Name: 研究利普托梅宁格疾病直接靶向治疗的穆林·奥马亚异种格拉夫特模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 了解小鼠奥马亚模型用于软脑膜疾病靶向治疗的研究方法。该模型通过立体定向手术植入，实现药物直接注入脑脊液，绕过血脑屏障，为中枢神经系统转移瘤的临床前治疗策略开发提供重要工具。

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我们感谢南佛罗里达大学比较医学团队的Michele L. Danielson、Tricia Favors-Watson以及其余成员在技术上的支持以及对实验动物的维护。感谢Instech Laboratories, Inc. 根据我们的要求，致力于与我们合作开发适用于磁共振成像（MRI）的小鼠Ommaya装置。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R21 CA216756（资助对象：K.S.M. Smalley）、美国国防部（DOD）W81XWH1910675（资助对象：B. Czerniecki 和 P. Kalinski）以及莫菲特癌症中心CBMM创新奖（资助对象：P. Forsyth 和 D. Duckett）提供资助。编辑协助由莫菲特癌症中心科学写作办公室的Paul Fletcher博士和Daley Drucker提供。除其常规薪资外，未提供任何额外报酬。

该方案已获得南佛罗里达大学机构动物照护与使用委员会（IS00005974）的批准。
1. 将CTC注入脑脊液以建立小鼠LMD模型
<ol>
	<li>循环肿瘤细胞（CTCs）的制备
	<ol>
		<li>计算注射所需的CTCs数量，并在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中制备浓度为1.0 × 104 个细胞/µL的单细胞悬液。整个操作过程中将细胞悬液置于冰上或4 °C环境中。 
		&#8203;注意：若使用的细胞系需要胰酶消化，请务必用无菌PBS洗涤细胞两次以彻底去除胰酶。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。若实验涉及较大样本量（&#62;50只小鼠），应在每次注射之间重新计数并验证细胞活力，以确保每只小鼠接受的细胞数量一致。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术前准备
	<ol>
		<li>皮下注射1&#160;mg/kg缓释型布托啡诺（Bup-SR）。 
		注意：避免在拟切口区域注射，应选择远离肩胛骨的部位作为注射点。</li>
		<li>使用2-3%异氟烷麻醉小鼠，直至其失去翻正反射。此外，通过夹捏尾部和/或足掌检查疼痛反射，以确认麻醉状态。</li>
		<li>在远离手术区域的位置为小鼠进行术前准备。剃除手术区域（即颅骨背侧）及其周围足够范围的毛发，防止毛发污染切口；随后从中心向外围涂抹杀菌性皮肤消毒剂，并待其自然干燥。覆盖无菌手术巾或带粘性的无菌塑料手术膜，以保护手术区域免受污染。 
		&#8203;注意：所有器械应预先高压灭菌，且在不同动物间使用玻璃珠灭菌器对器械尖端进行再消毒。</li>
		<li>剃除头部整个腹侧表面的毛发，并采用无菌技术处理皮肤。</li>
		<li>将小鼠鼻部固定于立体定位仪改良的L形鼻罩中，确保鼻孔通畅开放。用胶带穿过双耳腹面，轻轻向前牵拉皮肤并固定于鼻罩上，固定后使颈部弯曲约90°角。给予1.5%异氟烷维持麻醉状态。 
		&#8203;注意：正确体位应使切口区域充分暴露，便于清晰识别枕骨的尾侧嵴。</li>
		<li>调整小鼠身体位置，确保脊柱与延髓池保持水平；同时对尾部施加轻微牵引力，并在尾根部用胶带固定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>延髓池手术注射
	<ol>
		<li>使颈部完全伸展，从两耳之间开始，将手术剪尖端沿枕骨表面向下施加轻微压力滑动。 
		注意：当剪刀尖处于中线位置时，若其陷入延髓池上方的凹陷区域，可明显感觉到一个小的凹陷。</li>
		<li>在触诊到的凹陷上方做一长约3-5 mm的正中切口。用30 G Hamilton注射器吸取5 µL浓度为1.0 × 104 个细胞/µL的细胞悬液（共5.0 × 104 个细胞）。</li>
		<li>使用尖端为1-2 mm的钝头镊子轻压延髓池区域。将镊子闭合状态下插入，然后在对硬脑膜施加向下压力的同时打开镊尖。</li>
