iPSC-巨噬细胞死亡神经母细胞的体外定量成像检测
2021年2月14日
神经退行性疾病与受管制的微胶质功能障碍有关。本文概述了iPSC巨噬细胞对神经母细胞的体外测定。定量显微镜读数用于活细胞延时成像和固定细胞高含量成像。
这种体外成像检测可以量化不同细胞治疗或不同基因型对微胶质噬菌体形成的影响。使用两种与神经退行性疾病相关的细胞类型，我们使用死神经母细胞来治疗噬菌体货物，这些细胞的制备方式可以通过大型高含量成像屏幕轻松、廉价地放大。在 2 类生物安全柜中，通过吸气介质分离 SH-SY5Ys。
加入4毫升细胞分离缓冲器，并立即取出缓冲器，使小于1毫升的细胞保持薄膜涂层。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育2至3分钟。然后在 10 毫升的 Hbss 到 T - 75 烧瓶。
并将 SH-SY5Ys 移入 15 毫升圆锥形离心机管中。离心机在 400xG 下 5 分钟。吸气超高分子，并重新悬浮在2毫升酚无红EPES缓冲介质的细胞，确保在固定前分解团块。
通过在管子中加入2毫升4%功率的甲醛，在室温下孵育10分钟，偶尔轻轻搅拌，修复细胞。在管子中加入 10 毫升 HBSS。然后，离心机在1200xG为7分钟。
吸气超高分子，并重新暂停细胞颗粒在2毫升酚无红 HEPES 缓冲介质。将 100 万个 HS-SY5Y 细胞计数并切除到 2 毫升低蛋白结合管中。将总体积达到 300 到 500 微升，并配备无酚红色 HEPES 缓冲介质。
然后在37摄氏度的水浴中短暂加热管子。根据制造商的说明重组pH敏感红色荧光染料STP酯。然后每百万SH-SY5Y细胞添加12.5微克染料。
轻拂管子轻轻混合。并在室温下孵育管子30分钟，不受光线照射。在 1200xG 下加入 1 毫升 HBSS 和离心机，7 分钟 4 摄氏度。
丢弃超高纳特。用2毫升HBSS清洗。将苯酚无红大噬体介质中的细胞颗粒重新悬浮到每毫升0.2至120万个细胞的浓度，使50微升含有1万至6万个细胞。
在生物安全柜中，准备一种深红色荧光细胞渗透性苏奇尼米尔酯反应染料在宏噬细胞介质中的解决方案。加入 Hoechst 33342，在水浴中将工作溶液加热至 37 摄氏度。通过用多通道移液器将细胞超导体插入无菌储液池，轻轻吸气 iPSC 巨噬细胞介质。
使用多通道移液器将每口染料溶液的 70 微升添加到 iPSC 巨噬细胞中。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育1小时。修复苯酚无红大噬体介质中的实验性处理。
孵化后，用多通道移液器轻轻吸气iPSC巨噬体介质，每口井加入100微升HBSS。通过轻柔的管道立即取出 HBS。然后加入100微升的酚红色无宏噬体介质，加上单独的井中的实验处理。
在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育10分钟至1小时。使用多通道移液器从液体边缘的每口井的两侧加入每口井50微升标记的SH-SY5Ys。然后在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育3至5小时。
咽喉培养后，用多通道移液器轻轻吸气细胞超分子并丢弃。用 100 微升 PBS 洗一次。然后通过添加100微升2%功率甲醛，并在室温下孵育15分钟来修复细胞。
吸气井，加入100微升PBS。要么直接使用高含量显微镜进行成像，要么用板封口和铝箔盖住，并将板材存储在 4 摄氏度，直到需要为止。打开高含量成像显微镜，打开图像捕获软件。
通过单击屏幕顶部的 LOAD"图标，将检测板加载到显微镜中。选择设置"选项卡。在左上框的下拉菜单中，选择合适的板型。
自动对焦选项:两个峰值"目标:40倍水，NA 1.1"聚焦"模式，和宾宁1。通过设置菜单在使用前冲洗 40 倍水目标。在通道选择框中，使用加号图标添加通道 DAPI、Alexa 647 和 Alexa 568。
将这些设置为在一微米的单平面上测量。优化时间和功率设置，提高检测板的染色效率。通过单击通道序列以分离通道，确保通道不会同时测量。
在导航和定义布局下，选择测量井，每口井选择 9 到 12 个字段。设置期间，单击板图上的代表性字段。然后检查每个测量通道，以确保存在污渍，并通过调整通道偏移来聚焦图像。
要将数据上传到服务器进行远程分析，请单击在线作业"框"和相关屏幕名称。通过单击"保存"按钮来保存检测协议，并单击顶部的"运行实验"选项卡。命名实验板，然后点击开始"活细胞时间活噬细胞病检测显示，与10， 每口井000 SH-SY5Ys，每细胞的噬菌体颗粒数量随着时间的流向增加而线性增加，并且被细胞查拉辛D抑制约50%。 巨噬细胞， 和 Sh - sy5ys 在一个更拥挤的视野。
通过执行固定细胞高含量成像（包括噬菌体病的代表性图像）获得以下结果。增加SH-SY5Ys的数量导致每个细胞的噬菌体颗粒数量增加。噬细胞病检测使用几种抑制剂进行验证。
细胞查拉辛D和贾斯普拉基诺利德分别显著抑制了91%和90%的噬细胞增多症。巴菲洛霉素A1在咽喉病前1小时预孵育时，将咽细胞增多31%。在SH-SY5Y添加之前，在油井中加入重组附件5可显著减少30%的噬菌体病。
固定 SH-SY5Ys 我们被确认使用荧光附件 5 探头暴露磷脂蛋白。而活的 Sh - sy5ys 对附件 5 污渍是负的。使用交错添加的咽喉货物测试了几次长度的噬菌体病持续时间，从1小时到5小时不等。
通过准备咽喉货物并并行染色 iPSC 巨噬细胞，可以缩短此原呼叫的总长度。如果您想这样做，请提前确定时间，并利用您的潜伏为未来的步骤准备解决方案。
概述
本研究利用体外成像分析技术，研究了iPSC衍生的巨噬细胞对神经母细胞瘤细胞的吞噬作用。该方法允许量化受各种处理影响的小胶质细胞活性，有助于更好地理解神经退行性疾病。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 小胶质细胞在神经退行性疾病过程中发挥着关键作用。
- 小胶质细胞功能的失调可能导致疾病进展。
- 吞噬作用是小胶质细胞的关键功能，影响细胞稳态。
- iPSC衍生的模型为人类相关疾病机制提供了相关见解。
研究目的
- 开发一个量化iPSC衍生巨噬细胞吞噬活性的分析方法。
- 评估不同处理对小胶质细胞吞噬作用的影响。
- 增强对神经退行性疾病中活跃细胞过程的理解。
所用方法
- 利用体外成像分析技术，结合活细胞时间跃迁和固定细胞高内容成像。
- 生物模型涉及iPSC衍生的巨噬细胞和神经母细胞瘤细胞。
- 应用实验处理以评估其对吞噬作用的影响。
- 关键步骤包括细胞准备、染色和成像参数分析。
主要结果
- 吞噬作用随时间线性增加，并受到细胞吟动蛋白D等处理的抑制。
- 每井中神经母细胞瘤细胞的数量越多，吞噬活性越高。
- 细胞吟动蛋白D和Jasplakinolide等抑制剂显示出显著的吞噬作用减少。
- 该分析方法展示了对小胶质细胞活性评估的稳健验证。
结论
- 本研究建立了一个可靠的分析方法用于评估小胶质细胞的吞噬作用。
- 研究结果为神经退行性疾病的潜在治疗干预提供了线索。
