Name: 门静脉注射结直肠癌类器官研究肝转移基质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-03T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学习门静脉注射结直肠癌类器官技术，建立富含成纤维细胞的肝转移模型，研究肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的相互作用，为开发针对基质的治疗策略提供可靠平台。

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本研究获得了以下资助：澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（D.L.W. 和 S.L.W. 获 APP1156391 资助；D.L.W. 获 APP1081852 资助；S.L.W. 获 APP1140236 资助；D.L.W. 获 APP1099283 资助）；南澳大利亚州卫生部代表癌症委员会南澳大利亚分会及其捐赠者以及南澳大利亚州政府提供的 Beat Cancer 项目资助（S.L.W. 和 D.L.W. 获 MCF0418 资助）；日本文部科学省委托的科学研究费补助金（B类）（M.T. 获 20H03467 资助）；日本医疗研究开发机构核心研究项目（AMED-CREST）（A.E. 获 19gm0810007h0104 和 19gm1210008s0101 资助）；日本医疗研究开发机构癌症研究与治疗创新项目（P-CREATE）（A.E. 获 19cm0106332h0002 资助）；日本学术振兴会青年研究人员海外挑战计划（H.K. 获资助）；武田科学基金会奖学金（H.K. 获资助）；Greaton 国际博士奖学金（H.K. 获资助）；Lions 医学研究基金会奖学金（K.G. 获资助）。
我们感谢澳大利亚新南威尔士州儿童医学研究所（CMRI）载体与基因组工程中心（VGEF）的 Leszek Lisowski 博士在重组腺相关病毒载体生产方面提供的帮助。

本文中所有动物实验程序均经南澳大利亚健康与医学研究所动物伦理委员会审查并批准（批准编号：SAM322）。
1. 腺相关病毒的尾静脉注射
注意：腺相关病毒（AAV）应按照生物安全等级1（Biosafety Level 1）指南作为生物危害物处理。有关AAV的制备、纯化和滴定，请参考已发表的实验方案33。本研究使用了具有肝细胞嗜性的AAV血清型AAV834，其携带由巨细胞病毒（CMV）启动子驱动的Islr基因25。为实现AAV介导的基因过表达，病毒剂量可能需要根据启动子活性、目的基因以及小鼠体重进行优化。
<ol>
	<li>将AAV载体稀释至150 µL等分试样中，每份含1.0 x 1011 病毒基因组，使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）并置于冰上。操作AAV时应穿戴个人防护装备。 
	注意：反复冻融会降低病毒滴度，应避免。病毒储备液应保存在 -80 °C 冰箱中。</li>
	<li>打开加热箱（动物保温舱），预热至 35 °C。</li>
	<li>抓持小鼠，并在尾静脉注射前至少15分钟将局部麻醉乳膏涂抹于整个尾部。 
	注意：如果机构的动物伦理委员会未作要求，此步骤为可选，可能无需执行。请遵循当地动物伦理委员会批准的实验方案。在本实验中25使用 Rosa26-Cas9 小鼠进行 AAV 注射，并随后经门静脉注射结直肠癌类器官。由于本研究中使用的肿瘤类器官来源于 Rosa26-Cas9 小鼠（C57BL/6 × 129 遗传背景），因此该小鼠品系也被用作具有免疫活性的同源移植受体。实验中使用了 6 至 24 周龄的雄性和雌性 Rosa26-Cas9 小鼠。</li>
	<li>将小鼠放入加热箱中，使其停留最多15分钟，以使尾部静脉温暖并扩张。</li>
	<li>将小鼠轻轻固定在啮齿类动物固定器中。将尾巴置于加热灯下，以确保尾静脉充分扩张。</li>
	<li>用带有27-30 G针头的低死腔无菌注射器吸取150 µL稀释后的AAV（按步骤1.1制备）。</li>
	<li>移动加热灯，辨识位于尾部两侧的侧尾静脉。用手指轻轻拉直尾部，使其伸展。</li>
	<li>将针头斜面朝上，缓慢插入静脉，深度为2-3 mm。针头应几乎与尾部平行（与尾部夹角不超过15°）。 
	注意：如果针头成功进入静脉，可能会观察到血液流入注射器中。</li>
	<li>缓慢注射。若感到阻力或观察到皮肤肿胀，应拔出针头，在第一个穿刺点上方或另一侧静脉重新穿刺。</li>
	<li>注射完成后等待约5秒，然后缓慢拔出针头。立即用干净的纱布或纸巾轻轻按压注射部位，直至出血停止。</li>