		<li>重复上述钝性分离操作，直至清晰暴露硬脑膜并可见该区域内的相关血管。 
		&#8203;注意：由此形成的注射窗口可确保穿刺针插入时不会损伤血管。</li>
		<li>保持镊子张开以牵开周围肌肉组织，将30 G无芯穿刺针插入硬脑膜下方，观察针尖斜面。确保仅将针尖推进至斜面稍超出即可。缓慢推动注射器活塞，将细胞注入硬脑膜下方。</li>
		<li>正确放置针尖斜面，以便观察硬脑膜下的注射过程。操作需谨慎，使用30 G无芯穿刺针以避免损伤膜结构并尽量减少渗漏。如发现渗漏，可用棉签轻轻按压止漏。</li>
		<li>使用伤口夹或微量皮肤粘合剂闭合皮肤切口。注射成功后，将小鼠置于温暖的毯子上恢复麻醉，持续观察直至其能够维持胸卧位并出现有目的的运动。</li>
		<li>术后第一周内每日监测小鼠状况。若小鼠表现出疼痛或痛苦迹象，根据兽医咨询和指导，每12至24小时皮下注射一次卡洛芬（10 mg/kg），最多连续使用5天。允许小鼠恢复至少48至72小时后再进行下一步操作。 
		注意：预先给予的缓释型布托啡诺（Bup-SR）药效可持续达72小时，通常无需额外镇痛。但如有必要（如小鼠出现嗜睡、拒食、毛发蓬乱等情况），仍应追加镇痛药物。若手术部位出现术后感染征象（如红肿、压痛、异常痛觉、痛觉过敏、痛觉超敏或化脓），或小鼠表现出对患区的保护性行为，应实施安乐死。若癌细胞成功注入脑脊液（CSF），中枢神经系统内将在1至2周内出现软脑膜转移（LMD）及肿瘤进展（具体时间取决于所用CTCs类型或细胞系）（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠Ommaya装置的组装与植入
<ol>
	<li>实验台准备
	<ol>
		<li>对实验台表面进行消毒。在台面上铺上蓝色覆盖物，并备齐图2中所示的所有已灭菌工具和耗材。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术前操作
	<ol>
		<li>给予镇痛剂（Bup-SR），并按照第1.2节所述保持无菌操作技术。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠Ommaya储液囊的手术植入
	<ol>
		<li>使用25 G（外径0.51 mm）微型注射端口和1 mm间隔盘组装小鼠Ommaya注射装置。使用无菌氰基丙烯酸酯粘合剂固定，确保金属导管约2.5 mm深度插入右侧大脑半球（图3A-C）。 
		注意：本实验室已开发出一种磁共振成像（MRI）兼容的小鼠Ommaya原型，其微型注射端口与间隔盘已通过3D打印集成于一体（图3D）。该一体化版本已通过MRI测试，可省去组装步骤，节省操作时间。</li>
		<li>使用2-3%异氟烷麻醉小鼠，直至翻正反射消失。进一步通过尾部和/或足垫夹捏反射检查，确认麻醉状态。</li>
		<li>剃除小鼠头部腹侧全部毛发，并按照前述1.2.3步骤所述的无菌技术准备皮肤。将小鼠固定于立体定位仪中，通过鼻罩持续给予异氟烷；将异氟烷浓度降至1.5%。轻轻收紧耳杆以固定头部，并涂抹眼用润滑剂覆盖小鼠眼睛。</li>
		<li>做一约3 mm的小切口，随后钝性分离皮下组织以暴露颅骨。使用浸有双氧水的棉签擦干颅骨表面。</li>
		<li>在颅骨上钻孔，孔位位于前囟（bregma）后方0.5 mm、侧方1.1 mm处——前囟是颅骨上冠状缝与矢状缝垂直相交的解剖学标志点（图3A）；另钻一个直径0.9 mm的孔以暴露硬脑膜。移开微型钻头，在植入注射端口前，轻轻刮擦骨孔周围区域，将注射端口（插入深度约2.5 mm）用无菌氰基丙烯酸酯粘合剂固定于颅骨上。在注射部位周围使用4-0非吸收性尼龙缝线，采用间断缝合或荷包缝合方式缝合固定&#160;11。</li>
		<li>术后将小鼠单独饲养于独立笼具中以促进恢复。 
		&#8203;注意：若将多只术后恢复期小鼠共同饲养于同一笼中，小鼠Ommaya装置可能因频繁相互触碰而脱落。建议在药物疗效试验期间，将植入小鼠Ommaya装置的小鼠单独饲养（或每笼不超过2只）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 小鼠Ommaya治疗
<ol>
	<li>使用小鼠Ommaya给药
	<ol>
		<li>用2-3%异氟烷麻醉小鼠，直至其无翻正反射迹象。进一步通过检查尾部和/或足垫夹捏反射，确认麻醉维持状态。</li>
		<li>使用端口注射适配器和Hamilton注射器接触小鼠Ommaya。用镊子夹住微型注射端口的顶部，将注射端口适配器轻轻完全插入端口的隔膜中。 
