Name: 外分泌物的自动检测和分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: 学习使用MATLAB自动检测和分析TIRF显微镜下的外分泌事件。该计算流程结合计算机视觉算法，可对融合事件进行分类并评估时空分布特征，提高分析效率与可重复性。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢Dustin Revell和Reginald Edwards对代码和图形用户界面的测试。本研究由美国国立卫生研究院资助：包括R01NS112326（SLG）、R35GM135160（SLG）和F31NS103586（FLU）。

注意：&#160;原始的胞吐分析图形用户界面（GUI）使用 Matlab 9.10 版本（2021a）编写并编译。新版本的 MATLAB 需要对 GUI 进行更新，更新版本可从我们的网站下载：https://guptonlab.web.unc.edu/code/
1. 选择数据集和目录
<ol>
	<li>选择用于分析的数据集时，点击 查找数据集 按钮（图 2A，红色框 1），进入数据存放的文件夹（例如 RawData 文件夹）。数据文件将自动作为列表填充至“数据文件”区域。文件夹中可包含多个数据集。</li>
	<li>点击 选择目录 按钮，并选择用于存放分析后文件的目录（例如 Test 目录）（图 2A，红色框 2）。当点击“分析”按钮后，该目录中将生成一组文件夹、已完成的分析文件以及中间临时图像。若未选择目录，则会报错。</li>
</ol>
2. 设置像素大小和帧率
<ol>
	<li>填写图像的适当帧率和像素大小 &#34;帧率&#34; 或 &#34;像素大小&#34; 盒图2A，绿色方框）。如果未提供任何数值（它们将被设置为默认值 &#34;0&#34;），程序将搜索与该文件关联的元数据以获取帧率和像素大小。如果无法找到这些值，程序将默认以每像素作为测量单位，以每帧作为时间点单位。 
	&#8203;注意：在提供的示例中，帧率为100，像素大小为0.08。</li>
</ol>
3. 选择或制作掩膜
<ol>
	<li>使用 Mask Maker 按钮，可自动为文件数据集列表中的数据生成细胞掩膜（图 2A，蓝色框）。点击 Mask Maker 按钮后，系统将在所选目录中创建一个名为 MaskFiles 的新文件夹。&#34;运行指示器&#34;在运行期间将变为黄色，完成后恢复为绿色。 
	注意：将根据数据文件列表中每个文件的图像前 10 帧（或若图像帧数少于 10 帧，则使用全部帧）生成对应的掩膜，并按照正确的命名规则（如下所述）保存至 MaskFiles 文件夹中。</li>
	<li>确保掩膜文件自动填充至掩膜文件列表中。用户可直接进入分析步骤。 
	注意：务必目视检查每个掩膜文件，确认其完整覆盖了感兴趣区域。当选中文件时，数据文件的第一帧与对应掩膜文件将在用户界面中显示（图 2B）。在信噪比较低的情况下，Mask Maker 可能产生错误，因此验证掩膜文件的准确性对质量控制至关重要。</li>
	<li>作为使用 Mask Maker 的替代方案，若图像信噪比不足，可在 ImageJ 中手动创建掩膜。
	<ol>
		<li>首先，在 ImageJ 中打开原始图像文件（图 3A）。</li>
		<li>点击 多边形选择 按钮，围绕细胞逐点绘制掩膜区域。绘制完成后，双击最后一个点以闭合多边形。</li>
		<li>完成后，进入 编辑 | 选择 | 创建掩膜（图 3B），系统将基于所绘制的多边形生成一个新的反相掩膜。将掩膜文件保存至所选目录下的指定 MaskFiles 文件夹中。掩膜文件的命名规则必须与对应的数据文件名一致，并在末尾添加 &#34;_mask_file&#34;。例如，若数据文件名为 &#34;VAMP2_488_WT_1.tif&#34;，则对应的掩膜文件必须命名为 &#34;VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif&#34;。</li>
		<li>使用 查找掩膜文件 按钮，导航至存放自定义掩膜文件的文件夹。掩膜文件将作为列表填充至“掩膜文件”区域。 
		&#8203;注意：在运行分析之前，必须确保每个数据文件都有对应的掩膜文件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 分析与特征提取
<ol>
	<li>选择目录并填充数据文件列表和掩膜文件列表后，点击分析按钮（图4A）。如果需要对外排事件进行分类，请转至步骤5。 
	注意：点击分析按钮将执行一系列自动化任务以分析数据。系统将在所选目录中创建独立的文件夹来存储分析后的数据。运行过程中，&#34;运行指示器&#34;将由绿色变为黄色（图4A，红框）。分析完成后，该指示器将恢复为绿色。</li>
	<li>查找一个DataFiles文件夹（图4B），其中包含完整的分析文件集（以及用于后续分类的特征提取文件），文件按各个数据文件命名（图4C）。 
	注意：这些分析文件的说明详见下文“代表性结果”部分。</li>
</ol>
5. 胞吐事件的分类
<ol>
	<li>为通过自动检测实现对外排事件的同步分类，在点击分析按钮前，请勾选分类复选框。针对每个外排事件，为每一类别分配一个介于 0 到 1 之间的概率评分。若某类别的概率评分&#62; 0.5，则该外排事件被认定为属于四类中的该类别。 
	&#8203;注意：分析完成后，所选目录中将生成一个新的数据文件夹。该文件夹包含与每个图像文件相对应的分析文件。</li>
</ol>
6. 使用Ripley's K值对胞吐作用进行时空分析
<ol>
	<li>创建一个独立的 &#34;神经突&#34; 和 &#34;胞体&#34; 掩膜文件。首先将胞体与神经突进行分割。目前尚无对胞体与神经突进行分割的无偏方法，因此操作者应在对分组条件设盲的情况下，依据最佳判断进行分割；建议采用无明显神经突延伸的椭圆状区域。</li>
	<li>打开 ImageJ/Fiji。</li>
	<li>拖放掩膜文件或使用 文件 | 打开 然后选择掩膜文件。</li>
	<li>使用取色工具，点击掩膜背景中的任意黑色像素，将颜色设置为黑色。</li>
	<li>使用多边形选择工具或手绘工具在胞体周围绘制轮廓，将其与神经突起分离。此过程需要人工判断。</li>
	<li>点击 编辑 | 选择 | 创建蒙版将打开一张新图像，其中圈出的细胞体已从图像其余部分分割出来。这将生成一个细胞体掩膜文件。</li>
	<li>在不移动已绘制区域的情况下，点击原始掩膜文件的标题。</li>