	<li>轻轻地将小鼠放回笼中。观察动物，确保出血已停止。 
	注意：在通过尾静脉注射 AAV 后 1 至 2 周可评估肝脏中的基因过表达。例如，可通过 RNA 检测确认 原位 原位杂交（ISH）、免疫组织化学（IHC）、蛋白质印迹（western blotting）或定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR； 图1A，B）。在先前已发表的研究中25，AAV8-Islr 用于过表达小鼠 Islr 肝细胞中的基因&#160;通过RNA原位杂交（RNA ISH）检测到过表达图1A，B).</li>
</ol>
2. 结直肠癌类器官的细胞准备
注意：本实验所用的结直肠癌类器官仅包含上皮细胞。结直肠癌类器官的培养与建立方法此前已有描述25,35。简言之，使用隐窝分离缓冲液（含5 mM EDTA（乙二胺四乙酸）的冰冻PBS）从Rosa26-Cas9小鼠的结肠中分离出正常的结肠上皮细胞，随后将其包埋于基底膜基质中，并在类器官生长培养基中进行培养，具体方法见参考文献35。随后，通过慢病毒表达系统过表达靶向Apc和Trp53的单导向RNA，在结肠上皮细胞中引入Apc和Trp53突变。单个类器官克隆经人工挑选获得25。ApcΔ/Δ和Trp53Δ/Δ结肠癌类器官（AP肿瘤类器官）以每只小鼠100 µL PBS中含5.0 × 105个单细胞的形式，加入10 µM Y-27632后注射至门静脉，类器官培养及单细胞制备方法如下所述。
<ol>
	<li>在进行门静脉注射前3-5天，将结直肠癌类器官培养于24孔板或10 cm培养皿中的基底膜基质小滴中，以获得直径为50-400 µm的类器官。</li>
	<li>加入Y-27632至终浓度10 µM，配制足够量的细胞解离溶液，用于消化本次注射所需数量的类器官，并在37 °C水浴中预热。 
	注：本方案所用的细胞解离溶液为重组细胞解离酶混合物，可替代胰蛋白酶用于类器官培养（参见材料表）。与胰蛋白酶相比，该溶液可减少细胞解离过程中造成的细胞损伤36。Y-27632是一种Rho激酶抑制剂，可抑制解离诱导的细胞死亡，从而提高单细胞存活率37。
	<ol>
		<li>若需向最多五只小鼠注射，准备两管各含40 mL细胞解离溶液，用于消化10-24个×50 µL的基底膜基质小滴，每个小滴约含300个类器官（直径50-400 µm），即每只小鼠注射2-4.8个小滴类器官（相当于约600-1440个类器官）。所需类器官数量取决于具体的类器官细胞系，因此应进行优化。 
		注：第二个40 mL管可用于使用新鲜细胞解离溶液重复消化，以获得解离的单细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小心吸除每个孔中的类器官培养基。</li>
	<li>向24孔板的每孔中加入1 mL冰上预冷的PBS。若使用10 cm培养皿，则向皿中加入10 mL冰上预冷的PBS。</li>
	<li>使用P1000移液器吸头刮下基底膜基质小滴，将PBS/培养基混合物转移至15 mL离心管中。</li>
	<li>用相同体积的PBS冲洗每个孔，以收集残留的基底膜基质碎片，并将其加入15 mL离心管中。</li>
	<li>在冰上孵育5分钟。此步骤有助于溶解基底膜基质。</li>
	<li>在4 °C条件下，以400 × g离心5分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，注意不要扰动沉淀的基质和细胞。</li>
	<li>向沉淀中加入5 mL步骤2.2中预热的细胞解离溶液，轻轻吹打重悬沉淀10次，然后转移回含有新鲜预热细胞解离溶液的50 mL离心管中。</li>
	<li>将离心管置于37 °C水浴中，孵育5分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下，以400 × g离心3分钟。</li>
	<li>重复步骤2.9-2.11。 
	注：重复酶解有助于高效地将类器官解离为单细胞。</li>
	<li>取100 µL细胞悬液加入96孔板中，显微镜下观察，判断类器官是否已解离为单细胞。若多数类器官仍存在由四个以上细胞组成的细胞团，则需延长细胞解离溶液孵育时间，并使用10 mL移液器反复吹打以实现物理性解离。</li>
	<li>当大部分细胞呈单细胞状态时，向40 mL细胞悬液中加入4 mL胎牛血清（FBS）以终止消化反应。用5 mL PBS冲洗40 µm细胞筛网。</li>
	<li>将细胞悬液通过细胞筛网过滤至50 mL收集管中，以去除所有细胞团块。</li>