		注：注射端口适配器以最小化死腔的方式刺穿端口隔膜，从而可通过电动注射泵实现精确控制的注射（图4A）。在麻醉状态下，以1 µL/min的流速注射靶向/新型治疗药物。根据研究者的判断，在规定的时间间隔（每日/每周）内给予治疗，持续一定时间（数周/数月）。 
		&#8203;最佳注射体积为3至7 µL，因为小于&#60; 3 µL的体积不可靠，而大于&#62; 7 µL的体积可能造成过高压力。Hamilton注射器的容量可根据每组治疗小鼠的数量选择10至100 µL。预先将适当体积的药物装入Hamilton注射器，可避免重复更换注射器，从而最大限度减少误差。建议每个治疗组专用一支Hamilton注射器。</li>
		<li>完成注射后，用镊子将小鼠Ommaya从注射端口适配器上分离，并将小鼠放回笼中恢复，具体操作如上文步骤1.3.7所述。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安乐死
	<ol>
		<li>通过压缩气罐来源的二氧化碳（CO2）吸入法对小鼠实施安乐死。使小鼠暴露于逐渐增加浓度的CO2中（即，以每分钟10%至30%的腔室体积置换率为宜），以避免或最小化不适或痛苦。持续观察小鼠，直至确认心肺呼吸运动完全停止。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chamberlain, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomeningeal+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Leptomeningeal metastasis.</a> Current Opinion in Neurology. 22 (6), 665-674 (2009).</li>
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<li>Shackleford, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+and+bolus+intraventricular+topotecan+prolong+survival+in+a+mouse+model+of+leptomeningeal+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Continuous and bolus intraventricular topotecan prolong survival in a mouse model of leptomeningeal medulloblastoma.</a> PLoS One. 14 (1), 0206394(2019).</li>
</ol>

Peter Forsyth 在提交本研究之外，担任 Abbvie Inc.、Bayer、Bristol Meyers Squib、BTG、Inovio、Novocure、Tocagen 和 Ziopharm 的顾问委员会成员。其他所有作者均无任何利益冲突需要披露。

本文描述了小鼠Ommaya装置作为一种可靠的模型，可在软脑膜转移（LMD）及其他中枢神经系统相关疾病的临床前模型中，实现向脑脊液（CSF）腔内重复给予抗癌药物。在装置仍连接的情况下，可从小鼠体内采集脑脊液样本而无需中断实验。这种直接靶向治疗的异种移植模型，是开发和验证LMD合理治疗策略的重要步骤。从枕大池注射到出现LMD初始症状的时间，因癌细胞类型不同而有所差异。软脑膜转移及中枢神经系统转移通常在循环肿瘤细胞（CTC）接种后约1至2周开始形成。若使用增殖能力极强的癌细胞系，转移可能在&#60;7天内发生。在此情况下，由于肿瘤生长引起的血管化可能使小鼠Ommaya装置的植入变得困难。解决该问题的一种方法是减少注入脑脊液腔的癌细胞数量，从而延长肿瘤发育前的时间窗口。此外，本方案已优化为在枕大池注射后不超过72小时完成小鼠Ommaya装置的植入，以确保小鼠有足够时间在首次治疗前从手术中恢复。研究人员应在规划治疗方案前，计算循环肿瘤细胞在异种移植模型中的生长速率。
尽管存在其他直接脑室内给药方法，例如使用渗透压泵系统或脑室内（ICV）推注给药，如先前所述9，但使用小鼠Ommaya模型具有多项优势。例如，脑室内推注给药为单次给药，而小鼠Ommaya模型则可在任意时间进行多次给药，无论是单一药物治疗还是联合治疗。渗透压泵的设计可持续工作14、28或42天，之后需要更换，若使用体型较小的小鼠并植入较小的泵，则可能需要更频繁地更换。更换渗透压泵需进行手术操作，这会增加荷瘤小鼠的应激反应。而只要装置保持完整，小鼠Ommaya模型在长期实验中无需更换，从而也减少了因更换泵所导致的潜在实验变异性9。实验小鼠中植入的Ommaya装置保持完整超过42天，这一持续时间足以支持长期治疗方案的实施。