	<li>点击 编辑 | 填充 填充被圈出的胞体，使掩膜中仅保留神经突。</li>
	<li>获得独立的神经突和掩膜文件后， 保存 两个掩膜文件。</li>
	<li>开放 &#34;神经突二维网络&#34; 在 Matlab 中。</li>
	<li>在 MATLAB 中，导航至包含所有分析数据的目录。</li>
	<li>更改路径 &#34;掩膜名称&#34; 到神经突掩膜的名称，即 &#34;MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_神经突.tif&#34;</li>
	<li>改变 &#34;csv_file_name&#34; 到 fluorescent_traces.csv 文件所在的位置，即 &#34;MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_轴突.csv&#34;.</li>
	<li>点击 运行 对神经突掩膜文件进行骨架化处理。此操作将生成神经突掩膜文件的骨架化版本，并将其以 CSV 文件形式保存至 maskfiles 文件夹中。</li>
	<li>接下来，为细胞体生成一个 CSV 文件。打开 &#34;CSV_mask_creator.m&#34; 在 Matlab 中。</li>
	<li>输入路径 &#34;掩模名称&#34; 到胞体掩膜的名称，即 &#34;MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif</li>
	<li>改变 &#34;写入矩阵&#34; 要创建的 csv 文件名，即， &#34;MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv&#34;</li>
	<li>点击 运行这将生成新的 VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv 文件。</li>
	<li>对每个掩膜文件重复步骤 6.14。</li>
</ol>
7. RStudio 设置
<ol>
	<li>打开 Rstudio，然后打开 ripleys_k_analysis.R 文件。</li>
	<li>安装软件包 &#34;spatstat&#34; 在 RStudio 中，通过前往 工具 | 安装软件包 并输入 &#34;spatstat&#34; 随后点击 安装. 
	注意：每个 Rstudio 安装仅需执行一次。</li>
	<li>每次会话开始时运行 spatstat 程序库。</li>
	<li>请注意此情况下的两个主要变量： &#34;神经元掩膜&#34; 和 &#34;神经元数据点&#34; 神经元掩膜指向要运行的一组掩膜文件，即胞体掩膜文件。&#34; 
	注意：所有胞体掩膜文件需一起运行，与 neurite 掩膜文件分开处理，反之亦然。</li>
	<li>读取待分析的每个神经元的掩膜文件的 .csv 数据。</li>
	<li>通过复制额外的 neuron_mask_n+1 文件来同时运行多个文件。这将允许使用第 8 节中描述的脚本将 Ripley 分析结果进行汇总。</li>
	<li>现在检查第二个变量， &#34;神经元数据点&#34;.</li>
	<li>读取。&#34;X_荧光信号.csv&#34; 由分析程序生成的文件（包含所有提取特征的R文件），其中含有胞吐事件的x、y、t位置信息，以及用于二维网络的神经突特异性x、y位置文件。此内容放入 &#34;神经元数据点&#34; 位置。</li>
	<li>在 RStudio 中 选择代码 | 运行选区 | 全部运行这将生成多个图表，包括分组的Ripley's K值图以及密度图。</li>
	<li>通过前往保存图表 导出 | 另存图像为 | 选择 合适的图像格式和目录，并输入适当的文件名，然后单击 保存. 
	注意：热图的绘图函数在脚本中被调用时使用 &#34;plot(密度(soma_data, 0.4))&#34;数量 &#34;0.4&#34; 此处表示密度函数应平滑的程度。可根据用户数据进行有意义的调整，但在不同热图之间进行比较时，该数值必须保持一致。</li>
	<li>导出 或 保存 来自 Rstudio 的图像。如果热图需要进一步编辑，请选择合适的文件类型（SVG 或 EPS）。</li>
</ol>
8. 里普利分析
注意：Ripleys_k_analysis.R 文件还会自动生成 Ripley's k 值的图表。运行整个脚本将自动执行下文提到的各个函数，但此处仍详细列出，以便用户需要单独运行脚本的某一部分或对分析过程进行修改。
<ol>
	<li>首先，对每个细胞运行包络函数。该函数模拟完全空间随机性（CSR），用于检验胞吐事件点格局的Ripley's K值。 
	Data_envelope_1 = envelope(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE) 
	Data_envelope_2 = envelope(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)</li>
	<li>接下来，将这些包络合并，并为该组生成一个CSR估计值： 
	Pool_csr = pool(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...) 
	然后，对所有数据点运行Ripley's K函数： 
	Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, ratio = TRUE) 
	Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, ratio = TRUE)</li>
	<li>完成后，将Ripley's K值合并，并使用以下命令对其置信区间进行自助法估计： 
	Data&#160;pool&#160;=&#160;pool(Data_ripleys_k_1,&#160;Data_ripleys_k_2,...)</li>
	<li>使用以下命令进行自助法分析： 
	Final_Ripleys_K = varblock(fun = Kest, Data_pool)</li>
	<li>绘制数据图形。</li>
	<li>若需严格的统计学差异检验，可使用spatstat软件包中包含的学生化置换检验来检测点格局组之间的差异： 
	Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ group, nperm = np)。</li>
</ol>

