Name: 多光子活体成像用于监测小鼠后肢模型中动脉生成过程中白细胞募集 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 了解多光子活体成像技术如何在小鼠后肢模型中实时追踪白细胞募集与渗出，以研究动脉生成过程中的免疫细胞动态。该方法具有高时空分辨率和低光毒性，为血管生物学研究提供重要工具。

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本研究由德国研究基金会SFB 914（HI-A/SM，项目Z01）资助。我们感谢Susanne Stutte博士对稿件的审阅。

本研究经巴伐利亚动物护理与使用委员会批准（伦理代码：ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99）；这些实验严格遵循德国动物立法指南进行。
1. 动物与股动脉结扎（FAL）
注意：为诱导无菌性炎症和动脉生成，使用8-10周龄雄性C57BL/6J小鼠。在FAL或假手术期间及术后，所有小鼠均未出现死亡、伤口感染或伤口愈合障碍。
<ol>
	<li>麻醉 
	注意：在注射MMF混合麻醉剂之前，建议先使用5%异氟烷进行诱导麻醉，直至小鼠进入睡眠状态。
	<ol>
		<li>称量小鼠体重，并配制MMF混合液，剂量为咪达唑仑5.0 mg/kg、美托咪定0.5 mg/kg和芬太尼0.05 mg/kg。</li>
		<li>用1 mL注射器抽取MMF混合液，使用30 G针头皮下注射最终体积100 µL（在5%异氟烷麻醉后进行）。</li>
		<li>将小鼠置于保温垫上，等待其完全麻醉。设定计时器为35分钟。在此时间后，皮下注射半剂量（50 µL）的MMF混合液。</li>
		<li>通过检测小鼠的足底反射和趾间反射（用力捏脚趾）来评估麻醉深度。 
		注意：无反应表明镇痛深度足够&#160;。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>股动脉结扎（FAL） 
	注意：使用无菌外科器械和缝线。在切开皮肤前和缝合后均需用消毒剂对皮肤进行消毒。
	<ol>
		<li>将麻醉后的小鼠置于加热板（35–37 °C）上，以维持生理体温。在每只眼睛上涂抹眼膏（右泛醇），防止麻醉期间眼睛干燥。</li>
		<li>在FAL手术前后，将麻醉后的小鼠转移至激光多普勒成像（LDI）舱内，以检测血流和灌注情况（图1A-C）。</li>
		<li>去除毛发，消毒皮肤，并做切口以暴露股动脉。在手术显微镜下，使用编织丝线（7-0）结扎小鼠右后肢股动脉，并对左侧股动脉进行假手术操作，作为内部对照，方法如前所述6（图1D-K）。 
		注意：皮肤切口使用小剪刀完成，以避免直接损伤靠近皮肤的血管&#160;。</li>
		<li>使用编织丝线（6-0）缝合皮肤。在拮抗麻醉前10分钟开始，每12小时皮下注射一次布托啡诺（0.1 mg/kg），以缓解疼痛。术后24小时内观察动物是否出现疼痛迹象，例如梳理行为减少、不愿活动或弓背姿势。</li>
		<li>FAL手术完成并缝合皮肤后，皮下注射纳洛酮（1.2 mg/kg）、氟马西尼（0.5 mg/kg）和阿替美唑（2.5 mg/kg）的组合，以拮抗麻醉作用。</li>
		<li>术后将小鼠保持在保温垫上，并持续监测动物状态，直至其能够维持直立姿势并在笼内正常行走。</li>
		<li>当小鼠完全清醒后，将其放回笼中与其他小鼠一同饲养，并将笼子送回动物饲养室。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 多光子活体成像的组织准备
<ol>
	<li>尾静脉注射 
	注意：在开始活体成像准备之前，动物必须处于麻醉状态。在插入静脉导管针头之前，建议在尾部涂抹皮肤消毒剂。这也有助于观察血管。
	<ol>
		<li>使用2 × 30 G针头、10 cm细内径聚乙烯管（内径0.28 mm，外径0.61 mm）、1 mL注射器以及组织用Histoacryl胶水制备尾静脉注射导管，用于成像过程中后续的静脉注射（图2A、B和图2F）。</li>
		<li>准备用于静脉注射的抗体溶液：CD45-PE和CD41-FITC（每只小鼠20 µg），最终体积为100 µL。</li>
		<li>检查小鼠尾部侧面的尾静脉，阻断静脉以识别尾静脉。对尾部进行消毒，插入静脉导管，并使用组织Histoacryl胶水固定导管（图2B）。</li>
		<li>在成像前（至少提前15分钟）并在完成组织准备后，注射抗体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织准备 
	注意：在组织准备前，始终使用加热垫，并在每只眼睛中滴加一滴眼膏（右泛醇）。使用无菌外科器械和缝线。在切开皮肤前和缝合后均需用消毒剂对皮肤进行消毒。
	<ol>
		<li>将麻醉后的小鼠放置在稳定且可移动的垫子上。使用胶带通过四点固定法将小鼠以仰卧位固定在垫子上（图2B）。</li>
		<li>取两块塑形黏土，置于小鼠后肢上部下方，以确保收肌处于水平位置（图2B，红色箭头所示）。</li>
		<li>为维持小鼠稳定的37 °C体温，将带有小鼠的垫子放置于加热板上，并置于具有0.64–4.0倍变焦功能的手术显微镜下（图1L）。</li>
		<li>去除双侧腿部的毛发，对皮肤进行消毒，并围绕右侧后肢先前股动脉结扎处的瘢痕做环形切口（图1M）。</li>
		<li>去除腿部上方的皮肤和脂肪层（图1N、O），并用缝线将剩余皮肤拉开，围绕收肌形成一个袋状结构（图1P、Q）。</li>
