Name: 利格宁和单宁的定量 31P NMR 分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-02T13:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: 了解定量³¹P核磁共振技术用于分析木质素和单宁中的羟基结构。该方法通过TMDP衍生化和NMR波谱提供快速可靠的定量信息，助力多酚化合物研究。

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多年来，本工作得到了多个资助机构的财政支持，包括加拿大造纸研究所、加拿大蒙特利尔麦吉尔大学、加拿大自然科学与工程研究委员会、美国国家科学基金会、美国农业部以及索尔维公司。

以下流程图（图6）概述了进行木质素和单宁31P NMR分析的完整实验方案。
<img alt="31P NMR分析示意图；样品制备、谱图处理、-OH基团表征。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 6"> 
图6：木质素和单宁的31P NMR分析流程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
1. 样品预处理
<ol>
	<li>将待测物（木质素或单宁样品）的等分试样（约 100 mg）置于 40 °C 的真空烘箱中过夜干燥。 
	注意：选择温度时需特别谨慎，因为高于 40 °C 的温度可能会化学改变所研究多酚的敏感结构。</li>
	<li>干燥后，迅速将样品转移至无水硫酸钙干燥器中，直至其达到室温。此步骤必不可少，以避免样品从环境中吸收湿气。</li>
</ol>
2. 溶剂溶液的配制
<ol>
	<li>在20 mL样品瓶中，通过将无水吡啶与氘代氯仿按1.6/1 (v/v) 的体积比混合，制备吡啶/氘代氯仿溶剂混合液。 
	注意：操作吡啶和氘代氯仿时需格外小心。这些化合物易燃、有害且有毒。应在通风良好的通风橱中，佩戴合适的防护手套进行溶液的配制和使用。</li>
	<li>加入5–8 g充分洗涤并干燥的5A分子筛（3.2 mm颗粒），以去除微量水分。此外，强烈建议使用隔垫盖密封容器，以防止空气接触和溶剂体系受潮。将配制好的溶液避光保存。</li>
</ol>
3. 内标溶液（IS）的配制
<ol>
	<li>在2 mL锥形瓶中，将乙酰丙酮铬(III)（约10 mg）和内标物（约35.8 mg的NHND或77.3 mg的胆固醇）溶于先前配制的溶剂溶液中，配制成0.1 M的溶液。 
	注意：乙酰丙酮铬(III)有害；操作时应佩戴适当的手套。</li>
	<li>准确记录加入内标溶液中的内标物质量。</li>
	<li>将内标溶液转移至配有密封盖且含有活化分子筛（见步骤2.2）的小瓶中，避光保存于40 °C条件下。</li>
</ol>
4. 核磁共振样品溶液的制备
<ol>
	<li>在配有搅拌子的 2 mL 小瓶中，精确称取约 30 mg 样品。用隔垫盖密封小瓶。</li>
	<li>向样品小瓶中加入 0.5 mL 溶剂体系溶液。</li>
	<li>通过微量移液器向样品小瓶中加入 100 µL 内标（IS）溶液。磁力搅拌所得分散液（500 rpm），直至所有木质素或单宁完全溶解，得到澄清溶液。 
	注意：由于样品必须完全溶解，此步骤可能需要长达 12 小时。</li>
	<li>向样品溶液中加入 0.1 mL TMDP。将样品置于强烈磁力搅拌条件下。保持样品溶液密封。在通风良好的通风橱中操作，并佩戴合适的手套使用 TMDP。 
	警告：TMDP 及其蒸气具有腐蚀性，有害，且会迅速与水发生反应。 
	注意：若出现黄色沉淀，是由于样品或吡啶/氯仿溶液中存在微量水分。此时必须重复该步骤，并确保避免所有可能的湿气污染。</li>
	<li>使用巴氏吸管将样品溶液转移至核磁管中。</li>
</ol>
5. 核磁共振分析
<ol>
	<li>将样品管装入核磁共振仪中。用于执行此分析的波谱仪需要配备宽带探头。</li>
	<li>根据表11所示设置固定实验参数。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>脉冲程序</td>
			<td>反门控去耦脉冲 (zgig)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>核素</td>
			<td>31P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>谱宽</td>
			<td>100 p.p.m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>采集时间</td>
			<td> - 0.8 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>弛豫延迟</td>
			<td> ≥ 10 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>扫描次数</td>
			<td> 64 或更多</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>谱图中心</td>
			<td> 140 p.p.m.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：记录衍生化木质素或单宁的31P NMR 谱图的实验参数。
<ol start="3">
	<li>使用氘代氯仿的共振频率设置波谱仪频率，对样品进行匀场并调节波谱仪。然后开始采集数据。</li>
</ol>
6. 光谱处理与分析
<ol>
	<li>按照以下步骤，使用适当的标准化软件处理31P NMR原始数据。
	<ol>
		<li>进行傅里叶变换。</li>
		<li>通过手动相位校正调整相位（处理 | 相位校正 | 手动校正）。</li>
		<li>手动校正基线，仔细设置零点（处理 | 基线 | 多点基线校正）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>信号校准。
	<ol>
		<li>将磷酰化水的信号设定在化学位移值132.2 ppm处（分析 | 参考 | 参考）。 