	<li>在4 °C条件下，以400 × g离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，向细胞沉淀中加入10 mL冷PBS，并转移至15 mL离心管中。</li>
	<li>在4 °C条件下，以400 × g离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，用含10 µM Y-27632的500 µL冷PBS重悬细胞沉淀，进行细胞计数。</li>
	<li>使用含10 µM Y-27632的PBS将细胞浓度调整为5.0 × 105 个单细胞/100 µL。将离心管置于冰上，直至进行门静脉注射。 
	&#8203;注：建议在细胞解离后4小时内完成注射。</li>
</ol>
3. 结直肠癌类器官的门静脉注射
注意：所有外科手术器械和外科纱布在手术前必须经过高压灭菌或灭菌处理。本方案改编自先前的方案17。在本实验25中，步骤1使用经AAV-mRuby2或AAV-Islr处理的Rosa26-Cas9小鼠进行门静脉注射。
<ol>
	<li>在加热垫上使用无菌铺巾准备无菌手术区域。</li>
	<li>准备手术器械（剪刀和镊子）、手术纱布和止血海绵、4-0 聚乳酸羟基乙酸共聚物缝线、棉签、皮肤缝合钉、缝合钉施用器、生理盐水、布托啡诺以及连接至 Hamilton 注射器的 33 G 针头。将止血海绵切成 1.0 cm × 1.0 cm 的小块。</li>
	<li>调整光源位置，以照亮手术区域。</li>
	<li>为小鼠皮下注射布托啡诺，剂量为 0.1 mg/kg 体重，用于术中镇痛。</li>
	<li>在麻醉诱导舱中使用异氟烷对小鼠进行麻醉。诱导和维持阶段的异氟烷浓度通常分别为 5% 和 2.5%。在开始下一步操作前，需通过脚趾夹捏测试确认小鼠无反应。</li>
	<li>使用电动剃须刀剃除小鼠中腹部至上腹部的毛发。剃毛操作应在远离无菌手术区域的位置进行，以避免毛发污染手术部位。</li>
	<li>交替使用聚维酮碘和 80% 乙醇清洁切口部位，以对手术区域进行消毒。重复三次。</li>
	<li>将小鼠仰卧置于加热垫上，并通过面罩维持异氟烷麻醉。在小鼠腹部覆盖带有开口的手术铺巾。</li>
	<li>用镊子提起腹壁皮肤，沿中线用剪刀做 2–3 cm 的皮肤切口，仅切开皮肤（不切开下方腹膜）。切口范围应从腹部中段延伸至胸骨剑突，但不应超过剑突下端。</li>
	<li>用镊子完全提起腹膜壁，并用剪刀对腹膜做相似长度（2–3 cm）的切口。注意避免损伤肠管和膈肌。</li>
	<li>用温热的生理盐水浸湿手术纱布，将其放置于切口左侧（即小鼠身体左侧，术者右侧）。</li>
	<li>用生理盐水浸湿的棉签轻轻将内脏器官（小肠和大肠）拉出，放置于浸有生理盐水的纱布上。 
	注：应先拉出小鼠左侧的肠道（即术者右侧），再拉出小鼠右侧的肠道（即术者左侧）。</li>
	<li>调整肠道位置以暴露门静脉。用额外湿润的纱布覆盖肠道，保持其湿润。</li>
	<li>用湿纱布将肠道轻柔地向左侧牵拉，并施加轻微张力向左牵拉，以利于门静脉的观察（图 2A）。 
	注：若门静脉显示不清，可用湿棉签轻柔调整胃部位置以辅助观察。</li>
	<li>轻柔吹打肿瘤类器官悬液数次，以获得均一的细胞悬液。将 100 µL 细胞悬液缓慢吸入连接 33 G 针头的 Hamilton 注射器中，避免产生气泡。</li>
	<li>将针头斜面向上，缓慢插入门静脉。沿针头方向的插入深度应为 3–4 mm，针头角度应几乎与门静脉平行。 
	注：注射应选择在门静脉清晰可见的部位进行（通常距离肝门约 2 cm 内）。针头完全插入门静脉后应避免移动。</li>
	<li>持续 30 秒缓慢注射肿瘤细胞。注射过程应缓慢进行，以防门静脉阻塞。若注射成功，肝脏颜色会暂时由红色变为白色。</li>
	<li>缓慢拔出针头。立即用干燥棉签对注射部位施加轻柔压力，持续 5 分钟。</li>
	<li>移除棉签，同时将止血海绵覆盖于注射部位。用棉签或镊子固定止血海绵，并继续施加轻柔压力 5 分钟。</li>
	<li>解除对止血海绵的压力，确认注射部位无出血。 
	注：该生物可吸收止血海绵无需取出。尝试移除海绵可能导致注射部位再次出血。</li>
	<li>若发生出血，应立即用棉签加压止血约 10 分钟，随后再加用一块止血海绵继续压迫 5 分钟。 
	注：若出现无法控制的失血，应根据机构动物伦理委员会批准的方案对小鼠实施安乐死。</li>
	<li>移除覆盖在肠道上的手术纱布。使用装有 5 mL 生理盐水的注射器向肠道喷洒生理盐水，以防止器官粘连。 
	注：切勿将生理盐水喷洒至门静脉注射部位，以免引起再出血。</li>
	<li>轻柔地将肠道复位至腹腔内。</li>
	<li>使用 4-0 聚乳酸羟基乙酸共聚物缝线缝合腹膜。</li>
