Name: 模拟小鼠中风:通过颈外动脉的短暂性脑中动脉闭塞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学习使用线栓法建立小鼠短暂性大脑中动脉闭塞模型，通过颈外动脉插入线栓实现可逆性缺血。该方法无需开颅即可模拟人类中风后的血流再灌注，适用于神经科学研究。

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感谢免疫性卒中联盟（ImmunoStroke Consortia，FOR 2879，“从免疫细胞到卒中恢复”）的所有合作成员提供的建议和讨论。本研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG，德国研究基金会）资助，资助项目包括德国卓越战略框架下的慕尼黑系统神经学集群（Munich Cluster for Systems Neurology，EXC 2145 SyNergy - 编号 390857198），以及基金项目 LI-2534/6-1、LI-2534/7-1 和 LL-112/1-1。

本视频中报道的实验遵循国家关于实验动物使用的规定，并已获得德国政府委员会（德国慕尼黑上巴伐利亚行政区政府）的批准。实验使用10周龄雄性C57Bl/6J小鼠，在受控温度（22 ± 2 °C）条件下饲养，光照-黑暗周期为12小时，可自由摄取颗粒饲料和饮水ad libitum。
1. 材料与仪器的准备
<ol>
	<li>连接加热毯，以在麻醉期间维持手术区域及小鼠体温在 37 °C。</li>
	<li>将剪刀和镊子进行高压灭菌，准备 70% 乙醇溶液，并备好泛醇眼膏、若干棉片以及 5-0 涂层编织聚酯缝合线以供使用。准备一支 1 mL 注射器，内含 0.9% 生理盐水溶液（不带针头），用于保持动物切口部位湿润。准备麻醉气体（100% O2 + 异氟烷）。</li>
	<li>通过截取 10 µL 移液器吸头的尖端（3–5 mm 长度）制作用于固定激光多普勒探头的支架。 
	注意：所有器械均使用热珠灭菌器进行灭菌。手术前后均使用微生物消毒喷雾对表面进行消毒。术前使用伤口消毒喷雾对小鼠头部和胸部周围区域进行消毒。</li>
</ol>
2. 激光多普勒仪的准备
<ol>
	<li>手术前30分钟向小鼠注射镇痛剂（卡洛芬4 mg/kg，布托啡诺0.1 mg/kg，腹腔注射）。</li>
	<li>将小鼠置于诱导室中，以4%异氟烷气流麻醉，直至其自发身体运动和触须活动停止。</li>
	<li>将小鼠俯卧位固定于手术区域，鼻部置于麻醉面罩中。维持异氟烷浓度为4%持续一分钟，随后降低并维持在2%。</li>
	<li>设置配套的反馈控制加热垫，以维持小鼠体温在37 °C，并轻轻插入直肠探头，全程监测手术期间体温。</li>
	<li>在双眼上涂抹右旋泛醇眼膏。</li>
	<li>用70%乙醇对左眼和左耳周围的皮肤及毛发进行消毒。</li>
	<li>在左耳与左眼之间切开头皮（长约1 cm），暴露颅骨。</li>
	<li>切开并分离颞肌，以显露颅骨下方的中脑动脉（MCA）。</li>
	<li>用胶水将激光多普勒探头/光纤的尖端固定架外端固定于左侧中脑动脉（MCA）上方。随后，用胶水将皮肤缝合，封闭固定架周围的切口。滴加2–3滴固化胶以加快固化速度。确保激光多普勒光纤未被粘固，可随时轻松从固定架中取出。</li>
</ol>
3. 短暂性大脑中动脉闭塞模型（阻塞）
<ol>
	<li>将小鼠置于仰卧位，把其鼻部放入麻醉锥中，并用胶带固定四肢。</li>
	<li>消毒胸部周围的皮肤和毛发，在颈部做一条长约2 cm的正中切口。</li>
	<li>使用镊子分离皮肤和&#160;下颌下腺。使用牵开器固定胸锁乳突肌，&#160;暴露手术视野，找到左侧颈总动脉（CCA）。将颈总动脉从周围结缔组织和神经中游离出来（注意不要损伤迷走神经），并在分叉前进行临时结扎。</li>
	<li>游离颈外动脉（ECA），在其最远端可见处打一个永久结扎结。在靠近分叉处的颈外动脉下方穿另一根缝线，留一个松结以备后续使用。</li>
	<li>游离颈内动脉（ICA），并在分叉上方约5 mm处放置一个微血管夹。操作时务必避免损伤迷走神经。</li>
	<li>在紧结与松结之间的颈外动脉上剪一个小孔，注意不要完全切断颈外动脉。</li>
	<li>将尼龙线插入并沿颈总动脉方向推进。收紧颈外动脉上的松结，短暂固定尼龙线位置，以防止移除微血管夹时发生出血。&#160;</li>
	<li>移除微血管夹，继续将尼龙线经颈内动脉推进，直至激光多普勒血流仪检测到脑血流量急剧下降（&#62;80%），表明已到达大脑中动脉（MCA）起始处。通过进一步收紧颈外动脉周围的结扎线，固定尼龙线位置。 
	注意：当尼龙线方向正确时，推进过程应顺畅无阻力。</li>
	<li>记录插入尼龙线前后激光多普勒的数值。</li>
	<li>取出牵开器，在缝合伤口前复位胸锁乳突肌和下颌下腺。移除激光多普勒探头，将动物置于37 °C的恢复舱中1小时（直至取出尼龙线）。</li>
</ol>
4. 短暂性大脑中动脉闭塞模型（再灌注）
<ol>
	<li>将小鼠置于诱导室中，以4%异氟烷气流麻醉，直至其自发性身体运动和触须活动停止。</li>
	<li>在双眼上涂抹右旋泛醇眼膏。</li>
	<li>将小鼠俯卧位固定于手术区域，鼻部接入麻醉面罩。维持异氟烷浓度为4%，持续一分钟，随后降低并维持在2%。用胶带固定动物的四肢。</li>
	<li>将激光多普勒探头插入探头支架中。</li>
	<li>拆除伤口缝线，使用镊子将皮肤与下颌下腺分离。使用牵开器轻柔牵开胸锁乳突肌，暴露手术视野。</li>
	<li>松开结扎外颈动脉（ECA）的缝线以释放栓线，并轻柔抽出栓线。移除过程中避免损伤栓线的硅胶-橡胶涂层。</li>
	<li>紧密结扎外颈动脉（ECA）的缝线。</li>
	<li>在激光多普勒设备上确认脑血流量增加（&#62;再灌注前初始值的80%）。</li>
	<li>记录栓线移除前后激光多普勒的数值。</li>
	<li>开放颈总动脉（CCA）分叉处之前的临时结扎。</li>
	<li>移除牵开器，在缝合伤口前复位胸锁乳突肌和下颌下腺。将动物置于37 °C的恢复室中1小时，以苏醒麻醉。</li>