		<li>去除皮下脂肪，以清晰观察收肌、深部动/静脉以及侧支血管（图1Q、R）。</li>
		<li>使用精细镊子小心地分离并去除覆盖在侧支血管上方的浅层肌肉组织（图1R）。 
		注意：侧支动脉和侧支静脉已清晰可见，可进行成像（图1S）。</li>
		<li>向制备好的袋状结构中注入生理盐水，防止组织干燥，并对假手术处理的左侧后肢执行相同操作。成像前，在两个袋状结构中加入超声耦合凝胶，以防止干燥，并作为物镜光学耦合的浸没介质（图2C和图2F）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 活体多光子显微镜
<ol>
	<li>准备 
	注意：在显微镜的培养箱室内放置一支装有超声耦合剂的注射器，以在长时间成像期间保持温暖，便于补充耦合剂。
	<ol>
		<li>移除两个准备好的口袋中的生理盐水，并替换为超声耦合剂以覆盖侧支血管（图2C）。</li>
		<li>通过尾静脉导管注射抗体溶液。&#160;注射抗体15分钟后，将固定好小鼠的垫板转移至预热的多光子成像室（图2F）。</li>
		<li>图像采集完成后，在深度麻醉下通过颈椎脱位处死小鼠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多光子显微镜图像采集 
	注意：成像前30分钟开启显微镜，以使激光器达到稳定状态。为获得最佳的显微镜光学稳定性，建议始终保持显微镜室加热。
	<ol>
		<li>打开Ti:Sapphire激光器箱的电源开关、电子接口箱、培养室加热装置、荧光灯以及计算机（图2D、E）。</li>
		<li>启动采集软件（Inspector软件）。将波长设为800 nm，并打开显微镜快门（图3A ii）。</li>
		<li>在测量向导对话框中，选择仪器模式（单光束）和测量模式（3D扫描时间序列）（图3A i）。</li>
		<li>将麻醉后的小鼠转移至预热的显微镜培养室中。将涂有超声耦合剂的区域（步骤2.2.8）与物镜前端镜头直接接触（图2F）。</li>
		<li>打开落射荧光显微镜快门，选择适合FITC观察的滤光片/二向色镜设置（4），在落射荧光照明下根据血流追踪找到目标区域。将目标区域移至视野中心后，关闭落射荧光显微镜快门。</li>
		<li>在xy扫描仪对话框中设置以下参数：图像尺寸（554×554），像素（512×512），频率（400），线平均（1）（图3A iii）。调节激光功率（5%）（图3A iv），并设置绿色通道（66）、红色通道（66）和蓝色通道（63）的光电倍增管（PMT）增益（图3A v）。</li>
		<li>选择适合活体成像和漂移校正的物镜及相应设置（详见3.2.11）。 
		注意：此处选用的物镜为Nikon LWD 16x（图3A vi）。</li>
		<li>通过点击测量向导对话框窗口右上角的红色按钮，启动预览采集模式，以定义图像堆栈范围（图3A i）。</li>
		<li>通过调焦获得清晰图像，确定目标区域和结构。然后在观察屏幕的同时，向上移动物镜直至图像消失，并将其设为起始位置（起始=0）；再反向调焦，向下移动物镜直至图像再次从屏幕上消失，并将其设为轴向的终止位置（终止=40 µm）（图3A vii）。</li>
		<li>将步长设为2 µm。点击测量向导对话框右上角的红色按钮，停止预览扫描。 
		注意：图像数量将自动计算并设定（21张），如图3A vii所示。</li>
		<li>若显微镜配备实时漂移校正9，启动漂移校正软件（例如VivoFollow），并按以下步骤操作：
		<ol>
			<li>在测量向导对话框中，选择Python轴（Python Ax）（图3A viii）作为第一轴设备；切勿启用自动保存模式。仅在时间轴（Time Time）上勾选自动保存（AS）选项。点击可用设备窗口中的Python 图标（图3A ix），打开Python对话框窗口。</li>
			<li>在Python对话框轴设置中，输入起始（0）和终止（-40）。输入步数（21），如图3A x所示。</li>
			<li>进入xyz载物台Z对话框窗口，将扫描范围两端各扩展200 µm：在起始中输入（200 µm），在终止中输入（-240 µm），总范围将自动设为（-440 µm）。保持步长（2 µm），如图3A xi所示。</li>
			<li>打开VivoFollow Frontend 对话框，点击运动配置文件框（图3A xii）。</li>
			<li>点击Inspector软件测量向导对话框左上角的绿色箭头，开始图像采集（图3A i）。</li>
			<li>若使用实时漂移校正，注意查看是否出现漂移校正配置对话框（如图3A xiii所示）。设置用于作为固定标志参考的采集通道（本方案中选择通道2，用于记录血管示踪信号）。输入在首末z位置添加的最大校正偏移量（单位为µm）（此处为200 µm），然后点击确定。</li>
			<li>在图像采集过程中，通过VivoFollow前端对话框窗口实时监测x、y、z方向的当前漂移偏移量（图3A xiv）。</li>
			<li>约35分钟后需再次注射麻醉剂时，停止图像采集。皮下注射半剂量MMF混合液（50 µl s.c），然后再次点击绿色箭头重新开始图像采集（步骤3.2.11.5）。</li>
			<li>重复此过程直至实验结束。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. The top 10 causes of death. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death</a> (2020).</li>