<ol><li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).</li>
<li>Urbina, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM67+regulates+exocytic+mode+and+neuronal+morphogenesis+via+SNAP47%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47.</a> Cell Reports. 34 (6), 108743(2021).</li>
<li>Alabi, A. A., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+kiss-and-run%3A+Role+in+exocytosis%2C+endocytosis%2C+and+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission.</a> Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li>
<li>He, L., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+debate+on+the+kiss-and-run+fusion+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The debate on the kiss-and-run fusion at synapses.</a> Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).</li>
<li>Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+patch+clamp+reveals+that+transient+fusion+%28kiss-and-run%29+is+a+major+mechanism+of+secretion+in+calf+adrenal+chromaffin+cells%3A+high+calcium+shifts+the+mechanism+from+kiss-and-run+to+complete+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion.</a> Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030(2006).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+single-vesicle+astrocyte+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).</li>
<li>Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+direct%2C+dynamin-dependent+recapture+of+fusing+secretory+granules+on+plasma+membrane+lawns+from+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).</li>
<li>Wang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+domains+of+synaptotagmin+control+the+choice+between+kiss-and-run+and+full+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion.</a> Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).</li>
<li>Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+combined+methodologies+to+define+the+role+of+plasma+membrane+delivery+during+axon+branching+and+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53743(2016).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+primary+culture+of+embryonic+mouse+hippocampal+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).</li>
<li>Plooster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM9-dependent+ubiquitination+of+DCC+constrains+kinase+signaling%2C+exocytosis%2C+and+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).</li>
<li>Urbina, F. L., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-mediated+exocytosis+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SNARE-mediated exocytosis in neuronal development.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133(2020).</li>
<li>Ripley, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second-order+analysis+of+stationary+point+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Probability%22%5BJournal%5D)">The second-order analysis of stationary point processes.</a> Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).</li>
<li>Liu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pHmScarlet+is+a+pH-sensitive+red+fluorescent+protein+to+monitor+exocytosis+docking+and+fusion+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps.</a> Nature Communication. 12 (1), 1413(2021).</li>
</ol>