		注意：在175 ppm处出现一个尖锐的31P信号是由于TMDP过量所致。该信号的存在表明样品已完全衍生化。如果此峰缺失，则需要重新检查整个操作流程，确保样品和溶剂充分干燥，并添加更多的TMDP。确认此条件满足后，将谱图放大至132至约150 ppm的谱图范围（图7）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="光谱分析图，TMDP衍生化，突出显示化学衍生化的关注区域。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 7"> 
图7：检查是否存在过量TMDP：若可观察到，则表明样品的衍生化反应已完成。 随后可对光谱进行分析。为此，请放大155至132 ppm之间的谱图范围。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>积分
	<ol>
		<li>通过将内标设为1.0来进行归一化积分（点击 Peak | Edit Integral | Normalized: 1.00）。根据下表中列出的化学位移进行谱图积分。木质素使用表2，单宁使用表3。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>官能团</td>
			<td> 化学位移 (ppm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脂肪族 OH</td>
			<td> 149.0-146.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酚羟基 OH</td>
			<td> 144.0-137.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C5 取代酚羟基 OH</td>
			<td> 143.0-140.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-5’ 酚羟基 OH</td>
			<td> 141.7-140.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>丁香基 OH</td>
			<td> 143.2-142.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-O-5’ OH</td>
			<td> 142.8-141.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>愈创木基 OH</td>
			<td> 140.2-138.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对羟基苯基 OH</td>
			<td> 138.8-137.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COOH</td>
			<td> 136.0-133.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>木犀草素 (Tricin)</td>
			<td> 137.0-136.0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：31P NMR中木质素磷酰化羟基的化学位移。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>官能团</td>
			<td> 化学位移 (ppm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">A环</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>邻位未取代酚羟基</td>
			<td> 137.9–137.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>邻位取代酚羟基</td>
			<td> 138.8–137.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">B环</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>邻苯二酚羟基</td>
			<td> 140.2–138.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>连苯三酚羟基</td>
			<td> 144.0–140.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">C环</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脂肪族羟基</td>
			<td> 146.0–145.0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：31P NMR中单宁磷酰化羟基的化学位移。
注意：使用标准的光谱处理软件，可以设置化学位移的预定义区域进行积分。当需要处理多个谱图时，此功能具有优势。
7. 官能团定量分析
<ol>
	<li>计算内标（IS）溶液的浓度。 
	<img alt="内标浓度公式；用于计算溶液中内标（IS）浓度的方程。" src="/files/ftp_upload/62696/62696eq1v2.png" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1"></li>
	<li>计算特定信号的等效量： 
	<img alt="官能团定量公式，功能分析，化学浓度，方程。" src="/files/ftp_upload/62696/62696eq2v2.png" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 2"> 
	<img alt="使用光谱中归一化峰面积进行木质素分析的官能团计算方程。" src="/files/ftp_upload/62696/62696eq3v2.png" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 3"></li>
</ol>