<li>Deindl, E., Schaper, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+of+arteriogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The art of arteriogenesis.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 43 (1), 1-15 (2005).</li>
<li>Lasch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+RNA+released+due+to+shear+stress+controls+natural+bypass+growth+by+mediating+mechanotransduction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice.</a> Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).</li>
<li>Kumaraswami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+effective+flow+Ccytometry-based+method+for+identification+and+quantification+of+tissue+infiltrated+leukocyte+subpopulations+in+a+mouse+model+of+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593(2020).</li>
<li>Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+acute+and+subacute+murine+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166(2016).</li>
<li>Limbourg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+postnatal+arteriogenesis+and+angiogenesis+in+a+mouse+model+of+hind-limb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1737(2009).</li>
<li>Wagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+monocyte+homing+and+tumor-related+angiogenesis+in+a+murine+model+of+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290(2017).</li>
<li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP%2C+FLIP%2C+FLAP%2C+FRET+and+FLIM%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li>
<li>Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+tissue+offset+correction+system+for+intravital+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy.</a> Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).</li>
<li>Chandraratne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+platelet+glycoprotein+ibalpha+in+arterial+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

所述的多光子活体白细胞募集分析方法是对常用白细胞募集研究工具（如（免疫）组织化学或FACS分析）的补充。利用该成像方法，可更详细地观察在动脉生成过程中白细胞黏附和渗出的动态变化10。尽管该方法具有附加价值，但所提供的实验方案仍包含若干关键步骤和局限性。更多故障排除建议请参见表1。在剥离侧支动脉表层肌肉层时，可能损伤这些动脉，导致其无法用于活体成像。导管必须牢固固定以便抗体注射；否则，尾静脉导管滑脱可能导致抗体渗入尾部血管周围间隙，使抗体重新注射和剂量校正变得困难。在活体显微观察过程中，正确识别侧支动脉与侧支静脉是本方案中的另一个关键步骤。
由于在进行活体显微成像时小鼠未进行机械通气，因此需限制动态成像时间，以避免因麻醉时间过长而对小鼠造成物理损伤。活体显微成像的一个局限性在于小鼠的生理运动，例如呼吸、心跳和肠蠕动，这些运动会干扰图像采集，从而影响数据分析的质量。改进组织固定装置、安装方式和固定方法，有助于进一步减轻运动带来的影响。除了生理运动外，长时间成像还可能导致成像过程中组织发生...