	<li>用镊子提起切口两侧皮肤，使用皮肤缝合钉闭合皮肤切口。注意避免将肠道钉住。</li>
	<li>关闭异氟烷，但保持氧气持续通气。密切观察小鼠状态。当小鼠苏醒后，将其放入预热的空笼中，置于加热垫上。小鼠通常在 5 分钟内苏醒。</li>
	<li>持续密切观察小鼠，直至其意识清醒并能正常活动。</li>
	<li>术后 4 小时，为小鼠皮下注射 0.1 mg/kg 布托啡诺。</li>
	<li>在术后连续 2 天内，每天为小鼠注射 0.1 mg/kg 布托啡诺一次。</li>
	<li>术后一周内每日密切观察小鼠状况，检查缝线及伤口愈合情况。</li>
	<li>术后若干天，使用缝合钉拆除器移除皮肤缝合钉。</li>
</ol>
4. 通过肿瘤生长动力学评估 体内 生物发光成像
注意：如果使用表达萤光素酶的肿瘤类器官进行注射，可通过每周成像监测转移性肿瘤的进展 在体 成像，如所述38,39癌细胞表达的荧光素酶可能引发针对癌细胞的免疫反应，从而限制肿瘤生长40因此，在使用表达荧光素酶的肿瘤细胞建立的小鼠模型中分析免疫表型和肿瘤进展时需谨慎。
<ol>
	<li>使用无菌 PBS 配制 30 mg/mL 的 D-荧光素溶液，避光保存。D-荧光素应分装后于 -20 °C 保存，直至使用。</li>
	<li>用电动剃须刀剃除腹部和胸部的毛发。此操作可在实验前最多1天进行 体内 成像</li>
	<li>按每公斤体重150 mg的剂量将D-荧光素通过腹腔注射注入小鼠体内（例如，若小鼠体重为30 g，则注射150 µL的D-荧光素溶液）。</li>
	<li>将小鼠放入麻醉舱中进行麻醉。使用5%异氟烷进行诱导麻醉，2%-3%异氟烷维持麻醉。</li>
	<li>分钟后，将小鼠置于侧卧位（右侧朝上）。使用成像系统获取生物发光图像 体内 成像系统（IVIS），如先前所述38,39. 
	注意：与仰卧位相比，小鼠在侧卧位时更为稳定。因此，为获得一致焦平面的生物发光图像，优选采用侧卧位。</li>
	<li>将小鼠放入空笼中，观察其恢复情况。</li>
	<li>使用 Living Image 软件按照所述方法在上腹部定义感兴趣区域38将总通量作为肿瘤细胞数量的替代指标进行定量。</li>
</ol>
5. 生存分析与组织采集
<ol>
	<li>密切监测小鼠是否出现转移的临床症状，例如腹部膨隆。</li>
	<li>当小鼠达到人道终点时，通过吸入 CO2 实施安乐死。 
	注意：使用经机构动物伦理委员会批准的研究终点。为确定人道终点，采用临床记录表；每出现以下观察项目中的一项，记一分：体重减轻 &#62; 15%、弓背姿势、毛发竖立、脱水、活动减少、腹部膨隆或面部痛苦表情。当评分达到 3 分时，对小鼠实施人道安乐死。</li>
	<li>安乐死后立即在通风橱中进行经心脏灌注固定，使用 30–50 mL 10% 甲醛溶液，操作如文献41所述。在灌注前，用剪刀在肝脏正常组织区域做数个微小切口（每个不超过 1 cm），以形成血液和甲醛的流出通道。灌注过程中，肝脏颜色将由红色变为棕色。 
	注意：若研究目标为肉眼正常肝组织中的微小转移灶，建议研究人员不要切开肝脏，而应剪开上腔静脉作为替代。然而，我们使用该方法时发现，与切开肝脏相比，肝脏固定效果较差。特别是若计划对肝组织切片进行 RNA in situ 杂交（ISH），我们建议在心内注射甲醛前，按上述方法预先在肝脏上做切口。此操作可实现肝脏组织的充分固定，从而保持 RNA 完整性，以满足 ISH 要求。</li>
	<li>将肝脏和肺组织置于 10% 甲醛溶液中，固定过夜。随后将甲醛替换为 70% 乙醇，再进行石蜡包埋。</li>
	<li>进行苏木精-伊红染色以组织学评估肿瘤区域。对感兴趣的基质标志物进行免疫组织化学染色。进行天狼星红（Picro-Sirius Red）染色以评估胶原阳性区域。 
	注意：可使用 ImageJ 软件42对免疫组织化学和天狼星红染色结果进行定量分析。可分别使用颜色解卷积功能和 MRI 纤维化分析工具，评估 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）阳性区域和天狼星红阳性区域。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究显示，将小鼠结直肠癌类器官注射至门静脉可稳定地诱导出富含成纤维细胞的肝转移灶，其组织学特征与人类结直肠癌肝转移相似。此外，当该模型与靶向间质的治疗手段（如AAV8介导的基因治疗）联合使用时，可作为评估治疗对小鼠生存率和肿瘤生长影响的有效临床前工具。
