液，不要塞进纤维蛋白凝块中。等待两到三分钟，让第二个纤维蛋白凝块凝固，然后按压凝块的边缘，使其更牢固地粘附在盖玻片上，注意不要使大脑变形。如果大脑看起来离盖玻片太远，请将纤维蛋白凝块压近大脑，使其更近。

为了诱导纤维蛋白凝块对大脑的背侧部分进行成像，将大脑置于滴剂的中心，背侧面向盖玻片。使用 P2 移液器，用移液器吸头触摸大脑另一侧的液滴边缘，然后吸出一微升凝血酶。等待两到三分钟，让纤维蛋白原开始聚合，形成浑浊的纤维沉淀，然后按压凝块的边缘，使其更牢固地粘附在盖玻片上，注意不要使大脑变形。

将吸头末端位于凝块上方约 0.5 厘米处，将 390 微升不含纤维蛋白原的培养基滴入凝块顶部。不要在凝块的侧面添加培养基，因为它可能会将其从盖玻片上分离。要洗掉多余的凝血酶，请从培养皿中取出 300 微升，然后加入 300 微升干净的培养基，确保凝块保持完全浸没。

为避免温度变化导致焦点变化，请将含试剂的溶液保持在与培养皿相同的温度。取下培养皿的盖子，不要移位培养皿本身。为了更容易取出，请在成像前将 35 毫米培养皿的盖子倒置在培养皿顶部。

将 P1000 移液器吸头靠近培养皿内培养基表面的位置，轻轻释放足够体积的试剂溶液到其上，而不会产生可能分离凝块的强通量。为了使培养皿内的溶液均质化，请使用 P200 移液器缓慢吸取少量溶液，然后移出五次。在不移位培养皿的情况下更换盖子并恢复成像。

当将一种 NAPP1 添加到表达 GFP 标记的火箭筒的纤维蛋白固定的幼虫大脑中时，携带 aPKC 类似物敏感突变的大脑表现出神经上皮的收缩，以及神经母细胞及其后代中明亮的 Baz 簇。神经母细胞在整个延时过程中不断分裂，表明组织保持健康。尽管培养基发生了变化，但大脑几乎没有表现出漂移。

同样，将一种 NAPP1 应用于表达 GFP 标记的火箭筒的卵巢，诱导类似物敏感的 aPKC 突变滤泡细胞的收缩，但不诱导对照细胞的收缩。首先针对横向漂移和聚焦漂移校正显示横向漂移的超堆栈，然后校正焦点漂移，从而大大减少了在原始超堆栈中观察到的运动。在尝试此方案时，重要的是将大脑塞入部分聚合的纤维蛋白凝块中，同时凝块仍具有延展性但足够坚固以稳定地固定大脑。

尝试作空凝块，并在凝块聚合时轻轻探测凝块，以检查其坚固性。