Name: iPSC-巨噬细胞死亡神经母细胞的体外定量成像检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 了解利用诱导多能干细胞来源巨噬细胞与pH敏感荧光标记神经母细胞瘤细胞进行体外定量成像检测小胶质细胞胞葬作用的方法。该高通量方案适用于神经退行性疾病研究中的吞噬功能筛选。

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作者感谢 Val Millar 博士和 Sohaib Nizami 博士在高内涵显微镜技术方面的协助，以及 Daniel Ebner 博士提供的高内涵显微镜使用权限。此外，作者感谢 Emma Mead 博士在检测方法开发方面的建议，以及 Cathy Browne 女士在诱导多能干细胞方面的支持。本研究由阿尔茨海默病研究英国牛津药物发现研究所（ARUK ODDI，资助编号 ARUK-2020DDI-OX）资助，牛津詹姆斯·马丁干细胞研究中心（S.A.C.）还获得了牛津马丁学社（LC0910-004）、帕金森病英国基金会纪念碑信托发现奖（J-1403）、英国医学研究理事会痴呆症研究平台干细胞网络设备基金（MC_EX_MR/N50192X/1）、合作项目 MR/N013255/1 和 Momentum MC_PC_16034 奖项的额外支持。

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<li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+brain+myeloid+expression+profiles+reveal+distinct+microglial+activation+states+and+aspects+of+Alzheimer%27s+disease+not+evident+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

小胶质细胞具有多种重要功能，影响神经退行性疾病的起始与进展，包括对凋亡神经元的吞噬作用。小胶质细胞吞噬功能受损以及对突触的异常吞噬均与神经退行性疾病相关，但其潜在机制及因果关系尚不明确。4,23本文介绍了一种用于检测iPSC来源的巨噬细胞（iPSC-巨噬细胞）对凋亡细胞吞噬作用的吞噬功能检测方法，该方法可采用活细胞延时成像、固定细胞高内涵显微镜检测，或在同一实验中结合两种读出方式。这种灵活性使得该检测既可用于在少量孔中随时间追踪单个吞噬事件，也可用于包含多种条件或处理的高内涵筛选。由于高内涵检测是在单一时间点进行固定检测，因此可同时制备多个检测板。该高内涵检测方法在表征携带疾病相关遗传变异的巨噬细胞/小胶质细胞，或筛选影响吞噬功能的小分子抑制剂方面具有潜在应用价值。该检测方法亦可轻松适配于其他小胶质细胞模型，甚至可能用于星形胶质细胞的吞噬研究。此外，该吞噬检测可与活细胞成像染料进行多重联用，例如线粒体、钙离子或活性氧（ROS）指示剂；并在固定后进行目的蛋白的免疫荧光染色。相较于现有使用凋亡神经元细胞的吞噬检测方法，本方案的主要优势在于吞噬底物的制备过程相对简便快速，且可获得均一的产物。其他方法通常需使用S-亚硝基-L-半胱氨酸处理神经元或SH-SY5Y细胞2小时以诱导凋亡25，冈田酸处理3小时22，4-16 小时佛波酯（staurosporine）处理26,27,28,29 或紫外线照射24小时30，可能导致细胞处于凋亡的不同阶段。据作者所知，此前尚未有研究描述活细胞成像和高内涵成像的检测结果。使用多聚甲醛固定制备吞噬性货物的主要局限在于，其无法完全模拟凋亡过程，因为固定会阻止细胞裂解为凋亡小体，而体积更小的凋亡小体更可能被快速吞噬。目前尚不清楚固定对核苷酸分泌的影响如何。 &#34;找到我&#34; 信号（如ATP、UDP），这些信号可吸引吞噬细胞。与凋亡细胞类似，固定的SH-SY5Y细胞对碘化丙啶表现出一定的膜通透性。膜通透性与信号分子的释放相关 &#34;找到我&#34; 信号；然而，这一现象在固定的 SH-SY5Y 细胞中尚未被研究，且如果核苷酸释放过快，在 SH-SY5Y 细胞添加至 iPSC 来源的巨噬细胞之前，就可能已被洗脱。
该实验方案的第一步关键操作是使用对pH敏感的红色荧光染料的STP酯对死亡的SH-SY5Y细胞进行染色。该染料可快速且共价地与死亡SH-SY5Y细胞表面的游离伯胺基团发生反应。染色时间无需优化；但在标记前处理染料时需格外小心。标记反应不得在含有游离胺的缓冲液中进行。此外，若将DMSO储存液稀释至低温水相缓冲液中或终浓度较高时，存在沉淀风险。沉淀物在显微镜下会呈现为致密的暗色颗粒。另外，该pH敏感性染料溶液易吸附于普通塑料离心管管壁，且难以彻底洗脱；因此，建议在标记步骤中使用低吸附性离心管。使用pH敏感性染料而非永久性荧光染料，有助于区分被吞噬的颗粒与邻近细胞质膜的颗粒。由于该染料在中性pH下仍具有一定的荧光信号，因此需将吞噬性货物颗粒与iPSC来源巨噬细胞的密度控制在足够低的水平，以实现准确的图像分割，同时又需保持足够数量以捕获大量吞噬事件。高内涵显微成像技术可在孔内货物颗粒中等密度（每iPSC来源巨噬细胞对应超过2个SH-SY5Y细胞）条件下准确识别吞噬作用。相反，由于显微镜在远红光谱范围内的灵敏度较低，在活细胞延时成像数据中对iPSC来源巨噬细胞的分割置信度较低，因此必须使用极低的货物密度以降低假阳性结果的发生概率（每两个iPSC来源巨噬细胞对应1个SH-SY5Y细胞）。应通过比较未处理组与细胞松弛素D处理组的实验结果，验证图像分割的准确性及货物密度的适宜性。在优化良好的实验体系中，细胞松弛素D处理应使每个细胞的平均荧光斑点数较未处理样本减少90%。