	<li>苏醒后，将小鼠放回温度可控房间内的笼具中。</li>
	<li>术后至第3天，在笼底的小培养皿中添加湿粮颗粒和水凝胶，以加强动物护理。</li>
	<li>术后3天内每12小时注射一次镇痛剂（4 mg/kg 卡洛芬和0.1 mg/kg 布托啡诺）。</li>
</ol>
5. 假手术操作
<ol>
	<li>按照上述步骤进行所有操作，包括动脉结扎和线栓插入（步骤1-3.7）。</li>
	<li>插入线栓后立即撤出，随后将动物放入恢复室中恢复1小时。</li>
	<li>再次将动物置于手术区域，解除颈总动脉（CCA）的临时结扎，以确保脑血流完全恢复。</li>
	<li>缝合伤口，并将动物置于37 °C的恢复室中1小时，使其从麻醉中恢复；恢复后，将小鼠放回温度可控房间内的笼具中。</li>
	<li>术后第3天内，在笼底的小培养皿中添加湿润饲料颗粒和水凝胶，以照顾动物。</li>
	<li>术后3天内每12小时注射一次镇痛剂（4 mg/kg 卡洛芬和0.1 mg/kg 布托啡诺）。</li>
</ol>
6. 神经评分
<ol>
	<li>每天在同一时间进行神经功能评分，并穿着手术服以保持无菌环境 &#34;无气味&#34; 不同外科医生之间。</li>
	<li>让小鼠在房间内休息 30 分钟 &#34;开放&#34; 测试前的笼子。</li>
	<li>观察每件物品 表1 和 表 2 30 秒。</li>
</ol>
7. 心内灌注
<ol>
	<li>准备一个含有磷酸盐缓冲液（PBS）-肝素（2 U/mL）的 20 mL 注射器，并将其置于实验台上方 1 m 处，以利于重力驱动灌注。（可选：使用含有 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 溶液（pH 7.4）的 20 mL 注射器进行心脏内灌注。）</li>
	<li>腹腔注射 100 µL 氯胺酮和赛拉嗪（剂量分别为 120 和 16&#160;mg/kg 体重）。等待 5 分钟，并确认动物自发性身体运动和触须活动停止。</li>
	<li>将动物固定于仰卧位，并用 70% 乙醇对腹部表面进行消毒。</li>
	<li>在腹部做一条长约 3 cm 的切口；剪开膈肌、肋骨和胸骨，以充分暴露心脏。</li>
	<li>在右心房做一小切口，将灌注导管插入左心室。</li>
	<li>用 20 mL PBS-肝素溶液进行灌注。</li>
	<li>灌注完成后，将动物断头并取出脑组织。</li>
	<li>将脑组织置于粉末状干冰上速冻，随后于 -80 °C 保存，直至进一步使用。</li>
</ol>
8. 梗死体积测量
<ol>
	<li>进行冷冻切片时，使用冷冻切片机将脑组织每隔 400 µm 切成 20-µm 厚的切片。将切片置于载玻片上，并将载玻片储存于 −80 °C，直至使用。</li>
	<li>焦油紫（CV）染色
	<ol>
		<li>通过搅拌并加热（60 °C）将 0.5 g 焦油紫乙酸盐溶于 500 mL H2O 中，直至晶体完全溶解。溶液冷却后，储存于避光瓶中。每次使用前重新加热至 60 °C 并过滤。</li>
		<li>将载玻片在室温下干燥 30 分钟。依次浸入 95% 乙醇中 15 分钟、70% 乙醇中 1 分钟，再浸入 50% 乙醇中 1 分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入蒸馏水中 2 分钟；更换蒸馏水后再次浸入 1 分钟。随后，将载玻片浸入预热至 60 °C 的染色液中染色 10 分钟。之后用蒸馏水漂洗两次，每次 1 分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入 95% 乙醇中 2 分钟；再置于 100% 乙醇中 5 分钟；更换 100% 乙醇后再次浸入 2 分钟。随后，用封片剂封片。</li>
		<li>分析（图 4C）
		<ol>
			<li>扫描载玻片，并采用 Swanson 方法12通过以下&#160;公式校正水肿后计算间接梗死体积： 
			（缺血面积）=（缺血区域）−（（同侧半球）−（对侧半球））</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Stroke.</a> Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).</li>
<li>O'Collins, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1%2C026+experimental+treatments+in+acute+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">1,026 experimental treatments in acute stroke.</a> Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).</li>
<li>Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infarct+volume+quantification+in+mouse+focal+cerebral+ischemia%3A+a+comparison+of+triphenyltetrazolium+chloride+and+cresyl+violet+staining+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques.</a> Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+rat+model+of+thrombotic+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 17 (2), 123-135 (1997).</li>
<li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li>