该方案中至少有两个关键步骤。首先，必须通过充分的胰蛋白酶消化类器官并使用滤网去除细胞团块，以制备肿瘤类器官的单细胞悬液。若肿瘤类器官解离不完全，会形成较大的细胞聚集体，注射后可能导致门静脉阻塞，进而引起肝脏梗死及动物死亡22。其次，在门静脉注射过程中，必须尽量减少门静脉出血。应将针头正确插入门静脉内，为避免穿透门静脉对侧壁，针头进入时的角度应几乎与门静脉平行。为防止注射过程中撕裂门静脉，针头完全插入后不得移动。在将针头从门静脉拔出后，必须立即用棉签对注射部位施加压力，持续至少5分钟。
注射的细胞数量需根据受体小鼠（例如，免疫健全小鼠与免疫缺陷小鼠）以及类器官细胞系的成瘤性进行调整。在我们的实验中，将5.0 × 105<...

结直肠癌（CRC）是全球癌症死亡的主要原因之一1。超过一半的结直肠癌患者会通过门静脉播散发生肝转移1。目前尚无有效疗法能够治愈晚期肝转移，大多数患者死于转移性疾病。
转移性微环境或肿瘤微环境在播散性结直肠癌（CRC）细胞的定植和生长过程中起着关键作用2。癌症相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境中的重要组分，可通过分泌生长因子、重塑细胞外基质（ECM）、调节免疫微环境及血管生成来促进或抑制肿瘤进展3,4,5。CAFs还可导致对化疗和免疫治疗的耐药性3。此外，CAFs调控结直肠癌肝转移的起始与进展，并可预测结直肠癌患者的预后3,6,7,8。因此，与CAFs相关的因子可被用于开发抑制结直肠癌肝转移的治疗策略。然而，目前缺乏理想的用于研究转移性肿瘤间质的小鼠模型，这已成为开发靶向间质治疗手段的主要障碍。
目前，用于研究结直肠癌肝转移的动物模型包括可自发产生肝转移的原位结直肠癌模型以及将癌细胞移植至肝脏的模型。原位结直肠癌小鼠模型，例如基因工程小鼠模型或结肠内注射癌细胞模型，极少出现肝转移9,10,11,12。此外，即使观察到肝转移，这些模型从原发肿瘤诱导到发生转移的潜伏期较长，且小鼠可能因原发肿瘤负荷过重而死亡12。为了高效建立结直肠癌肝转移模型，可将培养的结直肠癌细胞通过三种注射方式移植至肝脏&#160;：脾内注射、直接肝实质内注射以及门静脉注射。经脾内注射的癌细胞会进入脾静脉、门静脉，最终到达肝脏13,14。然而，与其他移植模型相比，脾内注射的成瘤率较低15,16。在脾内注射后，通常需手术切除脾脏以防止癌细胞在脾脏内生长，但此举可能影响免疫细胞的成熟过程17。此外，脾内注射还可能导致脾脏及腹腔内出现非预期的肿瘤生长18，从而干扰对肝转移的分析。直接肝实质内注射可高效诱导肝转移16,19,20。然而，该方法未能完全模拟癌细胞经门静脉播散这一自然发生的肝转移生物学过程。通过直接肝内注射，癌细胞可能进入非门静脉系统的体循环，从而导致多发性肺转移灶的形成16。尽管大多数结直肠癌肝转移患者在肝脏中表现为多个肿瘤结节21，但直接注射至特定肝叶通常仅形成单一肿瘤团块19,20。门静脉注射或肠系膜静脉注射虽然技术难度较高，但能以更接近患者体内肿瘤生长模式的方式将肿瘤细胞高效输送至肝脏17。该策略可最大限度减少继发部位转移的可能性，并促进癌细胞在肝脏内的快速增殖，从而简化小鼠生存分析。
传统上，研究人员使用结直肠癌细胞系（如小鼠MC-38、人源HT-29和SW-620）建立肝转移的小鼠模型22,23。然而，这些结直肠癌细胞系无法诱导产生促结缔组织增生的间质反应。肿瘤间质含量较低，使得癌相关成纤维细胞的生物学功能难以被深入研究。近年来，结直肠癌类器官（CRC organoids）及其移植技术的发展为评估间质在肿瘤进展中的关键作用提供了有力的研究平台24。将结直肠癌类器官移植至肝脏可形成富含成纤维细胞的肿瘤微环境，为间质研究提供了新的视角6,25。目前，通过门静脉或肠系膜静脉注射类器官已成为建立结直肠癌肝转移模型的金标准方法6,25,26,27,28。然而，据我们所知，尚无先前文献详细描述结直肠肿瘤类器官门静脉注射的具体操作方法。本文中，我们介绍一种通过门静脉注射结直肠癌类器官以开发新型腺相关病毒（AAV）介导的靶向间质治疗策略的方法。
肝细胞是肝脏转移性肿瘤微环境的重要组成部分，在转移性癌症进展中发挥关键作用29。受腺相关病毒（AAV）基因治疗在非肿瘤患者中成功诱导肝细胞蛋白表达的启发30,31，我们探索了类似策略，旨在调控结直肠癌（CRC）中的肝脏肿瘤微环境25。因此，本文还描述了通过尾静脉注射AAV8以诱导抗肿瘤蛋白表达，从而修饰肝脏肿瘤微环境的方法。AAV8血清型由病毒生产过程中所选用的病毒衣壳蛋白决定，可特异性高效转导肝细胞（即在肝脏肿瘤微环境中实现靶向基因表达）32。我们先前研究表明，Islr（含亮氨酸富集重复序列的免疫球蛋白超家族）是一种癌症相关成纤维细胞（CAF）特异性基因，能够激活骨形态发生蛋白（BMP）信号通路，抑制结直肠癌类肿瘤体的生长，并促进Lgr5+肠道干细胞的分化25。我们通过在经AAV8-Islr处理的小鼠中进行结直肠癌类肿瘤体的门静脉注射，检测了在肝细胞中通过AAV8介导的癌症抑制性基质基因Islr过表达是否能够减缓肝转移的进展。