该实验方案中的另一个关键步骤是iPSC来源的巨噬细胞染色，这一步可使细胞在图像分析中被识别和分割，从而在计数时排除任何外部的SH-SY5Y细胞。推荐使用的染料具有细胞膜通透性，可在细胞质内转化为不溶性荧光产物，且可固定、无毒性（参见材料表）。该染色步骤已针对iPSC来源的巨噬细胞与高内涵成像吞噬实验的联用进行了优化，若使用其他细胞类型，建议重新进行优化。可延长细胞染色时间以增强不溶性荧光产物在细胞内的沉积。若对染料浓度进行优化，需注意避免有机溶剂载体达到毒性水平。
实验成功的第三个关键因素是数据分析。所提供的分析流程旨在提供指导而非强制规定，因为染色强度或细胞形态的差异可能降低现有流程在分割效果上的有效性。因此，需要进行一些优化，应使用适当的阳性和阴性对照对流程进行测试，且方案文本中已指明应优化的参数。阴性对照应包括一种条件：在加入SH-SY5Y细胞前，先用强效的吞噬抑制剂（如细胞松弛素D）预处理iPSC来源的巨噬细胞。另一个可能的阴性对照是在实验结束前10分钟，即固定前，将SH-SY5Y细胞加入未经处理的iPSC巨噬细胞孔中，该条件允许货物发生一定程度的沉降，但时间不足以产生可检测量的吞噬作用。吞噬事件被定义为位于iPSC巨噬细胞边界内的红色荧光物体，该边界由软件算法通过深红色荧光通道确定。如果细胞分割效果不佳（图2），则许多未被吞噬但靠近iPSC巨噬细胞的SH-SY5Y细胞可能会被错误地纳入分析，即产生假阳性结果。实现良好分割的最重要因素是对iPSC巨噬细胞进行严格清晰的界定。两种分析的分割均为自动完成，因此无法对每个细胞都实现完美分割；然而，可以参考少量测试图像，调整若干参数以使分割更趋优化。细胞松弛素D对照对于评估最佳分割至关重要，因为在该条件下若检测到大量吞噬事件，则表明分割效果不理想。理想情况下，应反复优化数据分析流程，直至在细胞松弛素D处理条件下，每细胞的吞噬事件数量比无抑制剂条件低80%-90%。
吞噬作用检测实验中最可能出现的问题包括：（1）阳性对照中pH敏感性荧光信号较弱，（2）实验结束时巨噬细胞分布稀疏或不均匀，或（3）分析过程中将未被吞噬的SH-SY5Y细胞误判为阳性，导致假阳性数量偏高。针对pH敏感性荧光信号弱的问题，首先应检查SH-SY5Y细胞染色后形成的细胞沉淀是否呈现明显的紫红色。若颜色较浅，需确保使用新鲜的染料储备液，确认标记缓冲液不含胺类物质，在染色前对SH-SY5Y细胞额外进行一次洗涤，核对染色的SH-SY5Y细胞数量是否正确，确认无染料沉淀产生，并优化染料的标记浓度。若SH-SY5Y细胞染色充分，则需检查加入实验板中的细胞浓度是否正确，并确保iPSC来源的巨噬细胞状态良好且未过度老化。第二类问题即巨噬细胞分布不均，可能源于移液过程中细胞丢失，因此应采取措施减少细胞所受的移液剪切力，避免使用孔径过小的吸头。若问题仍然存在，可缩短iPSC巨噬细胞负载细胞通透性染料的孵育时间。第三类问题涉及将未被吞噬的颗粒错误纳入分析，表明分析流程尚需进一步优化。故障排查应首先聚焦于细胞分割效果，以及软件是否将邻近物体错误纳入分析。相关步骤下方的注释中已建议可调整的具体参数（活细胞延时成像分析参见步骤6.1.11–6.1.15，高内涵分析参见步骤6.2.4–6.2.8）。若细胞分割效果无法进一步改善，高内涵分析中设有额外步骤（步骤6.2.8），可排除分割异常的iPSC巨噬细胞。此外，还可优化在iPSC巨噬细胞内筛选pH敏感性荧光信号点的模块，提高可接受对象的荧光强度阈值，有助于排除未被吞噬的SH-SY5Y细胞（活细胞延时成像分析参见步骤6.1.17，高内涵分析参见步骤6.2.11）。
我们为吞噬作用检测开发了两种类型的显微镜读出方法，每种方法均有其优势与局限性。活细胞延时成像的优点在于能够提供有关吞噬动力学的额外信息，且相较于高内涵成像平台，其设备更为普及。推荐使用的开源软件不依赖于显微镜品牌，可与任何高质量的荧光显微镜配合使用，无论是否具备活细胞延时成像功能。活细胞成像的主要局限在于其灵敏度和光学性能有限，这使得对iPSC来源的巨噬细胞（iPSC-macrophages）进行准确检测和良好分割更具挑战性。该局限可通过延长iPSC-巨噬细胞染色时间，或在条件允许时更换为更灵敏的显微镜予以缓解。若具备高内涵成像系统，建议采用高内涵成像吞噬检测作为首选读出方式。高内涵成像系统可实现更高的通量和更可靠的数据，因而适用于筛选实验，预期可获得≥0.7的稳健Z'值。 &#34;每细胞斑点数&#34; 输出20与活细胞延时成像方法相比，高内涵显微成像检测具有更高的灵敏度、更高程度的自动化与检测速度，可处理更多孔板和成像视野，并能生成高分辨率的共聚焦图像。高质量图像有助于更有效的细胞分割，且高内涵成像分析软件提供了更多适用于形态高度不规则细胞的分割方法，进一步辅助分割过程。此外，相较于开源软件，高内涵成像分析软件可计算更多吞噬作用相关参数，例如吞噬细胞的百分比。高内涵吞噬检测的主要局限性在于成像系统及分析软件的成本较高且不易获得。
综上所述，本文介绍的定量吞噬作用检测方法是一种用于体外模拟小胶质细胞吞噬死亡神经元的有用工具。该体系使用诱导性多能干细胞来源的巨噬细胞（iPSC-巨噬细胞）模拟小胶质细胞，使用多聚甲醛固定的SH-SY5Y细胞模拟死亡神经元。尽管这些模型并非目前已发表的最接近真实的小胶质细胞或死亡/凋亡神经元模型，但其制备简便且可扩展。该检测方法本身具有高度灵活性，文中详细描述了两种成像读出方式，并具备适应于不同小胶质细胞/巨噬细胞单培养模型，或更换其他类型细胞作为吞噬靶标的潜力。高内涵成像读出方式有利于获取定量数据，且可扩展用于筛选小分子吞噬调节剂，或检测iPSC-巨噬细胞中的遗传变异。然而，由于高内涵成像系统成本较高且产生大量数据，本方案中还提供了另一种替代性成像读出方式，即使用活细胞延时显微镜，必要时也可替换为任何高质量的传统荧光显微镜。