<li>Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+stroke%3A+size%2C+mechanism%2C+and+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose.</a> NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).</li>
<li>Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+stroke+in+mice+-+middle+cerebral+artery+occlusion+with+the+filament+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423(2011).</li>
<li>Dirnagl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concerted+appeal+for+international+cooperation+in+preclinical+stroke+research%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research.</a> Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).</li>
<li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journals+unite+for+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Journals unite for reproducibility.</a> Science. 346 (6210), 679(2014).</li>
<li>Llovera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+of+a+preclinical+randomized+controlled+multicenter+trial+%28pRCT%29%3A+Anti-CD49d+treatment+for+acute+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li>
<li>Llovera, G., Liesz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+step+in+translational+research%3A+lessons+learned+from+the+first+preclinical+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial.</a> Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).</li>
<li>Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial+differences+in+the+early+detection+of+breast+cancer+in+metropolitan+Detroit%2C+1978+to+1987%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987.</a> Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).</li>
<li>Lourbopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inadequate+food+and+water+intake+determine+mortality+following+stroke+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2084-2097 (2017).</li>
<li>Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monofilament+intraluminal+middle+cerebral+artery+occlusion+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Research%22%5BJournal%5D)">Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse.</a> Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).</li>
<li>Jackman, K., Kunz, A., Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+focal+cerebral+ischemia+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling focal cerebral ischemia in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 793, 195-209 (2011).</li>
<li>Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhalational+anesthetics+as+neuroprotectants+or+chemical+preconditioning+agents+in+ischemic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).</li>