既往研究结果表明，脉冲式间歇性向脑脊液（CSF）给药在治疗软脑膜转移（LMD）方面比通过输注进行的持续药物递送具有更好的疗效13。使用渗透泵系统无法实现重复的单剂量注射。每次注射后，没有简便方法可清除残留的滞留液体。此外，渗透泵仅限于递送相容性混合药物或单一药物，且通常需要较大体积的药物制剂以维持持续输注。相比之下，小鼠Ommaya储液器专为精确的微量注射而设计，每次注射量可低至3至7 µL，且无需考虑死腔体积，对研究人员可使用的药物类型也无限制，包括免疫细胞治疗。若某种样本极为珍贵，小鼠Ommaya还可最大限度减少试剂浪费，提高资源利用率。对于需要多次给予抗癌治疗的任何治疗方案，小鼠Ommaya操作简便，与反复通过手术途径或穿刺针直接进入脑脊液的传统方法相比，其感染风险和手术并发症风险极低。小鼠Ommaya使研究人员能够灵活调整药物浓度和给药频率，并可根据研究需求评估靶点调控情况以及研究持续时间。
小鼠Ommaya装置的一个局限性在于，研究人员可能会发现将其植入体型较小的小鼠体内存在困难。因此，最好使用至少8至10周龄的小鼠。如果在植入过程中未将装置牢固固定于颅骨，或粘合剂脱落，或小鼠对其进行了摩擦性破坏，则在治疗试验期间可能发生小鼠Ommaya装置脱落的情况。当多只小鼠被饲养在同一笼具中时，后一种情况更常发生。因此，建议在治疗期间，每笼最多饲养两只植入小鼠Ommaya装置的小鼠。本方案经过改进，在间隔器上使用氰基丙烯酸酯无菌粘合剂，该粘合剂被证实是将间隔器牢固粘附于颅骨表面并防止小鼠Ommaya装置脱落的最有效胶水。实验结果表明，通过小鼠Ommaya进行直接鞘内治疗的LMD小鼠生存期显著延长。可安全注射单微升体积的药物，绕过血脑屏障，从而减少药物制备量。最重要的是，在HER2抗体免疫治疗研究中被治愈的中枢神经系统转移小鼠至今仍保持健康状态。
一项与制造商的合作旨在为LMD的PDX模型开发一种与MRI兼容的小鼠Ommaya装置。由于该原型版本集成了垫片，无需组装，可更好地贴合颅骨。该原型的一个局限性是，尽管装置本身与MRI兼容，但在植入部位会产生阴影，从而降低图像的可视性，影响定量分析。当离体CTC取样受限且无法预先标记细胞时，这种MRI兼容版本是一种良好的替代工具。LMD异种移植模型与小鼠Ommaya技术的结合，有助于研究绕过血脑屏障（BBB）的直接靶向药物疗效。这些体内&#160;研究的结果在临床上具有重要意义，可为LMD患者设计合理的治疗策略提供依据。

软脑膜病（LMD）是一种侵袭性的中枢神经系统晚期转移性疾病，肿瘤细胞通过进入脑脊液（CSF）并浸润脑和脊髓表面而发生扩散1。导致LMD最常见的癌症包括乳腺癌、肺癌以及黑色素瘤2。LMD可引起多种神经系统症状和体征，如头痛、颅神经麻痹、颈项强直和神经根病变。LMD患者的预后通常极差（平均生存期以周计算），且最终均导致死亡3,4,5,6,7。手术、放疗和全身化疗的治疗手段仅为姑息性治疗。由于血脑屏障（BBB）或脉络丛处的血-脑脊液屏障完整，导致药物难以充分渗透进入脑脊液，因此针对LMD的全身治疗可能失败1。
因此，将癌症治疗药物（例如，药物和基于抗体的治疗，包括检查点抑制剂和细胞疗法）直接注入脑脊液（CSF）可能克服这一限制8。通过植入头皮下的奥马耶储液囊（Ommaya reservoir），可实现对患者的脑脊液进行接触和取样。该装置可在无需进行腰椎穿刺的情况下，用于给予抗癌药物（例如甲氨蝶呤和曲妥珠单抗）以及采集脑脊液用于诊断性研究（例如，对软脑膜转移进行细胞学诊断以监测治疗反应）。已设计出一种小鼠用奥马耶储液囊，以模拟临床上使用的装置。该储液囊需要组装穿刺端口和间隔部件，并对小鼠插管技术进行改良，从而使装置在整个药物研究期间保持永久完整。该装置被命名为&#34;小鼠奥马耶储液囊（Murine Ommaya）&#34;。
与渗透压输注泵技术相比，后者需要准备过量的液体体积以填充管路中的空腔，并需频繁注射进行持续输注9，而小鼠Ommaya装置可最大限度减少药物溶液的浪费。该装置允许使用哈密尔顿注射器、微型接入端口和自动注射器，在任意时间向脑脊液（CSF）中高效给予多种单次小剂量治疗药物（3–7 µL）。通过成像技术，可实时评估试验药物对软脑膜转移瘤（LMD）的疗效。利用该方法，可对多种化疗药物、抗体以及细胞免疫疗法（单独或联合使用）在LMD模型中的作用进行测试，从而将体内&#160;研究结果转化为针对患者的合理治疗策略。为进一步提升LMD患者来源异种移植（PDX）模型的成像能力，研究人员与制造商合作开发了一种磁共振成像（MRI）兼容型小鼠Ommaya装置，该装置无需组装，开箱即可使用。MRI功能具有显著优势，尤其适用于那些脑脊液中循环肿瘤细胞（CTCs）数量有时受限、且常难以对CTCs进行预标记的PDX模型。