小胶质细胞是脑组织中的常驻巨噬细胞，其功能包括免疫监视、协调对损伤或感染的炎症反应、突触重塑，以及对死亡细胞、髓鞘、蛋白质聚集体和病原体的吞噬作用。吞噬作用是指小胶质细胞通过表面受体识别目标物质，并重组其细胞骨架，将目标包裹形成吞噬体，随后吞噬体与溶酶体融合，从而降解所摄入的物质。健康的小胶质细胞会吞噬凋亡的脑细胞，以防止其发展为坏死状态1。对凋亡细胞的吞噬也称为胞葬作用（efferocytosis），需要由濒死细胞在其表面暴露磷脂酰丝氨酸作为“吃我”信号2。多种小胶质细胞受体可直接结合磷脂酰丝氨酸，包括 TIM-4、BAI1、Stabilin-2 和 TREM2。小胶质细胞的 TAM 受体（如 MERTK）和整合素则分别通过辅助蛋白 GAS6 或 MFG-E8 间接结合磷脂酰丝氨酸。此外，识别濒死细胞可能还需要其他“吃我”信号，这些信号包括细胞表面蛋白的糖基化或电荷改变；细胞表面表达原本位于胞内的蛋白质如 ICAM3、钙网蛋白、膜联蛋白-I；氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）；或由小胶质细胞产生的补体 C1q 覆盖在凋亡细胞表面1,2。
神经退行性疾病，包括帕金森病、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆和肌萎缩侧索硬化症，均与小胶质细胞功能障碍相关，表现为脑内废物（如死亡细胞、髓鞘碎片和蛋白质聚集体）的积聚，以及对这些刺激物产生过度的炎症反应3。在神经退行性疾病中，吞噬作用可能因衰老、炎症或特定遗传风险变异的共同作用而受损，从而促进疾病病理进程4,5。另一方面，来自动物模型的研究也表明，小胶质细胞可能异常地吞噬存活的神经元或突触6,7,8。该机制可能由受损神经突起表面暴露的磷脂酰丝氨酸引发，后者可被小胶质细胞的吞噬受体TREM2或GPR56直接识别，或通过可溶性补体C1q包被富含磷脂酰丝氨酸的膜结构而间接识别，进而通过CR3介导的途径触发吞噬作用9,10,11。
体外吞噬功能检测，例如评估小胶质细胞中遗传风险变异的表型影响，通常使用非生理性的货物，如乳胶珠4。荧光标记的细菌和酵母聚糖也常被使用，这些虽属生理性货物，但与神经退行性疾病无关。非生理性吞噬货物可用于检测吞噬作用基本机制中的缺陷，但无法准确模拟吞噬凋亡神经元过程中第一步的“识别”环节。货物的大小、形状、硬度和类型均决定了所激活的细胞内信号通路，从而导致小胶质细胞活化状态的不同结果。例如，E.coli细菌体积小且质地坚硬，与人类细胞不同，其表面的脂多糖可被Toll样受体4（TLR4）识别，进而激活吞噬作用及促炎性信号通路2,12。
在神经退行性疾病研究中，更相关的吞噬作用底物应是在哺乳动物细胞质膜上暴露磷脂酰丝氨酸，并且理想情况下应为人类神经元来源，以包含小胶质细胞可能遇到的信号。在本吞噬作用实验方案中，选用人源神经母细胞瘤细胞系 SH-SY5Y 作为易于培养的神经元模型。通过甲醛固定人工诱导细胞表面持续暴露磷脂酰丝氨酸，该方法此前已被证明可导致血小板暴露磷脂酰丝氨酸13。小胶质细胞模型采用人源诱导多能干细胞来源的巨噬细胞（iPSC-巨噬细胞），其可模拟人小胶质细胞的发育起源和转录谱特征，并具备吞噬能力14,15,16,17。iPSC-巨噬细胞并非目前最接近真实的小胶质细胞模型，例如其不能模拟小胶质细胞的形态；但如有需要，可替换为更真实的单培养 iPSC 小胶质细胞模型，如 Haenseler 等人15 所建立的模型。由于人类与小鼠神经退行性疾病组织中小胶质细胞转录模块的重叠度有限，因此在研究神经退行性疾病时，人源 iPSC 模型优于原代啮齿类小胶质细胞18。死亡的 SH-SY5Y 细胞使用一种酸敏感性荧光染料进行标记，该染料在中性 pH 下荧光较弱，而在吞噬溶酶体内 pH 较低时荧光增强，从而在吞噬作用发生后可被检测。使用酸敏感性染料可提高检测吞噬事件的准确性，并适用于活细胞和固定细胞的多种检测方式19。本实验方案同时描述了活细胞时间序列成像法观察吞噬过程，以及固定细胞高内涵成像法检测吞噬作用，两种方法在检测前采用相同的细胞制备步骤（图 1）。
<img alt="SH-SY5Y 细胞转化为 iPSC-巨噬细胞的过程示意图；细胞染色、成像与数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：实验方法示意图。 吞噬功能检测流程概览，其中 SH-SY5Y 细胞的制备与 iPSC-巨噬细胞的染色并行进行，随后将 SH-SY5Y 细胞接种至 iPSC-巨噬细胞上。可立即进行活细胞延时成像，或在 37 °C、5% CO2 条件下孵育所需时间后，固定细胞再进行高内涵显微镜检测。PFA：多聚甲醛，HBM：无酚红 HEPES 缓冲培养基，pHr：pH 敏感性红色荧光染料 STP 酯溶液，PRFMM：无酚红巨噬细胞培养基。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>用于细胞离心</td></tr><tr><td>2-20 &amp;micro;L，20-200 &amp;micro;L，100-1000 &amp;micro;L单通道微量移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇 50 mM</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td>工厂培养基组分</td></tr><tr><td>PBS 中的 4% 多聚甲醛</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td>用于细胞固定</td></tr><tr><td>6孔板，组织培养处理</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AggreWell-800 24孔板</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34815</td><td>用于拟胚体形成的微孔低黏附24孔板</td></tr><tr><td>Annexin V-FITC 凋亡染色/检测试剂盒</td><td>Abcam</td><td>ab14085</td><td>用于固定后 SH-SY5Y 细胞质量控制检测的 annexin V-FITC 染色试剂盒。