Claudia Crestini 和 Dimitris S Argyropoulos 确保所有作者（C.C.、N.P. 和 D.S.A.）均无利益冲突。

所述方法代表了由 Argyropoulos37,38,39,40,41,42 开发的用于木质素定性与定量表征的分析方案的实施与优化。相较于其他可用于木质素结构解析的技术，该方法被广泛认为是最简便、快速且可重复性最高的方法之一。湿化学方法（如硝基苯氧化、高锰酸盐氧化等）的有效性依赖于操作者良好的实验技能，因而实际上限制了该方法仅能由少数操作者使用。此外，文献中常需引入校正因子以弥补湿化学方法的多种缺陷。而所描述的31P NMR方案无需高超的实验技巧，因而易于应用、操作友好且普及度高。与其他仪器分析方法相比，31P NMR是唯一能够精确定性和定量检测木质素中不同类型羟基官能团的技术。例如，傅里叶变换红外光谱（FTIR）可用于识别多种羟基，1H NMR亦然。然而，这两种技术均因信号严重重叠而难以提供可靠的定量数据。另一种广泛应用的技术是紫外-可见光谱法（UV-Vis），最早由 Goldschmid 报道。但该方法仅能对羟基进行总体的粗略测定，因其无法有效区分脂肪族、芳香族和羧基羟基47。
从经济角度来看，31P NMR 技术的唯一限制是 TMDP 的价格，这是一种相对昂贵的试剂。其价格约为每克 190 美元；因此，如果仅将分析成本近似为 TMDP 的成本，而不包括吡啶/氯仿混合溶剂以及操作人员时间所产生的费用，则每次分析的成本约为 24 美元。为解决这一问题，许多实验室选择自行合成 TMDP，从而降低试剂成本。合成方法是使频哪醇与三氯化磷在三乙胺存在下反应44。从技术上讲，该反应相对简单；然而，在使用三氯化磷及其后处理过程中需格外小心，包括进行严格控制的真空蒸馏。有关 TMDP 合成的更多细节可根据要求提供。
尽管本实验方案在操作简便性、可重复性和精确性方面均属最佳之列，但仍需强调几个关键要点。首先，样品必须完全溶解于所确定的吡啶/氯仿混合溶剂中。这一要求至关重要，因为羟基的定量磷酰化反应必须在完全均一的条件下进行。如果仅有部分样品溶解，则最终分析结果将不准确。其次，待测样品必须无水分且无溶剂残留，因为这些因素会严重影响分析的精确性和整体成功率。微量水分会与TMDP发生反应，生成2-羟基-4,4'-5,5'-四甲基-1,3,2-二氧磷杂环戊烷。该化合物为淡黄色絮状盐，不溶于吡啶/氯仿溶剂体系，会导致核磁共振信号采集不充分。由于所需样品量极少（约30 mg），在分析前必须确保样品不含挥发性成分，以便准确称量其质量。
有时，加入少量共溶剂（例如二甲基甲酰胺）有助于促进样品溶解（特别是对于高度氧化的样品）。原则上，任何不与TMDP发生相互作用的溶剂均可用于辅助样品溶解。所选共溶剂不得含有活泼的羟基或氨基，因为这些基团会与试剂发生反应，导致最终谱图产生误导性结果。值得注意的是，二甲基亚砜也会与TMDP发生反应，因此不能作为共溶剂使用。当出现溶解性问题时，可使用吡啶类离子液体（如1-烯丙基-3-丁基吡啶氯化物）；但需再次确保该离子液体处于干燥状态48。对于木质素磺酸盐（一类具有高磺化程度的木质素），研究表明，通过预处理将其中和态基团转化为酸性形式有助于溶解。可在水相中使用酸性交换树脂将木质素磺酸盐方便地转化为其酸性形式。生成的木质素磺酸可通过特定树脂（例如XAD-7）吸附后，再以乙醇解吸的方式从溶液中分离。将乙醇溶液在40 °C减压条件下蒸发，即可获得木质素磺酸。这类木质素随后可采用31P NMR进行表征，因其可溶于本方案推荐的吡啶/氯仿混合溶剂体系中。
在温和温度下长时间进行真空干燥可有效降低每个样品中的水分和其他挥发性物质含量。值得注意的是，少量水不会影响最终谱图，因为TMDP是过量加入的。此外，在某些情况下，核磁共振管或样品小瓶中残留的湿度可能导致生成少量2-羟基-4,4'-5,5'-四甲基-1,3,2-二氧磷杂环戊烷。此时，只需搅拌即可完全溶解所形成的沉淀物。如果生成了大量2-羟基-4,4'-5,5'-四甲基-1,3,2-二氧磷杂环戊烷，则建议重复样品制备过程，并改进干燥处理步骤。例如，使用前可先用加热枪短暂加热所有玻璃器皿。
与不同羟基信号所关注的区域相比，用于记录谱图的光谱范围较宽。然而，这是为了确认样品衍生化是否成功所必需的。样品完全衍生化的确认依据是在约174 ppm处出现一个强信号。该尖锐峰来自未反应的TMDP，其存在表明试剂过量，因此所有羟基均已实现衍生化。如果该峰缺失，最可能的两个原因是：（1）所用TMDP的量不足以完成样品的完全衍生化，或（2）样品中存在大量水分。在第一种情况下，增加TMDP的用量可能确保样品完全衍生化，从而在174 ppm处出现信号；在第二种情况下，应更彻底地干燥样品。一旦确认TMDP过量，即可进行峰面积积分。在此操作之前，应将谱图缩放至更窄的范围（150至132 ppm），以集中显示感兴趣的信号区域。
上述实验方案中提到的待分析样品量（约30 mg）是为300 MHz或更高场强的核磁共振（NMR）波谱仪获得高质量谱图而选定的。然而，我们发现若使用500 MHz或更高场强的磁体，可以减少样品用量。例如，在图8D中展示了使用7.2 mg木质素制备的样品在700 MHz仪器上测得的NMR谱图。对该谱图进行信号积分所得结果与使用较大量木质素时获得的结果一致。这一事实显著扩大了本实验方案在仅能获得少量产物的研究工作中的适用性。
总体而言，当需要了解木质素和单宁中各类羟基的来源和去向时，该实验方案可广泛应用于多种研发领域。特别是当结合凝胶渗透色谱（GPC）和异核单量子相干（HSQC）数据时，所得结果为进一步深入分析和推测木质素或单宁的结构提供了可能。在许多对木质素或单宁的羟基进行化学修饰的研究中，定量31P核磁共振（NMR）分析对于检测此类修饰是否发生及其程度具有极高的价值。例如，图9展示了同一种木质素在氧化前后的两个NMR谱图。通过简单的定性评估即可发现，氧化后脂肪族和芳香族羟基均有所减少，从而提供了有价值的信息和指导。
<img alt="显示以 ppm 为单位的化学位移的核磁共振谱图；强度变化表明样品组成。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig09.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 9"> 
图 9：使用 TMDP 衍生化的同一样品的定量 31P NMR 谱图（A）氧化前和（B）氧化后。谱图使用 300 NMR 波谱仪记录。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
总之，该技术具备成为最重要且最强大工具之一的全部特征，在化学、工程学、生物学、高分子科学以及药物应用等多个领域，当需要对多酚类、含羟基的木质素、单宁（甚至合成聚合物）进行研究时，该技术尤为关键49,50,51。