作者声明无任何披露事项。

使用胞吐检测与分析软件时，请注意该程序仅接受无损压缩的 .tif 文件作为输入。.tif 图像文件可以是 8 位、16 位或 32 位灰度（单通道）图像。其他图像格式必须在输入前转换为上述格式之一。作为参考，本文所用示例为 16 位灰度图像。
在自动检测过程中，时间序列图像集会进行自动背景扣除和光漂白校正处理。对于背景扣除，将掩膜文件中掩膜区域以外的像素在整幅图像的时间序列上取平均值，并从图像集中减去该平均值。对于光漂白校正，则对视频过程中掩膜内像素的平均荧光强度应用单指数衰减拟合，校正后的强度按如下方式调整：
校正后的强度 = （时间 t 时的强度）÷ exp(-k×t)，其中 k = 衰变常数
因此，在输入前无需进行预处理。然而，这些过程在很大程度上依赖图像掩膜来有效分离细胞与背景，因此获得一个准确的细胞掩膜是获得良好结果的必要条件。
自动细胞掩膜生成器需要具有足够信噪比（理想情况下，至少为平均背景信号标准差的2...

VAMP-pHluorin 载体或转铁蛋白受体（TfR）-pHuji 载体是胞吐事件的优良标记物，因为这些对 pH 敏感的荧光蛋白在酸性囊泡腔内处于荧光淬灭状态，而在囊泡与质膜融合孔打开后立即发出荧光1。融合孔打开后，荧光呈指数衰减，其衰减速率存在一定异质性，可反映融合事件的相关信息。本文介绍一种图形用户界面（GUI）应用程序，可自动检测并分析胞吐事件。该程序能够使用户利用 pH 敏感性标记物自动识别胞吐事件2，并从每个事件中提取可用于分类分析的特征参数3（图 1A）。此外，本文还描述了使用 Ripley's K 函数对胞吐事件的空间聚集性进行分析的方法。
最近有研究报道了将胞吐事件自动分类为不同胞吐模式的方法3。此前已描述过两种胞吐模式：全囊泡融合（FVF）和“亲吻-逃逸”融合（KNR）胞吐4,5,6,7。在FVF过程中，融合孔扩张，囊泡完全并入质膜。在KNR过程中，融合孔短暂开放后重新闭合4,5,8,9,10。在发育中的神经元中已鉴定出四种胞吐模式，其中两种与FVF相关，另两种与KNR相关。该研究证明，FVF和KNR均可进一步细分为两类事件：一类是在融合孔开放后立即发生荧光衰减的融合事件（FVFi 和 KNRi），另一类是在融合孔开放后出现延迟，随后才开始荧光衰减的胞吐事件（FVFd 和 KNRd）（图1B）。该分类器可识别每个融合事件的胞吐模式。本文将此分析方法整合为一个图形用户界面（GUI），可在基于Windows和Mac操作系统的MATLAB中安装使用。所有分析文件均可在&#160;https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing 或 
https://github.com/GuptonLab 获取。