试剂盒包含 annexin 结合缓冲液、annexin V-FITC 和碘化丙啶。</td></tr><tr><td>自动细胞计数器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式微量离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellCarrier-96 超微孔板，组织培养处理，黑色，96 孔，带盖</td><td>Perkin Elmer</td><td>6055302</td><td>用于吞噬作用检测的96孔组织培养（TC）处理微孔板，孔壁为黑色，孔底光学透明</td></tr><tr><td>CellProfiler 软件</td><td></td><td></td><td>用于分析活细胞延时显微镜获取的吞噬作用图像的开源软件。可从网站（http://cellprofiler.org/）免费下载，本方案使用版本 2.2.0。</td></tr><tr><td>CellTracker Deep Red 染料</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C34565</td><td>深红色荧光、可穿透细胞、可与琥珀酰亚胺酯反应的染料，用于染色iPS来源的巨噬细胞胞质。将CellTracker Deep Red染料溶于DMSO中，配制成2 mM（1.4 mg/mL）溶液。使用浓度为1 &amp;mu;M，通过用巨噬细胞培养基稀释DMSO储备液制备。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>II级层流空气安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气瓶</td><td></td><td></td><td>EVOS FL Auto 附件</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 37℃培养箱&amp;deg;C 和 5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>哥伦布图像数据存储与分析系统</td><td>Perkin Elmer</td><td>哥伦布</td><td>Opera Phenix 数据存储与分析平台。支持所有主流高内涵筛选仪器。</td></tr><tr><td>细胞松弛素D</td><td>Cayman</td><td>11330</td><td>吞噬作用检测的阴性对照处理。用DMSO重悬至10 mM，分装后于-20℃保存&amp;deg;C，避免反复冻融。使用时浓度为10 &amp;micro;M.</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320074</td><td>SH-SY5Y 培养基组分</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>细胞追踪剂和 pHrodo 染料的溶剂</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto 成像系统</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AMF4300</td><td>活细胞延时成像显微镜</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube CY5</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AMEP4656</td><td>EVOS FL Auto 附件</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube DAPI</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AMEP4650</td><td>EVOS FL Auto 附件</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube RFP</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AMEP4652</td><td>EVOS FL Auto 附件</td></tr><tr><td>EVOS Onstage 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AMC1000</td><td>EVOS FL Auto 附件</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>SH-SY5Y 