该实验方案最近发表于《Nature Protocols》1，已在文献中被引用超过3,000次，因其能够提供关键、快速且可重复的结构信息，已成为木质素和单宁表征的常规测定方法。
木质素与单宁 
当保罗·T·阿纳斯塔斯（Paul T. Anastas）和约翰·C·韦纳（John C. Werner）提出绿色化学概念2,3时，化学学科的整体观念发生了根本性变革。其中尤为强调，应以可持续性材料替代石油、煤炭等化石原料作为化学工业的起始原料，这一点被视为至关重要的原则2,3。在各类生物质中，木质素是最丰富的芳香族生物聚合物，被视为一种潜在的工业原料和高附加值产品的来源4。
木质素是第二丰富的木材组分（纤维素居首位，半纤维素居第三位）。其在植物中的含量因植物种类而异：例如，硬木的木质素含量低于软木（分别为20% ± 4% 和 28% ± 4%）。此外，木质素在植物组织中的分布并不均匀：细胞壁中的木质素含量较高5,6。木质素是一种多酚类物质，工业上作为造纸/纤维素工业的副产物获得7。它来源于木材制浆过程，在该过程中，木片主要在OH- 和/或 OH- + HS- 离子条件下处理，以分离纤维素、半纤维素和木质素（即烧碱法和/或硫酸盐法）8,9。
对木质素的首次研究尝试分别由 Payen 和 Schultze 于 1838 年和 1865 年完成10。1977 年，Adler 总结了当时所有相关的已有知识11。目前公认，木质素的基本结构单元为三种苯基丙烷类单体：对香豆醇（p-coumaryl）、松柏醇（coniferyl）和芥子醇（sinapyl alcohol）。这些单体通过自由基聚合反应，形成对羟基苯基（p-hydroxyphenyl）、愈创木基（guaiacyl）和芥子基（sinapyl）单元，最终广泛构成木质素（图 1）12。由于木质素缺乏明确的一级结构，其结构表征存在固有困难。因此，对其分子量分布的评估一直存在一定的争议。磨木木质素是在温和条件下提取的木质素，最接近原木质素（protolignin）10，由寡聚物组成13，并通过超分子聚集过程发生强烈的相互作用14,15。
<img alt="木质素结构示意图，显示化学键；突出显示丁香基、愈创木基羟基基团。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：软木木质素的代表性模型，其中不同类型的化学键被突出显示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
木质素通常根据以下因素进行分类：（a）其来源木材的类型（例如硬木和软木），（b）用于分离它的工艺。最重要的工业木质素类型包括硫酸盐木质素（Kraft）、木质素磺酸盐（Lignosulfonates）和有机溶剂法木质素（Organosolv）。
木质素的结构高度依赖于其来源和加工化学过程。更具体而言，当木质素本身较为复杂且不规则的结构，与其天然的多样性以及复杂的加工化学过程相互叠加时，所形成的材料表现出极高的变异性、多样性和异质性，从而限制了其在低附加值领域的应用16. 软木木质素主要含有愈创基单元（G），而几乎不含 p-羟基苯基单元（G型木质素），硬木木质素由愈创木基和丁香基单元（GS型木质素）以不同比例组成，而草本植物木质素则由愈创木基、丁香基以及 p-羟基苯基（GSH木质素）结构单元。用于分离的提取方法会显著影响所得木质素的结构17. 图2 展示了三种因分离方法不同而结构各异的木质素。关于提取方法对木质素结构的影响，可提出以下几点考虑：首先，硫酸盐木质素（Kraft lignin）是一种脱烷基化、高度断裂且发生缩合的木质素，而有机溶剂木质素（Organosolv lignin）的结构则与磨木木质素（milled wood lignin，采用Bjorkman法分离）相似18,19,20最后，木质素磺酸盐的磺化程度较高，具体程度取决于提取磺化工艺的强度和条件。
<img alt="化合物A、B、C的分子结构图；化学键示意图；有机化学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：工业木质素的代表性结构。 本图展示了不同类型木质素之间的差异。（A）软木硫酸盐木质素高度缩合，（B）木质素磺酸盐的特征是饱和碳上带有磺酸基团，（C）有机溶剂木质素的结构与磨木木质素相似。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
与木质素类似，单宁是一类存在于植物中的多酚类化合物。Das 等人最近发表了一篇关于单宁提取方法及其应用的最新综述21。单宁在日常生活中的重要性可通过两个例子加以说明：它们赋予葡萄酒风味和色泽22；此外，其多酚结构具有抗氧化特性，并使其成为制革工业中的理想材料23。单宁分为两类：可水解型和不可水解型。可水解单宁可视为没食子酸、二没食子酸和鞣花酸酯的聚合物（图3）。这些酯类由酚酸与糖分子（如葡萄糖、鼠李糖和阿拉伯糖）发生酯化反应形成。
<img alt="化学结构图，多酚化合物，静态分子式，分子分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：典型的可水解单宁：单宁酸、维斯卡林。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