本文首先描述了嗜肝性腺相关病毒（AAV）的尾静脉注射方法。随后，介绍了肿瘤类器官细胞的制备方法以及对AAV处理小鼠进行门静脉注射的技术。最后，我们提出了监测转移性肿瘤进展的策略，以评估靶向肿瘤微环境治疗药物的疗效。

<table><tbody><tr><td>10% 甲醛</td><td>Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>33 号针头</td><td>TSK</td><td>LDS-33013</td><td>用于门静脉注射</td></tr><tr><td>4-0 缝合线（Vicryl）</td><td>ETHICON</td><td>J494G</td><td></td></tr><tr><td>40-&amp;micro;m 细胞筛</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>BD</td><td>302130</td><td>门静脉注射后用于向肠道施加生理盐水</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 注射器</td><td>TERUMO</td><td>SS*50LE</td><td>鲁尔锁式注射器，用于灌注固定</td></tr><tr><td>70% 异丙醇擦拭巾</td><td>Briemar</td><td>5730</td><td></td></tr><tr><td>麻醉机</td><td>Darvall</td><td>9356</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;SMA 抗体</td><td>DAKO</td><td>M0851</td><td>克隆号 1A4，免疫组化使用 1/500 稀释度</td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>TROY</td><td>N/A</td><td>ilium Temvet 注射液，300 &amp;micro;g/mL 布托啡诺</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>N/A</td><td>Johnson's 纯棉棉签涂抹器，使用前需高压灭菌</td></tr><tr><td>D-荧光素</td><td>Biosynth</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>电动剃须刀</td><td></td><td></td><td>由多家供应商提供</td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td>由多家供应商提供</td></tr><tr><td>哈密尔顿注射器</td><td>HAMILTON</td><td>81020</td><td>用于门静脉注射</td></tr><tr><td>加热箱（动物保温舱）</td><td>Datesand</td><td>MK3</td><td></td></tr><tr><td>加热灯</td><td></td><td></td><td>由多家供应商提供</td></tr><tr><td>止血海绵</td><td>Pfizer</td><td>09-0891-04-015</td><td>Gelfoam 可吸收明胶海绵，USP，12-7 mm</td></tr><tr><td>印度墨水</td><td>Talens</td><td>44727000</td><td></td></tr><tr><td>注射器和针头</td><td>BD</td><td>326769</td><td>用于尾静脉注射</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Islr&lt;/em&gt; 探针（RNAscope）</td><td>ACD</td><td>450041</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein</td><td>988-3244</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum 活体成像系统</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Living Image 软件</td><td>Perkin