<table><tbody><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td></tr><tr><td>R</td><td>R 核心团队</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>Rstudio, PBC</td><td></td><td>https://rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

胞吐作用的自动检测与分析

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

对连接在囊泡SNARE蛋白上的pH敏感型GFP（pHluorin）进行延时全内反射荧光显微镜（TIRF）成像，是观察细胞培养中单个囊泡胞吐事件的有效方法。为了实现对这类事件的无偏、高效识别与分析，已开发并在MATLAB中实现了一种基于计算机视觉的分析方法。该分析流程包含细胞分割和胞吐事件识别算法。该计算机视觉方法提供了多种单事件参数的分析工具，包括荧光衰减半衰期和峰值ΔF/F，以及全细胞水平上胞吐频率的整体分析。这些及其他融合相关参数被用于分类分析，以区分不同的融合模式。本文介绍了一个新构建的图形用户界面（GUI），可完成从开始到结束的全流程分析。此外，进一步改进的R Studio中Ripley's K函数被用于区分融合事件在空间和时间上的聚集性、弥散性或随机性分布。

此处使用图形用户界面（GUI）（图2A）分析了在3天体外培养（DIV）时，通过全内反射荧光（TIRF）显微镜观察表达VAMP2-pHluorin的三个神经元的胞吐事件。E15.5期皮层神经元被分离后，按照Winkle等（2016）和Viesselmann等（2011）11,12所述方案转染VAMP2-pHluorin并进行铺板。成像参数的方法学依据Urbina等（2018）2所述进行。简言之，采用TIRF显微镜每100 ms对神经元的基底质膜成像一次，持续2分钟。图2、图3、图4展示了分析胞吐事件的逐步操作指南。首先选择存放神经元图像的文件夹，并指定用于保存最终分析数据文件的目录（图2A</str...

我们开发了自动化的计算机视觉软件，用于检测由pH敏感型荧光探针标记的胞吐事件。在此，我们演示如何使用图形用户界面和RStudio来检测融合事件，分析并展示融合事件的时空参数，并将事件分类为不同的融合模式。