培养基组分</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术分析软件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free、hESC认证、低生长因子基底膜基质</td><td>Invitrogen</td><td>A1413302</td><td>适用于iPSC培养的hESC认证基底膜基质</td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>工厂培养基和巨噬细胞培养基的共同组分</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Lonza</td><td>BE 10-547F</td><td>汉克&amp;rsquo;用于洗涤步骤的平衡盐溶液</td></tr><tr><td>人重组BMP4</td><td>Gibco</td><td>PHC9534</td><td>胚胎体培养基组分</td></tr><tr><td>人重组IL-3</td><td>Gibco</td><td>PHC0033</td><td>工厂培养基和巨噬细胞培养基的共同组分</td></tr><tr><td>人重组 SCF</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-695</td><td>胚胎样小体培养基组分</td></tr><tr><td>人重组VEGF</td><td>Gibco</td><td>PHC9394</td><td>胚胎样小体培养基组分</td></tr><tr><td>活细胞成像溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A14291DJ</td><td>用于标记死亡 SH-SY5Y 细胞的酚红-free HEPES 缓冲培养基</td></tr><tr><td>低蛋白吸附 2 mL 管</td><td>Eppendorf</td><td>30108.132</td><td>用于染色SH-SY5Y细胞</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>PHC9501</td><td>工厂细胞和巨噬细胞培养基的共同组分</td></tr><tr><td>mTeSR1 培养基</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>iPSC 培养基</td></tr><tr><td>多通道 20-200 μL 移液器</td><td></td><td></td><td>用于96孔板的液体处理</td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes 试剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R37605</td><td>Hoechst 33342 滴瓶制剂，用于iPS来源巨噬细胞的细胞核染色，每毫升巨噬细胞培养基中加入0.5滴。</td></tr><tr><td>Opera Phenix 高内涵筛选系统</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH14000000</td><td>高内涵成像显微镜，配合 Harmony 软件 4.9 版使用。</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>工厂、巨噬细胞和SH-SY5Y培养基的组分</td></tr><tr><td>pHrodo iFL Red STP-酯</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P36011</td><td>pH敏感性红色荧光染料，用于标记死亡的SH-SY5Y细胞。将pHrodo iFL Red STP酯粉末用DMSO重悬至5 mg/mL浓度。每100万个SH-SY5Y细胞加入2.5 &amp;mu;L（12.5 &amp;mu;将 pHrodo iFL Red STP 酯储备液加入悬浮于预热的活细胞成像溶液中的细胞中。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>血清移液管吸液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T175 培养瓶，组织培养处理</td><td></td><td></td><td>用于iPSC-巨噬细胞前体分化的容器，称为 &quot;工厂&quot;</td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td></td><td></td><td>SH-SY5Y细胞培养容器</td></tr><tr><td>透明板封膜机</td><td>Greiner Bio-One</td><td>676001</td><td>用于检测板的储存与运输</td></tr><tr><td>TrypLE Express (1X)，无酚红</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>含重组类胰蛋白酶和1.1 mM EDTA的细胞解离缓冲液，直接使用。</td></tr><tr><td>37℃水浴锅&amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>含L-谷氨酰胺、庆大霉素和酚红的X-VIVO 15培养基</td><td>Lonza</td><td>BE04-418F</td><td>工厂细胞与巨噬细胞培养基组分</td></tr><tr><td>X-VIVO 15 培养基（含 L-谷氨酰胺；不含庆大霉素和酚红）</td><td>Lonza</td><td>04-744Q</td><td>无酚红巨噬细胞培养基，用于无添加剂或生长因子条件下的吞噬作用实验</td></tr></tbody></table>