非水解性单宁，也称为缩合单宁，是由黄烷-3-醇衍生而来的聚合物和寡聚物。在黄烷-3-醇中，儿茶素和没食子儿茶素最为常见。它们是无色结晶化合物（图4）。聚合反应形成具有螺旋结构的聚合物，芳香羟基朝向螺旋的外侧，而吡喃氧原子则位于内侧。
<img alt="显示黄酮类分子的化学结构，带有羟基和R基团变化的分子图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：原花青素结构：R = H, OH, OCH3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
利用核磁共振表征木质素和单宁 
在木质素或单宁的表征中，两类信息至关重要：(a) 化学结构（例如羟基含量、单元间连接键的性质与频率）以及 (b) 分子量和分子量分布。自早期对木质素的研究以来，已采用多种技术来实现这些目标，并逐渐形成了两类方法：化学方法和物理方法。
在木质素化学领域，化学方法（如碱性硝基苯氧化法、衍生化后还原裂解法、高锰酸盐氧化法和硫代酸解法）在历史上被广泛使用24,25,26,27,28,29。然而，即使分析方案已被建立并优化，这些方法仍耗时较长、操作繁琐，且需要较高的实验技能30。相比之下，自仪器分析发展之初，物理方法便已被用于木质素和单宁的表征31。这些技术能够克服经典方法的诸多问题，使木质素结构的表征更加简便。
在各种仪器分析技术中，核磁共振（NMR）能够提供有关木质素结构和化学组成的信息。特别是定量的一维1H NMR谱图和定量的13C NMR谱图数据，可提供有关不同类型木质素单元间连接键的信息32,33,34,35。然而，一维谱图存在信号重叠的问题，可能严重影响信号积分的准确性。为了更深入地理解木质素结构，研究人员已采用定量版的HSQC（异核单量子相干谱）技术，即Q-HSQC（定量异核单量子相干谱），以获取有关内部连接方式的有用信息。但该方法仍无法完全用于定量测定各种结构单元13,36,37。
为克服与一维和二维核磁共振相关的难题，已考虑采用底物衍生化方法。该方法的优势之一是在复杂的生物大分子中可引入特定标记，且标记底物所溶解的溶剂不会产生谱图干扰。1Verkade 是该领域的先驱，进行了 31磷衍生物、煤衍生物及相关化合物的³¹P核磁共振分析38在其发表的研究中，对多种含磷试剂（磷杂环戊烷）进行了筛选，并记录了其他标记化合物的化学位移。Argyropoulos 团队于 1991 年首次引入衍生化方法，用于木质素中羟基的定性和定量分析. 在研究了含磷试剂对木质素模型化合物的衍生化反应后，他的课题组为木质素化学中一项最常用的日常技术奠定了基础， 31P NMR 分析39,40,41,42,43在所研究的各种磷杂环戊烷中，Argyropoulos 发现 2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂磷杂环戊烷（TMDP）是最适合用于木质素分析的试剂44TMDP 选择性地与羟基反应，导致定量生成含磷衍生物，其特征为特定的 31P NMR化学位移（图5).
<img alt="在CDCl3/Pyr中进行木质素磷酸化，化学反应图，有机合成过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：木质素与单宁的磷酸化化学反应。 通过原位反应实现对木质素和单宁中不稳定氢基团的标记。标记后的多酚类物质可通过31P核磁共振谱中对应于不同类型羟基的特征谱带进行表征。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
样品衍生化在吡啶/氯仿（1.6:1）混合溶剂中进行；该选择基于准确评估。吡啶具有两个优势。首先，选择希尔德布兰德参数约为22.1 MPa1/2的溶剂可简化并增强木质素的溶解性45。因此，使用希尔德布兰德参数为21.7的吡啶作为溶剂是最佳选择。其次，TMDP与羟基的反应会伴随生成盐酸（HCl）副产物，这会对木质素-磷杂环衍生物的顺利形成产生不利影响。因此，生成的HCl需要被中和。当吡啶相对于TMDP大量过量存在时，其碱性可中和HCl（通过形成吡啶盐酸盐）。
推荐使用吡啶/氘代氯仿二元溶剂体系基于以下三个原因。首先，该体系有利于样品溶解。其次，由于吡啶盐酸盐可溶于氯仿，因此能够防止沉淀产生并避免最终谱图质量下降。第三，选择氘代氯仿是因为其具有独特的单峰信号，可在数据采集过程中实现核磁共振波谱仪的信号锁定。样品衍生化反应在内标物存在下进行。通过使样品与内标物同时发生衍生化，比较样品峰与内标物峰的积分面积，即可实现对每种羟基类型含量的定量分析。已有多种化合物被用作内标物。这些化合物的特征是每个分子含有一个羟基，衍生化后在31P核磁共振谱中产生单一且尖锐的信号。内标物的选择必须谨慎，其信号不应与衍生化后样品的信号发生重叠。胆固醇在早期被广泛使用，但其信号与脂肪族羟基信号存在部分重叠，限制了其应用。对于常规分析，优先选用N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二羧酰亚胺（NHND）作为内标物溶液。然而，由于NHND稳定性较差，其标准溶液仅可保存数天46。