<li>Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+intraluminal+MCAO%3A+cerebral+infarct+evaluation+by+cresyl+violet+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4038(2012).</li>
<li>Rha, J. H., Saver, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+recanalization+on+ischemic+stroke+outcome%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">The impact of recanalization on ischemic stroke outcome: a meta-analysis.</a> Stroke. 38 (3), 967-973 (2007).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+filament+occlusion+of+the+middle+cerebral+artery+in+rats%3A+does+the+reperfusion+method+matter+24+hours+after+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transient filament occlusion of the middle cerebral artery in rats: does the reperfusion method matter 24 hours after perfusion.</a> BMC Neuroscience. 13, 154(2012).</li>
<li>Sommer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke%3A+experimental+models+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).</li>
<li>Jones, B. J., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rotarod+suitable+for+quantitative+measurements+of+motor+incoordination+in+naive+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn-Schmiedebergs+Archiv+f%C3%BCr+Experimentelle+Pathologie+und+Pharmakologie%22%5BJournal%5D)">A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 259 (2), 211(1968).</li>
<li>Bouet, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adhesive+removal+test%3A+a+sensitive+method+to+assess+sensorimotor+deficits+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice.</a> Nature Protocols. 4 (10), 1560-1564 (2009).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+test+for+detecting+long-term+sensorimotor+dysfunction+in+the+mouse+after+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia.</a> Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 207-214 (2002).</li>
<li>Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+plasticity+and+assessment+of+forelimb+sensorimotor+outcome+in+unilateral+rat+models+of+stroke%2C+cortical+ablation%2C+parkinsonism+and+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury.</a> Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).</li>
<li>Roth, S., Yang, J., Cramer, J., Malik, R., Liesz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+cytokine-induced+sickness+behavior+after+ischemic+stroke+by+an+optimized+behavioral+assessment+battery%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Detection of cytokine-induced sickness behavior after ischemic stroke by an optimized behavioral assessment battery.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 91, 668-672 (2021).</li>
</ol>