诱导多能干细胞来源巨噬细胞吞噬死亡神经母细胞瘤细胞的体外定量成像分析

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

小胶质细胞在多种神经退行性疾病（包括帕金森病和阿尔茨海默病）中协调神经免疫反应。小胶质细胞通过胞葬作用（一种特化的吞噬作用）清除死亡和濒死神经元。环境或遗传风险因素可干扰小胶质细胞的吞噬功能。本文介绍了一种快速、简便的体外&#160;利用诱导性多能干细胞（iPSC）来源的小胶质细胞模型研究小胶质细胞吞噬作用的显微镜检测方案，采用经pH敏感性染料标记的SH-SY5Y人源神经母细胞瘤细胞系作为吞噬底物。该方法可高效获得大量死亡的神经母细胞瘤细胞，其细胞表面暴露磷脂酰丝氨酸，可被小胶质细胞识别为吞噬信号 &#34;吃我信号&#34; 通过吞噬细胞产生信号。该96孔板检测法适用于活细胞时间序列成像，也可在进一步处理前成功固定，并通过高内涵显微镜进行定量分析。固定细胞的高内涵显微镜检测使本实验可用于小分子抑制剂的高通量筛选，或评估携带遗传变异的诱导多能干细胞（iPSC）系的吞噬功能。尽管该检测最初是为研究iPSC来源巨噬细胞对完整死亡神经母细胞瘤细胞的吞噬作用而开发，但也可轻松适配用于其他与神经退行性疾病相关的吞噬底物（如突触体和髓鞘）以及其它吞噬性细胞类型。

采用先前所述方案进行活细胞延时成像，将野生型iPSC来源的巨噬细胞以每孔20,000个细胞的密度接种。加入不同数量的SH-SY5Y细胞（根据步骤3.1的细胞计数估算为每孔10,000–30,000个），并对部分孔预先孵育吞噬抑制剂细胞松弛素D（1小时），作为对照以抑制各SH-SY5Y细胞数量条件下的吞噬作用。在加入SH-SY5Y细胞40分钟后开始成像，随后每5分钟采集一次图像，持续3小时（数据包含初始40分钟的延迟时间）。代表性延时视频见补充数据，定量分析结果见图3。当每孔加入10,000个SH-SY5Y细胞时，每个细胞吞噬的颗粒（斑点）数量随时间呈线性增加，并被细胞松弛素D抑制约50%。细胞松弛素D的抑制效果弱于预期，最可能的原因是技术重复或生物学重复不足，因为每种条件下仅对一个孔的三个成像视野进行了成像。当每孔SH-SY5Y细胞数量更高（20,000和30,000个）时，吞噬作用的时间线性关系较差，可能是由于在更密集的视野中iPSC-巨噬细胞与SH-SY5Y细胞的分割效果不佳所致。
采用前述方案对固定细胞进行高内涵成像分析，实验中使用野生型iPSC来源的巨噬细胞（每孔20,000个细胞），并设置多种不同数量的SH-SY5Y细胞（每孔10,000–80,000个），在共孵育5小时后固定并成像。图4A展示了吞噬作用的代表性图像，分析结果见图4B17。随着SH-SY5Y细胞数量的增加，每个巨噬细胞吞噬的颗粒（斑点）数量也随之上升；然而，SH-SY5Y细胞数量加倍仅导致每个细胞的斑点数增加1.5倍，表明所测试的细胞数量并未成为吞噬作用的限速因素。随后，使用多种吞噬抑制剂对高内涵成像吞噬实验进行了验证（图4C）17。在吞噬前预孵育1小时后，肌动蛋白聚合抑制剂cytochalasin D和jasplakinolide分别显著抑制吞噬作用达91%和90%。当以cytochalasin D或jasplakinolide作为阴性对照时，该实验的稳健Z'值分别为0.7和0.820。溶酶体酸化抑制剂bafilomycin A1在吞噬前孵育1小时后，显著抑制吞噬作用达31%。溶酶体酸化抑制剂的作用弱于肌动蛋白抑制剂，提示对内吞货物的检测可能并不依赖吞噬体的完全酸化。使用重组annexin V作为对照，特异性阻断暴露在SH-SY5Y细胞表面的磷脂酰丝氨酸，从而阻止吞噬受体识别这一关键的“吃我”信号。在加入SH-SY5Y细胞前立即向孔中添加重组annexin V，可显著降低吞噬作用达30%。通过荧光标记的annexin V探针证实，固定的SH-SY5Y细胞表面暴露磷脂酰丝氨酸，而活的SH-SY5Y细胞则无annexin V染色信号（图4D）。
小胶质细胞吞噬受体 TREM2 既往已被证实对凋亡神经元的吞噬作用具有重要作用21。TREM2 的 R47H 突变是晚发性阿尔茨海默病的风险基因，据推测会降低 TREM2 与配体的结合能力23。为了评估 R47H TREM2 及 TREM2 敲除（KO）的吞噬功能，采用具有野生型（WT）/R47H/敲除型 TREM2 的同基因 iPSC 来源巨噬细胞系，进行了固定细胞高内涵吞噬实验17。通过分步添加吞噬底物（40,000 个 SH-SY5Y 细胞），测试了从 1 到 5 小时不等的多种吞噬持续时间。结果显示，信号在 4 小时内呈线性增加，5 小时时略有平台期（图 5）17。与野生型相比，TREM2 敲除细胞的吞噬速率和能力（斑点阳性细胞百分比）明显降低，而 R47H TREM2 突变体未表现出吞噬功能的改变。TREM2 敲除细胞中的吞噬缺陷并未在 R47H TREM2 突变中重现，这似乎是因为 TREM2 的功能仍足以维持正常的吞噬作用。