Elmer</td><td>128113</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>MRI 纤维化分析工具</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 试剂盒</td><td>ACD</td><td>322300</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物固定器</td><td></td><td></td><td>由多家供应商提供</td></tr><tr><td>Rosa26-Cas9 小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>024858</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Pfizer</td><td>PHA19042010</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td></td><td></td><td>由多家供应商提供</td></tr><tr><td>皮肤缝合钉</td><td>Able Scientific</td><td>AS59028</td><td>9 mm 伤口夹</td></tr><tr><td>缝合钉施加器</td><td>Able Scientific</td><td>AS59026</td><td>9 mm 伤口夹施加器</td></tr><tr><td>缝合钉拆除器</td><td>Able Scientific</td><td>AS59037</td><td>伤口夹拆除器</td></tr><tr><td>手术单</td><td>Multigate</td><td>29-220</td><td></td></tr><tr><td>外科纱布</td><td>Sentry Medical</td><td>GS001</td><td></td></tr><tr><td>局部麻醉乳膏</td><td>EMLA</td><td>N/A</td><td>EMLA 5% 乳膏，含利多卡因 25 mg/g 和丙胺卡因 25 mg/g</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td>重组细胞解离酶混合物</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

通过门静脉注射结直肠癌类器官研究肝转移微环境

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

结直肠癌肝转移是癌症相关死亡的主要原因。癌相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境的重要组成部分，在转移性结直肠癌的进展中发挥关键作用，并可预测患者预后不良。然而，目前尚缺乏理想的鼠模型用于研究转移性癌细胞与CAFs之间的相互作用。本文介绍了一种研究肝转移进展如何受转移微环境调控，并可能通过靶向间质治疗加以抑制的方法。通过门静脉注射结直肠癌类器官，可诱导产生纤维化反应，真实再现了人类结直肠癌肝转移中富含成纤维细胞的组织学特征。该模型具有组织特异性，与脾内注射模型相比，肝脏肿瘤负荷更高，便于简化小鼠生存分析。通过注射表达荧光素酶的肿瘤类器官，可利用生物发光成像动态监测肿瘤生长动力学 体内 成像。此外，该临床前模型为评估靶向肿瘤间质的治疗手段的有效性提供了一个有用的平台。我们描述了研究腺相关病毒介导的肿瘤抑制性间质基因向肝细胞递送是否能够重塑肿瘤微环境并提高小鼠生存率的方法。该方法有助于开发和评估抑制结直肠癌肝转移的新型治疗策略。

为诱导腺相关病毒介导的肿瘤抑制性基质基因过表达， Islr4,25,43,44，在肝细胞中，我们通过静脉注射 Islr-编码 AAV8。1.0 x 1011 AAV8 的病毒基因组（vg）Islr，或作为对照，AAV8-mRuby2，通过成年小鼠尾静脉注射（图1A）。尾静脉注射两周后，采集肝脏以验证过表达情况 Islr 在肝细胞中。我们进行了RNAscope 原位 杂交45 并证实了3,3'-二氨基联苯胺（DAB）+ 在整个肝脏中均观察到了信号（图1B）。无DAB<su...

结直肠癌（CRC）类器官的门静脉注射可产生富含间质的肝转移灶。该结直肠癌肝转移小鼠模型是研究肿瘤与间质相互作用的有力工具，也可用于开发新型靶向间质的治疗策略，例如腺相关病毒介导的基因治疗。

结直肠癌（CRC）的肝转移是癌症相关死亡的主要原因。癌症相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境中的主要组成部分，...