作者无任何竞争利益需要披露。

本方案描述了一种基于德国多中心研究联盟（“ImmunoStroke”）共识的实验性脑卒中模型，旨在建立标准化的短暂性大脑中动脉阻塞（MCAo）模型。该短暂性MCAo模型通过将一根硅胶包被的细丝从颈外动脉（ECA）插入至大脑中动脉（MCA）起始处，实现限定时间的动脉阻断后血流再通，是目前应用最广泛的脑卒中模型之一。因此，该方法可被视为具有转化相关性的脑卒中模型。
视频中介绍的“线栓模型”相较于其他既往描述的脑卒中模型具有一些优势，例如无需开颅，并可实现短暂闭塞血管的完全再灌注。然而，该手术操作的复杂性也可被视为一种局限性，因其涉及侵入性手术，并需对靠近气管和迷走神经的多条动脉进行精确操作。动物长时间暴露于麻醉剂下也可能是需要考虑的重要因素，因为麻醉剂对神经保护作用及脑卒中预后的影响已有充分报道16。最后，尽管该手术过程较为复杂，但由经过训练的外科医生操作时，大约可在20分钟内完成。
与先前描述的“线栓”卒中模型17相比，本文所述方法还...

脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的最常见原因之一。尽管脑卒中主要分为缺血性和出血性两种类型，但所有脑卒中病例中约有80–85%为缺血性脑卒中1。目前，针对缺血性脑卒中患者仅有两种可用的治疗方法：使用重组组织型纤溶酶原激活剂（rtPA）进行药物溶栓治疗，或实施机械取栓术。然而，由于治疗时间窗狭窄以及存在多种排除标准，仅有少数患者能够从这些特定治疗中获益。在过去二十年中，临床前及转化脑卒中研究主要集中于神经保护策略的探索。然而，迄今为止，所有进入临床试验的神经保护药物均未能显示出对患者的明显疗效2。&#160;
由于体外（in vitro）模型无法准确再现脑卒中所有的脑内相互作用及病理生理机制，动物模型在脑卒中临床前研究中至关重要。然而，单一动物模型难以完全模拟人类缺血性脑卒中的所有特征，因为缺血性脑卒中是一种高度复杂且异质性的疾病。因此，针对不同物种已陆续开发出多种缺血性脑卒中模型。其中，脑皮层小动脉的光化学血栓模型或大脑中动脉远端永久性阻塞模型常用于诱导新皮层内小范围且定位明确的病灶3,4。除此之外，目前最常用的脑卒中模型可能是所谓的“线栓模型”，该模型通过暂时性阻塞大脑中动脉（MCA）实现。该模型通过将缝合线栓短暂插入至MCA起始处，导致脑血流急剧减少，进而引起皮层下及皮层脑区的大范围梗死5。尽管大多数脑卒中模型均模拟MCA阻塞6，但&#34;线栓模型&#34;能够精确控制缺血时间。通过移除线栓实现再灌注，可模拟临床上自发性或经治疗（如rtPA溶栓或机械取栓）后血栓溶解所导致的脑血流恢复。迄今为止，已有多种该“线栓模型”的改良方法被报道。其中最常用的方法由Longa et al. 于1989年首次描述5，即通过颈总动脉（CCA）插入一根硅胶包被的线栓至MCA起始处7。尽管该方法被广泛应用，但在再灌注过程中无法实现血流的完全恢复，因为在线栓移除后，CCA被永久性结扎。
在过去十年中，越来越多的研究团队对使用这种“线栓模型”在小鼠中建立脑卒中模型产生了兴趣。然而，该模型存在较大的变异性，且操作流程缺乏标准化，这些因素是迄今为止实验结果和科学发现变异程度高、可重复性差的部分原因2,8。当前所谓的“可重复性危机”——即不同研究实验室之间可重复性较低——一个可能的原因是，即使采用相同实验方法的不同研究团队，其脑卒中梗死体积仍不具备可比性9。事实上，在开展首次临床前随机对照多中心试验研究后10，我们证实了该实验性脑卒中模型及其后续结局参数缺乏充分的标准化，是导致不同独立实验室之间临床前研究结果无法重复的主要原因11。尽管采用了相同的脑卒中模型，但最终梗死体积仍存在显著差异，这不仅对验证性研究构成了合理担忧，也因缺乏稳健且可重复的模型而影响了科学合作。
鉴于这些挑战，我们的目标是开发并详细描述一种标准化的短暂性大脑中动脉闭塞（MCAo）模型的操作流程，该模型用于“ImmunoStroke”研究联盟（https://immunostroke.de/）内部的协作研究。该联盟旨在揭示脑-免疫相互作用在卒中恢复机制原理中的作用。此外，本文还介绍了用于卒中结局分析的组织学及相关功能学方法。所有方法均基于ImmunoStroke联盟各研究实验室所采用的既定标准操作程序。