<table><tbody><tr><td>100 - 1000 &amp;micro;l Eppendorf 移液器</td><td>VWR</td><td>613-0866</td><td></td></tr><tr><td>20 - 200 &amp;micro;l Eppendorf 移液器</td><td>VWR</td><td>613-0865</td><td></td></tr><tr><td>2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧磷杂环戊烷，95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>447536</td><td></td></tr><tr><td>分析天平（灵敏度 &amp;plusmn; 0.1 mg）</td><td>Precisa</td><td>LX220 A</td><td></td></tr><tr><td>Binder 真空干燥箱</td><td>Binder</td><td>VD53</td><td></td></tr><tr><td>认证低吸附（LA）小瓶套装，2 mL，每包100个</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29651-U</td><td></td></tr><tr><td>氘代氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151823</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇，Sigma 级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>分子筛，4A型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208604</td><td></td></tr><tr><td>N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二羧酰亚胺，97%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>226378</td><td></td></tr><tr><td>300 MHz 核磁共振波谱仪</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Norell&amp;nbsp;天然石英 3 mm 核磁管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NORS33007</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头，100-1000 &amp;micro;L 超细型（蓝色）</td><td>VWR</td><td>613-0342</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头，20-200 &amp;micro;L 斜尖型（黄色）</td><td>VWR</td><td>613-0239</td><td></td></tr><tr><td>吡啶，无水，99.8%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td></td></tr><tr><td>微型搅拌子，3 mm 长度</td><td>VWR</td><td>442-0360</td><td></td></tr><tr><td>微型搅拌子，6 mm 长度</td><td>VWR</td><td>442-0362</td><td></td></tr><tr><td>三苯基氧化膦，97%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T84603</td><td></td></tr><tr><td>环境分析用小瓶，WHEATON，&amp;nbsp;20.00 mL</td><td>DWK Life Sciences</td><td>WHEAW224609</td><td></td></tr><tr><td>称量纸，531级</td><td>VWR</td><td>516-0318P</td><td></td></tr></tbody></table>