本文描述了一项详细的实验方案，首先通过注射循环肿瘤细胞（CTCs）建立小鼠软脑膜转移（LMD）模型。随后，外科植入小鼠Ommaya储液囊，并通过该装置进行多次药物治疗。为验证概念并进行示范，开展了一项体内平行对照实验，其中给予小鼠一种名为克隆7.16.4的小鼠源性人表皮生长因子受体2（Her2）抗体（即曲妥珠单抗的人类对应物）10。该抗体通过小鼠Ommaya储液囊（直接靶向或鞘内治疗）或腹腔注射（全身性治疗）途径递送，以靶向Her2+乳腺癌细胞。结果显示，接受直接鞘内免疫治疗的LMD小鼠生存期显著长于接受相同全身性治疗的小鼠。通过小鼠Ommaya储液囊治疗的小鼠，其中枢神经系统转移灶在治疗第三周的第三次给药后几乎完全消退，从而显著改善了总体生存率。

<table><tbody><tr><td>1 毫米间隔盘</td><td>Alzet, Durect Corporation</td><td>#0008670</td><td>仅间隔盘</td></tr><tr><td>4-0 Ethilon 尼龙缝线</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>自动注射泵</td><td>Harvard Syringe Pumps（或任意供应商）</td><td>#70-4505</td><td>Pump 11 Elite</td></tr><tr><td> bead 消毒器</td><td>Braintree Scientific Inc.（或任意供应商）</td><td>#GER 5287-120V</td><td>Germinator 500</td></tr><tr><td>缓释型丁丙诺啡（Bup-SR）</td><td>Zoopharm</td><td></td><td>受美国缉毒局管制</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯无菌粘合剂</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>气体吸入麻醉系统</td><td>VeteEquip</td><td>#901812</td><td>COMPAC5</td></tr><tr><td>Hamilton 微量注射器</td><td>Hamilton</td><td>10、25、50 和 100 &amp;mu;L</td><td>用于小脑延髓池注射的 30 G 针头</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 200 成像系统</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>带光源放大镜</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>微型钻机</td><td>Stoelting（或任意供应商）</td><td>#51555M</td><td></td></tr><tr><td>MRI 成像</td><td>Bruker</td><td>BioSpec 系列</td><td>可选</td></tr><tr><td>小鼠 Ommaya 储液囊（MRI 兼容）原型</td><td>Instech Laboratories, Inc.</td><td>#VAB620-25MRI-3.3</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td>0.1 毫米无菌过滤</td></tr><tr><td>PinPort 注射器</td><td>Instech Laboratories, Inc.</td><td>#PNP3M-50</td><td></td></tr><tr><td>PinPort 接口</td><td>Instech Laboratories, Inc.</td><td>#1-PNP3F28-50</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物外科器械（剪刀、镊子）</td><td>Roboz Surgical Instrument（或任意供应商）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Stoelting（或任意供应商）</td><td>#51730M</td><td></td></tr><tr><td>无菌蓝色手术纸/铺巾</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td>n/a</td></tr><tr><td>无菌棉签</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究直接靶向治疗软脑膜疾病的可植入式小鼠颅内导管异种移植模型