<table><tbody><tr><td>45&amp;deg; 斜坡</td><td>H&amp;S Kunststofftechnik</td><td></td><td>高度：18 cm</td></tr><tr><td>5/0 缝合线</td><td>Pearsalls</td><td>10C103000</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma Life Science</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷麻醉系统</td><td>Drager</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen 软膏</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6J 小鼠</td><td>Charles River</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>夹子</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>夹钳</td><td>FST</td><td>18055-04</td><td></td></tr><tr><td>夹钳 holder</td><td>FST</td><td>18057-14</td><td></td></tr><tr><td>棉球</td><td>NOBA Verbondmitel Danz</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>焦油紫</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Thermo Scientific CryoStarNX70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>521005</td><td></td></tr><tr><td>96% 乙醇</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>522078</td><td></td></tr><tr><td>99% 乙醇</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>ETO-5000-99-1</td><td></td></tr><tr><td>丝线</td><td>Doccol</td><td>602112PK5Re</td><td></td></tr><tr><td>精细45°角镊子</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>FST</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>胶水</td><td>Orechseln</td><td>BSI-112</td><td></td></tr><tr><td>胶水固化剂</td><td>Drechseln &amp; Mehr</td><td>BSI-151</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>FHC DC Temperature Controller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Abbot</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>异戊烷</td><td>Fluka</td><td>59070</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>激光多普勒仪</td><td>Perimed</td><td>PF 5010 LDPM, Periflux System 5000</td><td></td></tr><tr><td>激光多普勒探头</td><td>Perimed</td><td>91-00123</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 pH: 7.4</td><td>Apotheke Innestadt Uni Munchen</td><td>P32799</td><td></td></tr><tr><td>恢复室</td><td>Mediheat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histokit 封片介质</td><td>Roth</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水溶液</td><td>Braun</td><td>131321</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Feather</td><td>02.001.30.011</td><td></td></tr><tr><td>硅涂层丝线</td><td>Doccol</td><td>602112PK5Re</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪刀</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Albrecht</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠卒中模型构建：经由颈外动脉进行短暂性大脑中动脉阻塞

Modeling Stroke in Mice: Transient Middle Cerebral Artery Occlusion via the External Carotid Artery

脑卒中是发达国家中导致死亡的第三大常见原因，也是成人获得性残疾的首要原因。迄今为止，仅有少数脑卒中患者在发病后的最初几小时内能够接受有限的治疗选择。目前，研究人员正在广泛探索新的治疗策略，特别是旨在延长治疗时间窗的方法。这些研究包括对脑卒中后重要病理生理通路的深入分析，例如卒中后炎症反应、血管生成、神经元可塑性以及再生过程。在过去十年中，不同独立研究团队之间实验结果和科学发现的可重复性差的问题日益引起关注。为应对所谓的“可重复性危机”，迫切需要建立所有实验操作的详细标准化模型。作为“ImmunoStroke”研究联盟（https://immunostroke.de/）的一项努力，本文提出了一种标准化的小鼠短暂性大脑中动脉闭塞（MCAo）模型。该模型在撤除栓线后可实现血流的完全恢复，模拟了在大多数人类脑卒中患者中发生的治疗性或自发性血栓溶解过程。随附视频展示了该“栓线法”脑卒中模型的手术操作步骤及其功能分析工具。

本文所述模型是对常用的“线栓”脑卒中模型的一种改良，该模型通过将一根硅化处理的线栓从颈外动脉（ECA）插入，暂时阻塞大脑中动脉（MCA）的起始部（图1）。在撤出线栓后，仅颈外动脉的血流被永久性阻断，而颈总动脉（CCA）和颈内动脉（ICA）可实现完全再通。这使得脑组织获得充分的再灌注（图2），类似于临床上人类患者在接受成功的药物溶栓或机械取栓治疗后所观察到的情况。此外，本研究还描述了一种通过将连接激光多普勒探头的导管固定于颅骨上MCA供血区域，从而在阻塞和再灌注过程中连续监测脑血流量的方法。
该手术的总体死亡率为 &lt;5%（由经过培训的外科医生操作时）。在MCAo术后早期，动物通常表现出严重的姿势和运动功能障碍、全身性虚弱以及体重下降。13这些严重缺陷是暂时性的，动物在大约1周后活动能力有所改善；因此，这些缺陷更特异于局灶性神经症状。
大脑中动脉闭塞后的行为缺...