活细胞延时全内反射荧光显微镜观察连接于囊泡SNARE蛋白的pH敏感型GFP（pHluorin）是可视化单个囊泡胞吐过程的有效方法。

自动检测与分析胞吐软件可使用户自动检测胞吐事件以及pH敏感型荧光探针的全内反射荧光（TIRF）图像序列。该软件还将自动输出胞吐的相关特征，例如空间分布或频率，以及单个胞吐事件的特性，如半衰期或荧光强度相对于背景的变化。此外，软件还提供选项，可将胞吐事件按照文献中已有描述的四种胞吐模式进行分类。为了使用胞吐作用的自动检测与分析软件，首先点击“查找数据集”按钮，然后导航至您的数据存放位置，并将数据放入名为 raw data 的文件夹中。您的数据文件将自动填充到此处的列表中，该文件夹内可包含任意数量的数据文件。接下来，您需要选择一个用于保存分析结果文件的目录。这里，我选择了一个名为 test 的目录。您还需要填写图像的帧率以及像素大小。此处我的帧率为每帧 100 毫秒，像素大小为 8 纳米。最后，您需要掩膜文件才能运行“胞吐作用的自动检测与分析”软件。您可以使用内置的掩膜生成按钮，根据您的数据文件自动生成掩膜文件。当掩膜生成程序运行完毕后，运行指示灯会先变为黄色，然后恢复为绿色。您的掩膜将被保存在您所选目录中一个名为“mask files”的新文件夹中。请注意，掩膜文件会自动填充到此处的列表中。您需要确认您的掩膜文件是否已针对数据文件正确生成，可以通过在列表中同时选中任意数据文件及其对应的掩膜文件来进行检查。数据文件的第一帧将显示出来，同时选中的掩膜文件也会显示。此处我们可以看到，掩膜文件适用于当前的分析任务。用户也可单独提供掩膜文件。当希望从当前数据文件创建掩膜文件时，我们建议使用 Image J。具体操作步骤如下：首先在 Image J 中打开需要创建掩膜文件的图像。然后使用多边形选择工具，通过沿细胞边缘逐点点击的方式开始在细胞周围创建掩膜。完成掩膜绘制后，双击鼠标以闭合整个多边形。完成此操作后，您将进入编辑、选择并创建蒙版。此时将生成一个反向蒙版。您需要将该蒙版文件保存为与数据文件相同的名称，并在末尾添加 _mask_file。现在，如果您提供自定义的掩膜文件，则需要让自动检测软件知道这些掩膜文件的存储位置。为此，请单击“查找掩膜文件”按钮，并导航至包含掩膜文件的目录。新的掩膜文件将随即填充到此处的列表中。在运行分析之前，确保每个数据文件都有对应的掩膜文件非常重要。现在，当您已加载数据集、准备好掩膜文件，并正确设置了帧率和像素尺寸，同时选择了输出目录后，您便可以最终决定是否在分析中包含分类步骤。如果启用了分类功能，除了检测胞吐事件外，每个胞吐事件还将被划分为四类中的一类。确定分析运行方式后，即可点击分析按钮开始分析。运行指示器将变为黄色，表示分析正在进行中，当分析完成后，指示器会恢复为绿色。当运行指示器由黄色变为绿色时，表明分析已完成，此时您会注意到在所选目录中已生成一个新的数据文件夹。在数据文件夹中，您会找到与分析运行中每个图像集相对应的分析文件。此外，此处还有一个细胞统计文件，其中包含每个图像集的胞吐频率等汇总信息。对于每个图像集，您都拥有一个荧光轨迹文件，该文件包含胞吐事件发生位置的X坐标、Y坐标以及帧编号信息。此外，每个胞吐事件周围感兴趣区域的平均荧光强度在胞吐发生前、发生期间及发生后均有所呈现。同时，还提供一个追踪文件，其中包含各个事件在 X、Y 空间位置和时间上的类似信息。然而，如果选中了分类复选框，则该文件还将额外包含四列数据，分别表示该胞吐事件属于四种类别中某一类的概率。全囊泡融合瞬时、全囊泡融合延迟、吻合释放瞬时或吻合释放延迟。如果某个胞吐事件在四种类别中的概率大于0.5，并且是这四种类别中概率最高的，则该事件属于其中概率最高的类别。在此情况下，此处的第一个胞吐事件属于全囊泡融合瞬时类别，因为它在四种类别中的数值最高，且大于0.5。此外，每组图像还包含多个其他特征文件，这些文件在胞吐作用的分类过程中使用，也可能对进一步分析具有参考价值。最后，如果我们希望使用Ripley's K分析来检测胞吐作用的空间-时间组织特性，则需要首先将掩膜文件分割为神经突掩膜文件和胞体掩膜文件。