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

软脑膜疾病（LMD）是一种罕见的中枢神经系统（CNS）转移形式，累及脑脊液（CSF）。导致LMD最常见的癌症为乳腺癌、肺癌和黑色素瘤。被诊断为LMD的患者预后极差，通常仅能存活数周至数月。系统性治疗对LMD疗效不佳的可能原因之一是由于完整的、相对不通透的血脑屏障（BBB）或脉络丛处的血-脑脊液屏障，导致药物难以在CSF中达到有效的治疗浓度。因此，通过鞘内或脑室内直接给药可能克服这些屏障。本研究团队已建立一种模型，可实现治疗剂（如药物、抗体和细胞治疗）的长期递送，并可重复采集CSF样本，以测定CSF中的药物浓度及靶点调控情况（当小鼠肿瘤微环境为靶向目标时）。该模型相当于临床上使用的磁共振成像兼容的Ommaya储液囊，固定于颅骨上，已被命名为 &#34;小鼠Ommaya&#34; 作为一种治疗概念验证，通过小鼠奥马耶装置将人表皮生长因子受体2抗体（克隆7.16.4）递送至脑脊液中，以治疗源自人表皮生长因子受体2阳性乳腺癌的软脑膜转移小鼠模型。小鼠奥马耶装置采用微型接入端口，可提高药物递送效率，避免过量药物浪费，且不影响脑脊液取样用于分子与免疫学研究。小鼠奥马耶装置在软脑膜转移实验模型中测试新型治疗药物方面具有重要应用价值。

在小鼠中，脑脊液的总体积约为 35–40 µL，生成速率为约 350 nL/min，每天更新 12–13 次12。为了观察注射路径，通过小鼠 Ommaya 模型注入 2% 伊文思蓝，随后分别等待 15 分钟和 30 分钟后取脑进行分析。染料在 15 分钟内成功渗入脑室和脑组织，30 分钟内可在脊髓上观察到染料分布（图 4）。
为验证概念，将表达荧光素酶标记的 Her2+ TUBO 乳腺癌细胞系通过小脑延髓池内注射接种于 BALB/c 小鼠，并植入小鼠 Ommaya 贮液囊。接种癌细胞约 1 周后，小鼠开始出现软脑膜转移（LMD）。这些小鼠每周接受一次抗 Her2 抗体免疫治疗，持续最多 4 周，给药途径分别为通过腹腔注射进行全身治疗，或通过小鼠 Ommaya 贮液囊进行鞘内给药（图 5A）。
尽管未经治疗的小鼠在第19天全部死亡，但所有通过小鼠Ommaya装置接受鞘内治疗的小鼠均存活下来（P = 0.004）。到第4周时，肿瘤完全消退。与接受全身治疗的小鼠相比，鞘内治疗组小鼠的总体生存期显著更长，尽管全身治疗对治疗软脑膜转移具有一定疗效（图5B）。
<img alt="向小鼠小脑延髓池注射循环肿瘤细胞；生物发光成像；癌细胞迁移研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62033/62033fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：在小鼠异种移植模型中向小脑延髓池注射循环肿瘤细胞，用于研究软脑膜疾病及中枢神经系统转移。（A）示意图显示小脑延髓池的位置及脑脊液穿刺注射部位，循环肿瘤细胞通过Hamilton注射器注入。（B）注射循环肿瘤细胞2周后，发生软脑膜疾病及中枢神经系统转移（脑部及沿脊髓分布）的小鼠代表性IVIS成像图。细胞标记有荧光素酶报告基因。注射生理盐水的对照组动物未形成肿瘤（n = 3），实验重复三次。缩写：CTCs = circulating tumor cells（循环肿瘤细胞）；IVIS = in vivo imaging system（活体成像系统）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62033/62033fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于精密操作的实验室显微外科装置，包含放大镜等器械。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62033/62033fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：小鼠Ommaya储液囊植入术工作站设置示例。