定量31p nmr 分析木质素和单宁

Quantitative 31P NMR Analysis of Lignins and Tannins

可持续生物炼制产品的开发面临诸多挑战，其中之一便是木质素和单宁的高值化利用。这些丰富且可再生的芳香族生物聚合物由于其固有的结构复杂性以及高度的变异性与物种多样性，尚未得到广泛开发。这些多酚类物质缺乏明确的一级结构，且在加工过程中会发生复杂的化学变化，进一步增加了其结构特征的多样性，而这些结构特征对其后续利用具有极为重要的意义。
因此，建立一种快速、简便且明确鉴定和定量天然多酚中各类官能团的实验方案，是理解并据此调控其反应性及潜在应用价值的基本前提。
定量31P核磁共振提供了一种快速、可靠的方法，可用于鉴定木质素和单宁中的未取代、邻位单取代和邻位二取代酚羟基、脂肪族羟基以及羧酸官能团，具有广泛的应用前景。
该方法包括一个 原位 使用合适方法的定量木质素或单宁标记步骤 31含P探针，随后进行定量获取 31存在内标物条件下的P核磁共振谱。磷的高天然丰度 31P核能够使用少量样品（约30 mg）并实现较短的核磁共振采集时间（约30–120分钟），且获得谱峰分辨良好的结果 31P信号对标记的OH基团周围化学环境具有高度依赖性。

本方案可用于木质素和单宁的分析。在木质素化学中，该方法至关重要，因为它能够检测并定量不同类型羟基。图8A-D展示了使用不同工作频率的核磁共振波谱仪测得的木质素和单宁的31P NMR谱图示例。图8A的谱图使用300 MHz NMR波谱仪记录，而图8D则使用700 MHz NMR仪器记录。
<img alt="核磁共振波谱图显示化合物分析的化学位移与强度关系，并标注了谱峰。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig8v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图8"> 
图8：（A）软木硫酸盐木质素（使用300 MHz波谱仪对30.8 mg木质素样品测得的谱图）、（B）软木木质素磺酸（将木质素磺酸盐转化为木质素磺酸后，使用300 MHz波谱仪对30.1 mg木质素样品测得的谱图）、（C）相思子单宁（使用300 MHz波谱仪对30.3 mg样品测得的谱图）和（D）软木硫酸盐木质素（使用700 MHz波谱仪对7.2 mg木质素样品测得的谱图）的定量31P NMR谱图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig8v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
这些谱图经过仔细的手动记录和处理。脂肪族（150–145 ppm）、芳香族（145–137 ppm）和羧基（136–134 ppm）羟基的典型信号分辨良好，因而易于积分。若将谱图范围扩大（从 95 到 190 ppm，图8），可明显观察到三个尖锐且强的峰（175、144 和 132 ppm），分别来源于过量的 TMDP、内标物（胆固醇或 NHND）以及羟基化 TMDP（由痕量水引起）。
与硫酸盐木质素和有机溶剂木质素不同，木质素磺酸盐在吡啶/氯仿混合液中不溶。为了获得可靠的31P NMR谱图，溶解性是必需的。为解决这一问题，可在衍生化前将木质素磺酸盐转化为相应的木质素磺酸。通过强酸（如硫酸）或酸交换树脂（例如Dowex 1H，一种强酸性阳离子交换树脂）处理木质素磺酸盐溶液，可使所有磺酸基团转化为其酸性形式。所得产物可用选择性吸附树脂（XAD-7，一种极性吸附剂，用于分离分子量高达60,000 u.m.a的化合物）从酸性溶液中去除，并使用本方案进行分析。图8B展示了经TMDP衍生化的木质素磺酸的定量31P NMR谱图。即使在此情况下，各类羟基的信号也清晰可辨。图8C展示了一个单宁样品经TMDP衍生化后的典型定量31P NMR谱图。来自脂肪族OH（C环）、连苯三酚、邻苯二酚（B环）以及A环单元的特征信号均清晰可见。