为此，我们首先在Image J中打开掩膜文件，并使用颜色选取工具选择一个背景像素。通过这种方式，当我们填写掩膜文件时，就能得到正确的数值。接下来，我们将使用多边形选择工具勾勒出体细胞区域。这一过程需要一定的主观判断和手动操作决策。我们建议使用一个大致的椭球体。完成该操作后，您将进入编辑、选择并创建蒙版。最后，返回到原始的细胞体蒙版文件，使用编辑和填充功能来填充细胞体，现在我们就得到了独立的神经突和细胞体蒙版文件，您需要将其保存。保存好独立的神经突和胞体掩膜文件后，我将掩膜文件分别命名为“neur”（代表神经突）和“soma”（代表胞体），接着进入 MATLAB 并打开神经突二维网络 MATLAB 文件。在此，我们将当前文件夹导航至存放所有分析数据的目录。完成此操作后，再将掩膜文件路径更改为新的神经突掩膜文件。在这种情况下，我的神经突掩膜文件位于“掩膜文件”文件夹下。接下来，我们将修改CSV文件名，以指向荧光轨迹文件所在的位置。本例中，该文件仍在“数据文件”文件夹中，因此路径为“数据文件”斜杠，后接荧光轨迹CSV文件的名称。完成此步骤后，即可点击运行。这将生成神经突掩膜文件的骨架化版本，并将其作为 CSV 文件保存至掩膜文件夹下，我们可在此处查看。接下来，我们还将为胞体生成一个 CSV 文件。为此，请打开 CSV 掩膜创建文件。您需要输入胞体掩膜的路径，以及要创建的 CSV 文件的名称。在此，我直接使用了完全相同的文件名，仅添加了 .CSV 扩展名。点击运行，您将看到已生成一个新的胞体CSV文件，并与神经突文件并列存放。在我们为神经突掩模和胞体掩模均创建了CSV文件后，便可执行Ripley's K分析。为此，我们将切换至R Studio，并打开Ripley's K分析的R文件。这里需要注意两个主要变量：神经元掩膜和神经元数据点。神经元掩膜将指向你希望运行的任意掩膜文件。在此示例中，我首先运行的是胞体掩膜文件。您需要将所有胞体掩膜文件与所有神经突掩膜文件分开运行。在此，我有两个神经元用于本次分析。然而，您可以根据需要使用任意数量的神经元进行Ripley's K分析，只需复制并粘贴此神经元掩膜代码，并将变量更改为三或更高即可。第二个变量是神经元数据点。这里需要将其指向由你提取所有特征的 R 文件所生成的文件。我的文件命名为 fusion stats，因此这里读取的就是该文件。如前所述，我有第二个胞体掩膜文件和神经元，将与当前样本一同进行分析，以便合并计算Ripley's K值。在将这些路径更改为正确的路径后，您将运行代码、运行区域以及运行全部。运行完成后，将生成多个图表，包括分组的Ripley's K值以及密度图。可以通过以下步骤保存：进入导出选项，选择“另存为图像”，然后选择合适的图像格式、保存目录和文件名，最后点击保存。此处展示的是在体外培养两天后，利用全内反射荧光显微镜（TIRF）成像的12个表达vent到fluorine的小鼠皮层神经元的代表性结果。在图A中，我们看到不同类别下胞吐频率的分布情况。在此我们可以观察到，囊泡完全融合瞬时发生的频率高于其他类别。在图B中，通过模式分布可以确认，囊泡完全融合瞬时事件占所有事件的一半以上。在图C中，我们以热图形式确定胞吐作用的空间分布。我们可以观察到，大部分胞吐事件聚集在胞体附近的热点区域，以及神经突的远端。在图D中可以确定，胞吐事件在统计学上显著聚集，且这些簇的大小范围从半微米到一微米不等。使用自动化分析程序以无偏倚的方式准确识别和分析胞吐事件，可提高分析效率，并增强可重复性与严谨性。为了确保检测的准确性，成像过程中必须保持较高的信噪比。捕捉胞吐事件或其他对pH敏感的瞬时事件时，需要足够快的成像频率，以记录所有事件并提高对荧光半衰期或峰值变化等参数的估算精度。我们已证明，该程序不仅能够准确捕捉发育中神经元的pH敏感性荧光，同样适用于其他细胞类型。然而，如果使用其他细胞类型，则需要注意由于瞬时事件在不同细胞类型中行为的差异，可能导致准确性有所不同。迄今为止，该分类方法仅应用于发育中的神经元。事实上，我们尚不清楚这些过程是否存在于其他细胞类型中，或在神经元发育后期的时间点是否存在。