超过50%的结直肠癌患者通过门静脉播散发展为肝转移。目前用于研究结直肠癌肝转移的动物模型仍不足以充分模拟该生物学过程。通过门静脉注射结直肠癌类肿瘤体可构建富含成纤维细胞的肿瘤微环境，从而有助于研究转移性癌细胞与结直肠癌肝转移中CAS之间的相互作用。该技术为评估靶向结直肠癌肝转移肿瘤微环境的治疗策略的有效性提供了平台。该方法特别适用于研究癌相关成纤维细胞（CAS）、肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的相互作用。如果棉签未正确放置在注射部位，拔针后可能会发生大量出血。一旦确定注射部位，棉签浸润即停止。若无此操作的直观演示，识别门静脉并观察注射部位可能会有困难。开始时，使用无菌布巾在加热垫上准备一个无菌手术区域。此外，按照文本稿件中的描述，准备手术所需的所有器械。然后，通过调整光源的位置照亮手术区域。接着，为小鼠皮下注射每公斤体重0.1毫克的丁丙诺啡，以进行术中镇痛管理。然后麻醉小鼠，使用电动剃毛器剃除中上腹部的毛发，剃毛区域应远离无菌手术区域，以避免毛发污染手术部位。用聚维酮碘和80%乙醇交替清洁切口部位，以消毒手术区域，重复三次。将小鼠置于手术区域的加热垫上，保持仰卧位，并通过异氟烷维持麻醉。随后在腹部覆盖带有开口的手术巾。用镊子提起腹部皮肤，使用剪刀沿中线做2至3厘米的皮肤切口，仅切开皮肤，确保切口范围从腹部中段至胸骨剑突，但不超过剑突下端。然后用镊子完全提起腹壁，并用剪刀在腹膜上做一个类似的2至3厘米的切口。注意避免损伤肠管和膈肌。接下来，将一块手术纱布用温盐水浸湿，放置于术者右侧的切口旁。用浸有生理盐水的棉签轻轻将小肠和大肠拉出，并放置在浸有生理盐水的纱布上。用额外的湿纱布覆盖肠道，以保持其湿润。接着，用湿纱布将肠管轻柔地向术者右侧牵拉。然后施加轻柔的张力以显露门静脉。若门静脉显示困难，可用湿润的棉签轻轻调整胃的位置。将类肿瘤体悬液轻轻吹打数次，以获得均匀的细胞悬液后，用连接33号针头的Hamilton注射器或1毫升注射器吸取100微升细胞悬液，注意避免产生气泡。将针头斜面向上缓慢插入门静脉，进针深度为三到四毫米，针头角度几乎与门静脉平行。缓慢注入肿瘤细胞，持续约30秒，以防止门静脉阻塞。肝脏的颜色会暂时由红色变为白色。注射后，缓慢拔出针头，并立即用干燥的棉签在注射部位轻压五分钟。移除棉签后，立即在注射部位放置止血海绵。用棉签或镊子夹住海绵，继续轻压五分钟。五分钟后，解除对止血海绵的压力，确认注射部位无出血。若发生出血，立即用棉签进行约10分钟的压迫止血。然后再次使用一块止血海绵继续压迫5分钟。确认无出血后，移除肠道上的手术纱布。然后使用装有5 mL生理盐水的注射器，将生理盐水喷洒至肠道表面，以防止器官粘连。轻柔地将肠道复位至腹腔内，并使用4-0聚乙醇酸缝线缝合腹膜。然后用镊子提起皮肤两侧，使用皮肤缝合器闭合皮肤切口，注意避免将肠管一并缝合。关闭异氟烷气体，但保持氧气持续流通。密切观察小鼠状态。当小鼠苏醒后，将其放入垫有加热垫的空笼中。持续监测小鼠，直至其意识清醒且能够正常行走。术后4小时，皮下注射0.1毫克/千克的丁丙诺啡。术后每天仔细观察小鼠一周，检查缝线及伤口愈合情况。术后7至10天，使用缝合器拆除器移除皮肤缝合钉。尾静脉注射AAV-8 Islr两周后，肝脏组织RNA原位杂交显示Islr在肝脏中过表达。在 AAV mRuby2 注射两周后，将结肠癌类器官的单细胞悬液注射到小鼠门静脉。宏观上，门静脉注射导致肝脏出现多个白色肿瘤结节。对门静脉注射诱导的结直肠癌肝转移灶进行苏木精和伊红染色，显示中等分化管状腺癌的组织病理学特征，伴有促纤维增生性间质反应和坏死。这种富含间质的组织学特征真实再现了人类结直肠癌肝转移的病理特征，使该模型适用于研究转移性肿瘤间质的转化医学研究。α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin）的免疫组织化学染色证实了癌相关成纤维细胞的存在，而天狼星红（Picro-Sirius red）染色显示肿瘤间质中含有丰富的细胞外基质。EPCAM 的免疫组织化学染色表明，转移性结直肠癌存在肿瘤出芽现象，这是预后不良型结直肠癌的特征之一。且Ki67标记指数约为80%，表明大多数肿瘤细胞处于有丝分裂活跃状态。小鼠在门静脉注射肿瘤类器官后中位生存期为57天。经AAV-8 Islr治疗的小鼠生存期延长，肿瘤的活体成像信号减弱，骨形态发生蛋白信号通路活性增强，Ki67阳性增殖细胞减少。确保将棉签尖端置于正确的注射部位，且仅在出血停止后使用止血海绵。可利用IVIS成像监测肿瘤建立情况，以确认肿瘤细胞在肝脏内生长。

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