<img alt="荧光显微镜图，Phrodo 斑点数随时间变化，SH-SY5Y 细胞；细胞松弛素 D 的影响" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：活细胞时间延时吞噬作用检测的示例数据。 野生型 iPSC 巨噬细胞 BIONi010-C（ECACC 编号：66540023）对死亡 SH-SY5Y 细胞的摄取，以每 5 分钟一次的频率成像，持续 3 小时。图中显示的时间从吞噬作用开始时计算，包括最初未进行测量的 40 分钟。数据点表示三个重复孔中每个细胞的平均斑点数。使用 10 µM 细胞松弛素 D 预处理 1 小时可抑制对 10,000 个 SH-SY5Y 细胞的吞噬作用；而当 SH-SY5Y 细胞数量较高（20,000 和 30,000）时，吞噬作用的定量结果次优。数据表示为均值 ± 标准差（SD），N = 1 次实验。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞成像与孢子计数图：SH-SY5Y细胞的显微镜图像与数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：固定细胞高内涵吞噬实验的优化与验证。（A）野生型iPSC巨噬细胞BIONi010-C（ECACC编号：66540023）吞噬SH-SY5Y细胞的代表性高内涵显微图像。显示的是加入40,000个SH-SY5Y细胞后3小时的时间点。荧光通道已合并，其中iPSC巨噬细胞染色呈红色，细胞核呈蓝色，SH-SY5Y细胞呈黄色。插图是原图像放大3倍的局部区域。（B）在不同数量的货物添加条件下，野生型iPSC巨噬细胞在5小时内每细胞吞噬的死亡SH-SY5Y细胞斑点数。数据为N = 3次独立收获的均值 ± 标准误（SEM）。（C）使用10 µM 细胞松弛素D（Cyt）、1 µM 巴佛洛霉素A1（Baf）、1 µM 茉丝柯林肽（预处理1小时；Jas）以及13 µg/mL重组膜联蛋白V（与死亡SH-SY5Y细胞同时加入；Ann）处理后，吞噬作用（3小时）受到抑制。未加入SH-SY5Y细胞的iPSC巨噬细胞作为阴性对照（-ve），未处理的iPSC巨噬细胞加入SH-SY5Y细胞作为阳性对照（+ve）。数据已归一化至该实验重复的平均值。数据为N = 3–6次独立收获的结果，使用两种野生型细胞系（SFC840-03-03，该细胞系的表征见Fernandes等21，以及BIONi010-C）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Dunnett事后检验，与未处理组进行比较。*p &lt; 0.05，***p &lt; 0.001。（D）新固定的SH-SY5Y细胞对磷脂酰丝氨酸暴露（膜联蛋白V-FITC）呈均匀染色，且细胞通透性有限（碘化丙啶染色）。活的SH-SY5Y细胞不被膜联蛋白V-FITC或碘化丙啶染色，仅在培养中少量死亡细胞上可见局部染色。本图经Alzheimer's Research &amp; Therapy17许可转载。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="吞噬作用分析图；TREM2 变异体的实验数据；随时间变化的细胞斑点指标。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：在 TREM2 敲除的 iPSC-巨噬细胞中吞噬作用降低，但在 R47H TREM2 iPSC-巨噬细胞中未降低。使用每孔 40,000 个 SH-SY5Y 细胞进行高内涵吞噬作用检测，并采用分步加样方式。对以下参数取平均值：每个细胞的斑点数量、每个细胞的斑点总面积（µm2）以及每视野含吞噬颗粒细胞的百分比。数据经标准化处理，以每种基因型在各实验中的平均值为基准。结果以均值 ± 标准误（SEM）表示，N = 3 次收获样本。采用重复测量双因素方差分析（ANOVA），Dunnett 事后检验，各时间点与野生型（WT）进行两两比较：*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01，***p &lt; 0.001。该图经《阿尔茨海默病研究与治疗》（Alzheimer's Research &amp; Therapy）17 许可复制。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充图 S1：SH-SY5Y 细胞制备的示例质量控制。 分离的 SH-SY5Y 细胞分别用 0%（活细胞）、1% 和 2% 多聚甲醛（PFA）固定 10 分钟，随后进行洗涤。细胞经 annexin V-FITC 和碘化丙啶（PI）染色后立即进行流式细胞术检测。使用单染和未染色对照样本，在流式细胞分析软件中绘制密度图并设置象限门控。各象限中标注了位于该象限内的事件百分比。活细胞主要位于 Q4 象限，固定后的细胞主要位于 Q2 象限。Q1 = annexin V-/PI-，Q2 = annexin V+/PI+，Q3 = annexin V+/PI-，Q4 = annexin V-/PI-（活细胞）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Figure%20S1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频：活细胞延时吞噬作用。 野生型iPSC-巨噬细胞BIONi010-C（ECACC编号：66540023）吞噬SH-SY5Y细胞的代表性延时视频。图像每5分钟采集一次，持续3小时。视频经过裁剪，以每秒3帧播放，展示实验最后1.5小时的过程。经酸敏感染料染色的SH-SY5Y细胞显示为红色，其信号强度随吞噬体酸化而增强。细胞核经Hoechst 33342染色后显示为蓝色。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Video.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

神经退行性疾病与小胶质细胞功能失调相关。本文介绍了一种利用iPSC来源的巨噬细胞体外吞噬神经母细胞瘤细胞的检测方法。文中描述了活细胞延时成像和固定细胞高内涵成像的定量显微镜读数分析方法。

小胶质细胞在包括帕金森病和阿尔茨海默病在内的多种神经退行性疾病中协调神经免疫反应。