automated-detection-and-analysis-of-exocytosis

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

外分泌物的自动检测和分析

本视频展示了一种用于可视化肥大细胞中胞吐作用的技术。将细胞与FITC-葡聚糖（一种荧光报告分子）共同孵育，该分子会被细胞摄取并进入分泌颗粒（SGs）内，由于分泌颗粒内的酸性pH环境会淬灭其荧光。当刺激引发分泌颗粒发生胞吐时，外界中性pH的培养基使得报告分子在融合后的分泌颗粒内恢复荧光，可通过荧光显微镜观察到这一现象。...

一种体外可视化肥大细胞分泌颗粒胞吐作用的技术

网格蛋白介导的内吞作用是一种快速且高度动态的过程，可将多种蛋白质（包括信号受体）内化。本文所述的实验方案可直接可视化单个内吞事件的动力学过程。这对于理解内吞机制核心组分之间如何相互协调，以及蛋白质货物如何影响该过程至关重要。...

通过全内反射荧光显微镜以单事件分辨率可视化G蛋白偶联受体的网格蛋白介导的内吞作用

使用流式细胞术（FCM）检测细胞外囊泡（EVs）的方法有多种。在确定最合适的检测方法时，应考虑多个方面。本文介绍了两种检测EVs的方案，分别采用单颗粒检测法或基于微球的方法。...

使用流式细胞术分析细胞外囊泡的技术

本研究的目的是 该方案旨在建立一种可用于肥大细胞分泌功能基因组学分析的方法。该方法基于对与目的基因共转染的荧光报告基因释放量的定量评估，并结合实时检测 分泌颗粒形态的分析。...

探究肥大细胞分泌颗粒：从生物合成到胞吐作用

通过将突触小泡蛋白与pHluorin融合后的光学显微镜检测以及突触小泡摄取的电子显微镜观察，可检测突触小泡的内吞作用。...

在培养的海马神经元中测量突触囊泡内吞作用

渗透压应激影响胞吐作用以及在此过程中释放的神经递质的量。我们展示了如何结合电化学方法与透射电子显微镜技术，用于研究细胞外渗透压对胞吐活性、囊泡量子大小以及胞吐过程中释放的神经递质量的影响。...

监测渗透压胁迫对分泌囊泡及胞吐作用的影响

本文详细介绍了一种用于活细胞成像检测调控性胞吐作用的方法。该方法利用可积聚于溶酶体相关细胞器中的异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran）作为报告分子。这一简便的方法还可用于区分难以进行遗传操作的细胞中不同模式的调控性胞吐作用。...

成像FITC-葡聚糖作为调控性胞吐作用的报告分子

胞葬作用（efferocytosis）是指吞噬细胞清除凋亡细胞的过程，对于维持机体稳态至关重要，该过程依赖于一系列受体和信号通路，以实现对凋亡细胞的识别、吞噬和内化。本文介绍了一种利用荧光显微镜定量分析胞葬作用及其相关信号通路活性的实验方案。...

通过单细胞荧光显微镜定量测定胞葬作用

在微图形化细胞上进行溶酶体胞吐的活体成像，可实现对该过程的空间定量分析。利用微图形进行形态学标准化，是揭示细胞过程空间分布普遍规律的有力工具。...

量化微图形化细胞中细胞外排的时空参数

本方案描述了检测和定量秀丽隐杆线虫（C. elegans）细胞以膜结合型胞外小体形式释放的大分子聚集体和/或细胞器外排物（约4...

定量评分方法 体内 大型外吐囊泡中的神经元聚集体和细胞器外排 秀丽隐杆线虫

学习使用MATLAB自动检测和分析TIRF显微镜下的外分泌事件。该计算流程结合计算机视觉算法，可对融合事件进行分类并评估时空分布特征，提高分析效率与可重复性。

胞吐作用的自动检测与分析

探索更多视频