在实验性脑卒中研究中，采用多种大脑中动脉阻塞（MCAo）模型。本文描述了一种通过颈外动脉（ECA）实现的短暂性MCAo实验性脑卒中模型，旨在模拟人类脑卒中情况下因自发性血栓溶解或治疗干预导致脑血管血栓被清除的情形。

脑卒中是发达国家中导致死亡的第三大原因，也是成人获得性残疾的首要原因。迄今为止，治疗选择……

在本文所述的线栓模型中，完全恢复血流并记录血流情况，是确保小鼠之间具有可重复性的重要条件，尤其是在转化性卒中研究中。与之前描述的其他卒中模型相比，该模型具有两个主要优势：无需开颅手术，且能够实现血管的完全再灌注。丝状模型是一种复杂的外科手术干预，涉及对不同动脉的操作处理。对所有这些步骤进行可视化和详细解释，尽管每一步看似微小，却至关重要，可能加速神经外科医生的学习过程。连接加热毯，以在麻醉期间维持手术区域及小鼠体温在37摄氏度。准备高压灭菌的剪刀和镊子、70%乙醇溶液和右泛醇眼膏，并备好若干棉片以及五氧涂层编织聚酯缝合线，以备使用。用1毫升无针头注射器抽取0.9%生理盐水溶液，以保持切口部位湿润。通过剪去10微升移液器吸头的尖端，制备激光多普勒探头的固定装置。当小鼠完全麻醉后，将其置于手术区域的俯卧位。轻轻插入直肠探头，以在手术过程中持续监测体温。消毒手术部位后，从左耳与眼睛之间的头皮处剪开，暴露颅骨。接下来，剪开并移置颞肌，以暴露颅骨下方的大脑中动脉（MCA）。使用胶水将固定激光多普勒探头或光纤尖端的外端部分置于左侧大脑中动脉上方，并缝合皮肤，使皮肤也粘附固定。滴加两到三滴固化胶以加快固化过程。确保激光多普勒光纤未被粘住，可随时从探头支架中轻松取出。将小鼠转为仰卧位，然后将吻部放入麻醉罩中，并用胶带固定四肢。消毒胸部周围的皮肤和毛发，在颈部做一条长两厘米的正中切口。使用镊子将下颌下腺与胸锁乳突肌的皮肤分开。使用牵开器暴露手术区域，并找到左侧颈总动脉（CCA）。从结缔组织及周围神经中仔细分离颈总动脉，避免损伤迷走神经，并在动脉分叉前进行暂时性结扎。游离颈外动脉（ECA），并在其最远端可见部位打一永久结。在ECA近分叉处下方放置另一根缝线，预备一个松结以备后续使用。游离颈内动脉（ICA），并在分叉上方约5毫米处放置一个显微血管夹。注意不要损伤迷走神经。然后在紧结扎和松结扎之间的 ECA 上剪一个小孔，注意不要完全切断 ECA。插入线栓并向前推进至 CCA。收紧 ECA 中围绕管腔的松动结扎线，暂时固定栓线的位置。移除微血管夹并防止出血。移除微血管夹后，将栓线经 ICA 插入，直至到达 MCA 的起始处。通过进一步拧紧颈外动脉（ECA）周围的结来固定尼龙线。记录插入尼龙线前后激光多普勒的数值。移除牵开器，并在缝合伤口前将胸锁乳突肌复位于下颌下腺下方。移除激光多普勒探头，将动物置于37摄氏度的恢复室中，持续一小时。将小鼠俯卧位放置于操作区域，使其鼻部位于麻醉面罩内，然后用胶带固定动物的四肢。将激光多普勒探头插入探头支架中。拆除伤口缝线，用镊子将皮肤、下颌下腺和胸锁乳突肌分开。使用拉钩暴露手术区域。松开结扎外颈动脉（ECA）的缝线以解除对尼龙线的束缚，然后轻柔地抽出尼龙线。在取出细丝时避免损伤其硅胶橡胶涂层。记录细丝取出前后激光多普勒仪的数值。牢固结扎ECA缝线，并确认激光多普勒仪上显示的脑血流量增加。在颈总动脉分叉处开放临时结扎，以恢复完全的血流。移除牵开器，并在缝合伤口前将胸锁乳突肌复位于下颌下腺下方。随后，将动物置于37摄氏度的恢复室中一小时，以从麻醉中恢复。恢复后，将小鼠放回温度可控房间内的笼子中，并通过在笼底的小培养皿中添加湿粮颗粒和水凝胶来照顾动物，术后每12小时注射一次镇痛剂，持续至术后第三天。当撤出栓线后颈总动脉（CCA）血流恢复时，脑部实现完全再灌注，此情况类似于人类患者成功接受机械取栓治疗后的状况。与假手术动物相比，卒中动物的综合性和局灶性神经功能评分出现显著变化，但总体神经功能评分无明显改变。脑梗死体积的评估也在卒中诱导后24小时通过冠状面连续脑切片的焦油紫染色进行。病灶区域包括体感皮层和运动皮层，以及皮层下结构，如纹状体。梗死体积平均为61至62平方毫米，占受累脑半球的48%。充分游离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉时，应避免损伤邻近组织（尤其是迷走神经），以清晰暴露所有结构，便于插入线栓并阻塞大脑中动脉起始部。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

