经瞳孔双光子活体小鼠视网膜成像

这种视网膜细胞的活体成像方法可用于研究眼科学疾病并理解视网膜的正常功能。该方法通过双光子显微镜技术，为视网膜的活体成像提供了一种简便且高度可重复的途径。正确固定小鼠是获得高质量活体图像的关键。

练习将小鼠放置在头部固定装置中，在尝试获取图像之前熟悉操作流程。根据批准的动物使用方案对动物进行镇静。滴加瞳孔扩张液，并将小鼠置于暗处5分钟，以使瞳孔充分扩张。

将下耳道针固定在向内伸出的位置，上耳道针固定在回缩的位置。旋转头固定器的主臂，直至耳棒低于水平方向倾斜60度。使小鼠面向咬杆，将一侧耳朵安装到伸出的下针上，将针插入耳道中。

松开固定上耳道针的螺丝后，将针伸入另一侧耳道，并重新拧紧螺丝以固定头部。确保小鼠在头部固定器中稳固，按压头部顶端。

小鼠应牢固地固定在耳杆中，其头部应能围绕耳道轴自由旋转。将咬合杆朝向小鼠头部，轻轻抬高小鼠头部，使上颌门齿下降至咬合杆固定器中，然后施加轻柔的力向后拉紧咬合杆以固定头部。使用螺丝将咬合杆固定到位，并将小鼠及其固定装置放置于显微镜载物台上。

将润滑性眼药水滴入小鼠的双眼。旋转头部固定装置的主臂，直至其中一只眼睛的瞳孔与光路对齐，并将1.5号盖玻片放入紧凑型滤光片支架中。将支架固定到显微镜载物台上后，缓慢降低盖玻片，使其接触润滑性眼用凝胶但不触及角膜。调节载物台的X-Y方向位置以及物镜的Z轴位置，直至宽场激发光完全覆盖角膜。

使用目镜继续调整Z轴位置，直至视网膜中的荧光细胞或结构清晰对焦，必要时增加落射荧光照明强度，以分辨出感兴趣的单个细胞或结构。精细调节视网膜与成像光路的对准。调整头部角度，使得在改变焦平面时仅出现离焦光的扩大或收缩，从而最小化X-Y方向的畸变。

然后，关闭落射荧光照明器，并关闭照明器快门。进行双光子成像时，需遵循所有机构规定的激光安全规程。关闭并遮蔽所有环境光，将激发光路切换至激光器，发射光路切换至光电倍增管（PMT）。

在图像采集软件中，将帧尺寸设置为 512 × 512，帧平均值设置为 3。设置 Z 轴步进从堆栈顶部开始并向下推进，以最小化双光子激光对光感受器的激活。打开并启用 PMT，将电压调节至 680 伏。

打开成像快门和发射快门。开始对目标组织进行实时图像预览，起始激光功率设为1%，并自动调节显示亮度以观察目标细胞或结构。如果目标组织信号微弱或不清晰，可逐步提高激光功率百分比，直至结构可见，但激光功率不得超过45毫瓦。

在X-Y方向上移动显微镜载物台，以将目标成像区域置于视野中心，并调节至Z平面，使目标结构清晰对焦。对于长期时间序列实验，打开先前获取的图像作为目标细胞的参考，注意确保当前成像角度与之前图像的角度相似。随后，移动至目标区域最上方和最下方的Z平面，以设定成像Z轴范围，并采集图像。

当所有图像采集完成后，关闭光电倍增管（PMTs）和激光快门。将激发光路切换至落射荧光照明，发射光路切换回目镜。随后退出图像采集软件，在计算机界面中关闭激光器，并按照与启动顺序相反的次序关闭硬件设备，始终开启的设备除外。

分析结束后，将小鼠从头部固定装置中取出，使用无绒布轻轻擦去眼睛上的凝胶。然后，在两只眼睛上涂抹润滑性眼膏，并将小鼠置于37°C循环温水加热垫上，持续监测直至完全恢复卧姿，再将其放回饲养笼中。在VGlut-2-Cre小鼠中，视网膜神经节细胞的胞体清晰可辨，轴突束通常也明显可见。

在VGlut-2-Cre小鼠中，轴突的走行轨迹以及血管结构的负像有助于识别视盘，这在慢性成像实验中可作为重要的解剖标志。与视网膜神经节细胞不同，无长突细胞的神经突起更常出现在内丛状层。玻璃体内注射NMDA一天后，视网膜小胶质细胞表现出较短的突起或阿米巴样形态，与既往报道一致。

在成像前30至60分钟通过单次腹腔注射递送伊文思蓝染料，可对从视神经乳头发出的血管产生强烈的标记，该标记至少持续七天。固定后，可在共聚焦扫描中测量平铺视网膜全层装片内细胞对之间的实际距离，并与活体图像中的像素距离进行比对，从而确定活体图像的平均像素大小。将荧光微球注射到小鼠眼内，可在活体状态下测量微球直径，由此估算出的像素尺寸略大，但变异性较高。

活体成像可与免疫染色和原位杂交等组织学分析方法结合使用。这些方法能够鉴定特定的细胞类型，并检测成像细胞的基因表达情况。