31P NMR 是解析多酚结构的有力工具。这种快速、简便、精确、定量且高度可重复的分析方法，能够对木质素和单宁中的各类羟基、酚羟基及羧基进行定量和区分，现已成为常规的分析手段。

定量31P NMR 分析木质素和单宁

可持续生物炼制产品的开发面临诸多挑战，其中之一便是木质素和单宁的高值化利用。这些物质储量丰富，……

定量磷核磁共振（NMR）是近三十年来木质素和单宁分析化学领域最重要的突破之一。该技术可快速、可靠且定量地提供样品中各类羟基的信息。这些核磁共振方法在解析木脂素和单宁结构方面具有重要价值。该方法也已应用于其他多种含有活性羟基的体系。首先，将100毫克木质素或单宁样品在40摄氏度的真空烘箱中干燥过夜，进行预处理。干燥后，迅速将样品转移至无水硫酸钙干燥器中，直至其冷却至室温。为进行核磁共振波谱分析，准确称取约30毫克样品置于一个带有搅拌子的2毫升小瓶中。接着，向样品小瓶中加入500微升新配制的溶剂溶液，并用瓶盖密封小瓶。使用微量移液器向样品小瓶中加入100微升内标溶液，然后将所得分散液在500转/分钟条件下进行磁力搅拌。当样品完全溶解后，在通风橱中操作，将100微升四甲基二氧膦烷（TMDP）转移至样品溶液中，并在将样品置于剧烈磁力搅拌前密封溶液。此时，所述反应在木质素和单宁样品上发生。使用巴斯德移液管将样品溶液转移至核磁共振（NMR）管中进行分析。如果在样品中观察到黄色沉淀，则需重复实验步骤，并确保避免所有可能的湿气污染。将样品管装入配备宽带探头的核磁共振仪中，并设定实验参数。根据氘代氯仿的共振频率，在波谱仪中设定相应的频率。在开始采集之前，对样品进行匀场并调节波谱仪。通过执行傅里叶变换，开始处理来自磷-31核磁共振（P31 NMR）波谱的原始数据。展开处理选项卡，选择相位校正和手动校正，通过手动相位校正调整相位。通过点击“处理”并选择“基线”和“多点基线校正”，手动精确设置零点以校正基线。对于信号校准，在分析选项卡中打开参考选项，将磷酸化水信号的化学位移值设为132.2 ppm。对于信号积分，在分析菜单中打开积分功能。为进行积分归一化，通过点击峰选择“编辑积分”，在归一化选项卡中将内标设为1.00，然后根据论文中报道的化学位移进行谱图积分。使用公式计算内标（IS）溶液的摩尔浓度，并利用计算得到的数值估算每克样品中特定信号的当量。采用300兆赫和700兆赫核磁共振波谱仪，记录了经TMDP衍生化的软木硫酸盐木质素中各类羟基基团的谱图定量结果。在核磁共振谱中，由于内标物和TMD羟基化的作用，在144和132 ppm处检测到尖锐且强的峰。所有定量的木质素³¹P核磁共振谱中均明显显示出不同羟基基团的信号。在使用TMDP衍生化的单宁样品的定量³¹P核磁共振谱中，来自不同脂肪族羟基、连苯三酚和邻苯二酚单元的特征信号清晰可见。使用300兆赫核磁共振波谱仪记录氧化前后木质素的核磁共振谱图对比，显示羟基峰强度降低。关键步骤包括样品的干燥与称重，以及所用核磁共振处理参数。其中最重要的是所得谱图的相位校正。当该方法与二维核磁共振和凝胶渗透色谱联用时，可获得天然多酚的非常详尽的图景，提供前所未有的结构信息和新的见解。

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