模拟小鼠中风:通过颈外动脉的短暂性脑中动脉闭塞

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小鼠卒中模型——线栓法大脑中动脉阻塞

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小鼠大脑中动脉闭塞模型

大脑中动脉闭塞（MCAO）的管腔内模型是实验性缺血性卒中模型中最常用的模型。本文将结合激光多普勒血流仪的引导，详细演示该模型的全部操作步骤及其典型结果。...

小鼠缺血性卒中激光多普勒血流仪引导下经腔内大脑中动脉阻塞（MCAO）模型

本文介绍了小鼠大脑中动脉腔内阻塞模型。通过神经功能评分和焦油紫染色来评估脑梗死范围，后者是TTC染色的一种替代方法，具有可同时平行检测多种目的标志物的显著优势。...

大脑中动脉闭塞（MCAO）小鼠模型：通过焦油紫染色评估脑梗死

本视频介绍了利用硅涂层缝合丝阻塞大脑中动脉，在小鼠模型中建立短暂性脑卒中的操作步骤。 该模型可模拟人类脑卒中，有助于研究治疗脑卒中的新型治疗策略。...

基于纤维插入的短暂性脑卒中模型：一种在小鼠脑内实施大脑中动脉阻塞的手术方法

多种小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型广泛应用于实验性脑科学研究。本文展示了经颅永久性远端MCAO模型，该模型可产生稳定的皮质梗死，其大小与大多数人类缺血性卒中所造成的损伤相当。...

小鼠卒中模型：远端大脑中动脉永久性凝闭

大脑中动脉内栓线阻塞是啮齿类动物实验性脑卒中最常用的体内模型。本文采用一种可实现颈总动脉修复的替代性外科手术方法，能够恢复颈总动脉的血流，并实现大脑中动脉供血区域的完全再灌注。...

小鼠经颈总动脉修复实现再灌注的中脑动脉闭塞模型

本方案展示了一种具有中等大小梗死灶且存活率极佳的独特小鼠卒中模型。该模型可使临床前卒中研究者延长缺血时间、使用老龄小鼠，并评估长期功能学结果。...

一种改良的经颅大脑中动脉阻塞模型用于研究老年小鼠的中风结局

本方案描述了通过大脑中动脉腔内阻塞建立小鼠短暂性局灶性脑缺血模型的方法。此外，还展示了使用磁共振成像和行为学测试进行结果评估的示例。...

短暂性大脑中动脉闭塞卒中模型

本文介绍了一种通过经颅电凝法在C57BL/6J小鼠中建立远端大脑中动脉阻塞（dMCAO）模型的实验方案，并对随后的神经行为学表现及组织病理学特征进行评估。...

采用远端中动脉阻塞技术诱导小鼠急性缺血性脑卒中

本方案描述了一种大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注模型，该模型在不造成损伤的情况下保留了脑血管的解剖结构。...

一种不损伤脑血管解剖结构的大鼠中动脉闭塞/再灌注模型

学习使用线栓法建立小鼠短暂性大脑中动脉闭塞模型，通过颈外动脉插入线栓实现可逆性缺血。该方法无需开颅即可模拟人类中风后的血流再灌注，适用于神经科学研究。

小鼠卒中模型构建：经由颈外动脉进行短暂性大脑中动脉阻塞

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