- 该方法使进一步探索小胶质细胞的作用和疾病机制成为可能。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative imaging of iPSC-macrophage phagocytosis of dead neuroblastoma cells provides a scalable, high-content assay for interrogating microglial efferocytosis relevant to neurodegenerative disease. This platform enables robust, reproducible evaluation of genetic and pharmacological modulators, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. Its adaptability and throughput position it as a critical tool for risk-adjusted portfolio advancement in neuroimmunology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of microglial efferocytosis across genetic backgrounds and treatments.
- Supports mechanistic de-risking by validating functional consequences of candidate targets or variants.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of neuroimmune pathways implicated in disease.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, scalable 96-well plate format for high-content imaging and screening.
- Provides reproducible, quantitative outputs suitable for small molecule or genetic variant evaluation.
- Enables assay adaptation for diverse phagocytic cargoes and cell types relevant to neurodegeneration.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro phagocytosis readouts with disease-relevant neuroimmune mechanisms.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of microglial function modulators.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, mechanistic data.
Pipeline & Workflow Integration
This assay bridges early discovery, target validation, and preclinical research by providing a quantitative, scalable platform for functional microglial assessment.
- Discovery Biology: Quantifies efferocytosis to clarify neuroimmune pathway involvement and target function.
- Screening: Standardizes high-content imaging for reproducible, scalable compound or variant evaluation.
- Analytics: Generates quantitative phagocytosis metrics for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Aligns in vitro functional outputs with disease-relevant neuroimmune endpoints.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol supports diverse phagocytic cargoes and cell types for broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroimmune target validation.
- Operational Value: Enables assay standardization, reproducibility, and high-throughput scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neuroimmune therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in iPSC culture, neuroblastoma cell handling, and high-content imaging.
- Demands access to automated microscopy and quantitative image analysis infrastructure.
- Standardization of cargo preparation and staining protocols is critical for reproducibility.
- Protocol is adaptable to other phagocytic cargoes and cell types with appropriate validation.
- Throughput and segmentation accuracy may be limited by cell density and imaging field crowding.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:41
Preparation of Dead SH-SY5Ys
2:03
Labeling of Dead SH-SY5Ys with pH-Sensitive Red Fluorescent Dye
3:18
Staining of iPSC-Macrophages
4:50
Fixed-Cell High-Content Imaging
7:28
Results: Imaging, Optimization and Validation of Phagocytosis Assay
9:16
Conclusion