（1）气体麻醉机/蒸发器。（2）覆盖在立体定位仪上的无菌蓝色铺巾。（3）立体定位装置（支架/平台、耳杆、鼻部麻醉罩）。（4）微型钻。（5）带光源的放大镜。（6）无菌棉签及盛有无菌生理盐水的冲洗容器。（7）过氧化氢。（8）玻璃珠灭菌器。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62033/62033fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠Ommaya系统示意图与MRI图像、手术设置、定位颅骨前囟用于脑科学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62033/62033fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：小鼠Ommaya装置的植入。（A）示意图，箭头指示颅骨上前囟（bregma）的位置，以及使用微型钻头从前囟向后0.5 mm、外侧1.1 mm处钻孔的大致位置。（B）小鼠Ommaya装置由金属套管和一个1 mm间隔器组合而成，作为用胶水固定于颅骨的基础结构。（C）植入小鼠Ommaya装置后的小鼠代表性图像；这些小鼠在进行任何注射前均需监测其是否精神状态良好、警觉且反应灵敏。（D）一种原型磁共振成像兼容的小鼠Ommaya装置，以及小鼠Ommaya植入后的代表性脑部磁共振成像图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62033/62033fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠脑部注射实验；解剖结果；染料随时间扩散情况；比较分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62033/62033fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：利用小鼠Ommaya导管进行脑室内（中枢神经系统）注射。（A）通过小鼠Ommaya导管进入脑室及中枢神经系统的注射示意图。小鼠在注射过程中保持麻醉状态。图示中，小鼠Ommaya导管连接至微型端口，并与预充式Hamilton注射器相连。注射使用自动注射装置，设定输注速率为1 µL/min，注射体积为5–7 µL。图中显示了经伊文思蓝染料注射后的小鼠脑组织。圆圈标示Ommaya导管的植入位置，脑组织表面未见染料外漏。脑组织横切面显示侧脑室充满染料，但染料未渗透至脑实质。（B）伊文思蓝染料注射后15分钟和30分钟的小鼠脑组织图像。染料在15分钟时已进入脑组织，并在30分钟时开始沿脊髓循环分布。共使用5只小鼠，其中4只用于染料示踪观察，1只为对照组。该实验重复三次。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62033/62033fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="乳腺癌小鼠模型研究；治疗比较，生存曲线；全身性治疗与靶向治疗。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62033/62033fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：使用小鼠Ommaya装置进行直接靶向免疫治疗可提高乳腺癌相关软脑膜疾病小鼠的总体生存率。 （A）将表达荧光素酶报告基因的人表皮生长因子受体2阳性TUBO细胞（一种小鼠乳腺癌细胞系）注射到BALB/c小鼠体内。小脑延髓池注射3天后，植入小鼠Ommaya装置。注射1周后，小鼠开始出现软脑膜疾病（LMD）。LMD小鼠分别接受人表皮生长因子受体抗体的全身性（腹腔内注射）治疗或鞘内（通过小鼠Ommaya装置）直接靶向治疗。给药频率为每周一次，持续最多4周。与未治疗小鼠相比，接受免疫治疗的小鼠生存时间显著延长。使用小鼠Ommaya装置的小鼠在第4周时疾病完全缓解，最终实现治愈。（B）这些小鼠的中位生存期也显著更长（Mantel-Cox检验；P = 0.004；每组治疗n = 5只小鼠），且总体生存率优于全身性治疗的LMD小鼠。缩写：LMD = 软脑膜疾病；IP = 腹腔内。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62033/62033fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文描述了一种在功能上类似于患者体内奥马耶储液囊的鼠类异种移植模型。我们开发了这种鼠类奥马耶模型，用于研究针对普遍致命的软脑膜疾病的新型治疗方法。