该体外成像实验可用于定量评估不同细胞处理方法或不同基因型对小胶质细胞吞噬作用的影响。我们采用两种与神经退行性疾病相关的细胞类型，以死亡的神经母细胞瘤细胞作为吞噬靶标，其制备方法简便且成本低廉，易于在大规模高内涵成像筛选中扩增应用。在二级生物安全柜中，通过吸除培养基来解离 SH-SY5Y 细胞。加入 4 ml 细胞解离缓冲液，并立即去除缓冲液，使剩余量少于 1 ml，形成覆盖细胞的薄层。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下孵育 2 至 3 分钟。然后向 T-75 培养瓶中加入 10 ml HBSS。将SH-SY5Y细胞用移液器转移至15 ml锥形离心管中。在400×g下离心5分钟。吸除上清液，用2 ml不含酚红的HEPES缓冲培养基重悬细胞，固定前务必充分分散细胞团块。向离心管中加入 2 ml 4% 多聚甲醛固定细胞，在室温下轻轻振荡孵育 10 分钟。向管中加入 10 ml HBSS。然后在 1200×g 离心 7 分钟。吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于2 ml不含酚红的HEPES缓冲培养基中。计数后取100万个HS-SY5Y细胞置于2 ml低蛋白结合力离心管中，用不含酚红的HEPES缓冲培养基将终体积调整至300至500微升。然后将离心管在37摄氏度水浴中短暂加热。根据生产商说明书重悬pH敏感性红色荧光染料STP酯。随后每百万个SH-SY5Y细胞加入12.5 µg染料。轻轻弹击管壁混匀。避光，室温孵育30分钟。加入1 ml HBSS，于1200×g离心7分钟，4摄氏度。弃去上清液，用 2 ml HBSS 洗涤。将细胞沉淀重悬于不含酚红的巨噬细胞培养基中，调整细胞浓度至每毫升 0.2 × 10⁶ 至 1.2 × 10⁶ 个细胞，使 50 微升中含有 10,000 至 60,000 个细胞。在生物安全柜中，用巨噬细胞培养基配制深红色荧光细胞通透性琥珀酰亚胺酯反应性染料溶液。加入 Hoechst 33342，并将工作液置于水浴中加热至 37 摄氏度。使用多通道移液器将细胞上清液轻轻吸出，转移至无菌储液槽中，以去除iPSC巨噬细胞培养基。使用多通道移液器向每个孔中加入 70 微升染料溶液至 iPSC 巨噬细胞中。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下孵育 1 小时。在不含酚红的巨噬细胞培养基中进行实验处理。孵育结束后，用多通道移液器非常轻柔地吸出iPSC巨噬细胞培养基，每孔加入100 µL HBSS。立即通过轻柔移液去除HBSS。然后在不同孔中分别加入100 µL无酚红巨噬细胞培养基以及实验处理物。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育10分钟至1小时。使用多通道移液器从每孔侧壁靠近液体边缘处，每孔加入50微升标记的SH-SY5Y细胞。然后在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育3至5小时。吞噬作用孵育结束后，使用多通道移液器轻柔吸去细胞上清液并弃去。用 100 µL PBS 洗涤一次。然后加入 100 µL 2% 多聚甲醛固定细胞，在室温下孵育 15 分钟。吸去孔内液体，加入 100 µL PBS。可立即使用高内涵显微镜进行成像，或用封板膜和铝箔覆盖后，将板置于 4 °C 保存备用。打开高内涵成像显微镜，并启动图像采集软件。通过点击屏幕顶部的“LOAD”图标，将检测板载入显微镜。选择“SETUP”选项卡。在左上角框内的下拉菜单中，选择合适的板类型。自动对焦选项：双峰，“物镜：40倍水镜，数值孔径1.1”，共聚焦模式，采样倍数为1。使用前通过设置菜单冲洗40倍水镜物镜。在通道选择框中，点击加号图标添加DAPI、Alexa 647和Alexa 568通道。将这些参数设置为在1微米的单一层面上进行测量。优化检测板染色效率的时间和功率设置。通过单击通道序列来分离通道，确保通道不被同时测量。在导航并定义布局时，选择待测量的孔，并为每孔选择 9 到 12 个视野。在设置过程中，单击平板图上的代表性视野，并依次检查每个测量通道，以确认染色存在，并通过调整通道偏移量确保图像聚焦清晰。要将数据上传至服务器以进行远程分析，请点击“在线任务”框及其相应的屏幕名称。通过点击“保存”按钮来保存检测方案，然后点击顶部的“运行实验”选项卡。为实验板命名，然后点击“开始”。活细胞实时吞噬检测结果显示，每孔含有 10,000 个 SH-SY5Y 细胞时，每个细胞吞噬的颗粒数量随时间呈线性增加，并且可被细胞松弛素 D 抑制约 50%。当每孔中 SH-SY5Y 细胞数量更高时，吞噬作用的线性关系较差，可能是由于在更拥挤的视野中，iPSC、巨噬细胞和 SH-SY5Y 细胞的分割效果不佳所致。通过固定细胞高内涵成像获得了以下结果，其中包括吞噬作用的代表性图像。增加SH-SY5Y细胞的数量导致每个细胞吞噬的颗粒数量增多。该吞噬实验使用了多种吞噬抑制剂进行验证。细胞松弛素D和海绵肌动蛋白抑制剂分别显著抑制吞噬作用达91%和90%。巴佛洛霉素A1在吞噬作用发生前预先孵育1小时，可显著降低吞噬作用31%。在加入SH-SY5Y细胞前立即向孔板中添加重组膜联蛋白5，可使吞噬作用显著降低30%。通过使用荧光标记的Annexin 5探针，我们证实固定的SH-SY5Y细胞暴露了磷脂酰丝氨酸，而活的SH-SY5Y细胞对Annexin 5染色呈阴性。通过分阶段添加吞噬货物，测试了从1到5小时的多种吞噬持续时间。通过并行准备吞噬性货物和对iPSC来源的巨噬细胞进行染色，可以缩短本实验方案的总体时长。如果希望采用此方法，请提前规划好各步骤的时间安排，并利用孵育时间来配制后续步骤所需的溶液。

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