软脑膜病（Leptomeningeal disease, LMD）是一种少见的中枢神经系统（CNS）转移类型，累及脑脊液（CSF）。最常见的原发肿瘤类型……

小鼠Ommaya装置模拟了临床使用的Ommaya储液囊，可使研究人员在临床前模型中测试多种针对脑转移瘤和普遍致死性软脑膜疾病的直接靶向疗法。该技术的优势在于，研究人员可将微升级别的药物直接递送至脑脊液中，从而治疗中枢神经系统转移瘤，同时绕过血脑屏障。本小鼠Ommaya植入方案适用于具备立体定向手术经验和无菌操作技术训练的研究人员或技术人员，这些技能对于确保该操作的成功至关重要。演示该操作的人员为南佛罗里达大学比较医学部的 Margie Baldwin 和 Michelle Danielson，以及莫菲特癌症中心与研究所 Peter Forsyth 博士实验室的高级研究助理 Vincent Law。首先，以每千克体重一毫克的剂量，对小鼠进行皮下注射缓释布托啡诺。麻醉小鼠后，为其进行手术准备。剪除手术部位及其周围足够范围的毛发，以防止毛发污染切口区域。剃除头部整个表面的毛发，并采用无菌技术进行皮肤准备。随后，使用杀菌性皮肤消毒剂由中心向外围擦拭手术区域，充分浸润后，待其自然干燥。调整动物体位，确保脊柱与小脑延髓池保持水平。在对尾部施加轻微牵引的同时，于尾根部用胶带固定尾部。使用无菌手术巾或带粘性的无菌塑料手术单覆盖手术区域，以防止污染。将颈部完全伸展，从耳廓之间稍上方开始，用手术剪刀尖端沿枕骨向下施加轻微压力，进行切割。在可触及的凹陷处稍上方做一条3至5毫米长的正中切口。用30号Hamilton注射器吸取5微升细胞悬液。使用尖端为1至2毫米的钝头镊子轻轻按压小脑延髓池。将镊子尖端闭合后插入，然后在对硬脑膜施加向下压力的同时打开镊子。重复进行钝性分离，直至清晰辨认出硬脑膜并暴露区域内的相关血管可见。用镊子夹住并撑开以牵拉周围肌肉组织，将一根30号无芯针头插入硬脑膜下方，观察针尖斜面，确保针头仅伸入至斜面稍前方即可。缓慢推动注射器活塞，将细胞注入硬脑膜下方。若发现注射部位有渗漏，可用棉签轻轻按压。使用伤口夹或少量皮肤黏合剂闭合皮肤。术后第一周内每天监测小鼠状况。若小鼠出现疼痛或不适症状，根据兽医咨询和指导，可皮下注射卡洛芬，剂量为10毫克/千克，每12至24小时一次，最多持续五天。使用25号微型注射端口和一个1毫米间隔盘组装小鼠Ommaya注射装置。采用无菌氰基丙烯酸酯粘合剂，确保金属套管插入右侧大脑半球约2.5毫米，并按照无菌技术准备皮肤。做一小切口切开皮肤，随后钝性分离皮下组织，暴露颅骨。使用浸有双氧水的棉签擦拭颅骨进行干燥。在冠状缝后方0.5毫米、外侧1.1毫米处钻一个直径0.9毫米的颅骨钻孔，以暴露硬脑膜。移开微型钻头，并轻轻划痕钻孔周围紧邻的骨组织。使用氰基丙烯酸酯无菌粘合剂将注射端口固定在颅骨上，并插入至约 2.5 毫米深度。采用 4-0 非吸收性尼龙缝线，以间断缝合或荷包缝合方式缝合切口。术后将小鼠单独饲养于笼中以供恢复。给药时，使用端口注射适配器和汉密尔顿注射器接触小鼠Ommaya储液囊。用镊子夹住微型注射端口的顶部，将注射端口适配器轻轻完全插入端口隔膜中。注射完成后，用镊子将小鼠Ommaya储液囊从注射端口适配器上分离。为了可视化注射路径，通过小鼠Ommaya模型注入2%伊文思蓝。染料在15分钟内成功渗透至脑室和脑组织。30分钟后，染料在脊髓上变得可见。作为概念验证，将表达荧光素酶标记的 Her2+ TUBO 乳腺癌细胞系通过小脑延髓池内注射接种于 BALB/c 小鼠，并植入小鼠 Ommaya 贮液囊。接种后约一周，小鼠开始出现软脑膜转移（LMD）。这些小鼠接受每周一次、持续最长四周的抗 Her2 抗体免疫治疗，给药途径分别为通过腹腔注射进行全身治疗，或通过小鼠 Ommaya 贮液囊进行鞘内给药。未经治疗的小鼠在第19天前全部死亡，而通过小鼠Ommaya囊接受鞘内治疗的小鼠全部存活。到第四周时，肿瘤完全消退。与接受全身治疗的小鼠相比，接受鞘内治疗的小鼠总体生存期显著延长。在进行该操作时，放置小鼠Ommaya储液囊前必须确保颅骨完全干燥。使用少量胶水，并将小鼠Ommaya储液囊固定于颅骨上约10秒，以确保其粘附牢固。通过该技术，研究人员可在小鼠模型中探索多种具有临床相关性的抗癌药物，从而为中枢神经系统转移患者设计合理的治疗策略。

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