尽管近年来对心血管疾病（如缺血性心脏病和中风）的研究兴趣浓厚，但其仍是全球死亡的首要原因1。目前针对这些疾病的治疗方法主要包括经皮腔内血管成形术、经皮冠状动脉腔内成形术或旁路手术等高度侵入性疗法2。因此，迫切需要开发替代性的非侵入性治疗手段。人体能够自然形成绕过狭窄或闭塞血管的侧支通路，将中断的血流重新导向狭窄远端区域，这一过程称为动脉生成（arteriogenesis）2。近年来大量研究表明，增强的流体剪切力会影响白细胞的募集，而白细胞募集在动脉生成过程中发挥着重要作用3。目前分析动脉生成过程中白细胞募集的主要方法包括离体（ex vivo）免疫组织化学分析或荧光激活细胞分选（FACS）技术4。为了实现对动脉生成过程中白细胞动态变化的评估，本文介绍了一种基于双光子显微镜的活体成像实验方案。
白细胞是动脉生成过程中被募集的主要血细胞3本方案采用多光子成像技术，观察在利用小鼠后肢缺血模型通过股动脉结扎（FAL）诱导动脉生成24小时后，经注射抗CD45-PE抗体标记的黏附白细胞在侧支动脉中的爬行行为。5,6. 或者，免疫细胞可以被标记 离体 并通过活体显微镜研究血管生成的实验所示，小心地注射到小鼠体内7血管和动脉内的血流可通过CD41-FITC（标记血小板）、葡聚糖-FITC（标记血浆）或二次谐波生成（SHG）进行可视化，其中SHG可显示血管树某些部位基底膜中存在的Ⅰ型胶原。SHG是多光子激发所特有的无标记效应。多光子成像能够在不损伤组织且避免激光激发导致细胞活化的情况下，实现对细胞的长期示踪。由于多光子显微镜能够以极低的光毒性深入组织/器官内部激发荧光标记物，因此成为在活体动物中可视化荧光标记细胞与结构的首选成像方法。8.
使用在飞秒时间间隔内发射脉冲的调谐红外激光，仅在焦平面上激发荧光染料，而在焦平面之上和之下均无激发8因此，多光子显微镜能够实现高时空分辨率、减少光损伤，并增强对组织深层的成像能力，适用于研究器官内部的动态生物学事件，是活体动物成像的理想显微技术。然而，多光子显微镜及其他各类活体显微成像技术均受到心跳、呼吸、蠕动、肌肉张力及其他生理功能引起的组织运动限制，这些运动干扰了图像的采集与分析。由于此类运动可损害时间和空间分辨率，有时甚至阻碍后续分析，因此必须妥善处理，以确保数据的准确分析与正确解读。目前已有多种策略被开发用于降低或防止组织运动带来的伪影。本方案采用一种 原位 一种名为VivoFollow的漂移校正软件9 用于校正图像采集过程中的组织漂移。该方法提供了必要的图像稳定，从而实现长期成像和细胞追踪分析。

<table><tbody><tr><td>1.0 mL 注射器</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>309628</td><td>注射用注射器</td></tr><tr><td>3M Durapore 外科胶带 1538-0</td><td>3M, St. Paul, MN, USA</td><td>1538-0</td><td>固定胶带</td></tr><tr><td>Atipamezole</td><td>Zoetis, Berlin, Germany</td><td></td><td>拮抗麻醉</td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK</td><td></td><td>拮抗麻醉</td></tr><tr><td>C57/B6J 小鼠</td><td>Charles River, Sulzfeld, Germany</td><td></td><td>用于手术/成像的实验动物</td></tr><tr><td>CD41-FITC 抗体</td><td>Biolegend</td><td>133904</td><td>体内血小板标记</td></tr><tr><td>CD45-PE 抗体</td><td>Biolegend</td><td>368510</td><td>体内白细胞标记</td></tr><tr><td>消毒剂 Cutasept</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland</td><td>AK64.2</td><td>消毒</td></tr><tr><td>眼膏（Bepanthen）</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>5g</td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany</td><td></td><td>麻醉</td></tr><tr><td>Flumazenile</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td><td></td><td>拮抗麻醉</td></tr><tr><td>细内径聚乙烯导管</td><td>Smiths medical</td><td>Lot 278316</td><td>内径 0.28 mm，外径 0.61 mm，用于静脉导管的导管</td></tr><tr><td>Histoacryl flexible</td><td>BRAUM</td><td>1050052</td><td>组织胶水</td></tr><tr><td>Imaris 软件</td><td>Oxford Instruments</td><td>version 9.2</td><td>用于细胞追踪、细胞速度分析、3D 投影</td></tr><tr><td>激光多普勒成像仪</td><td>Moor LDI 5061 和 Moor 软件版本 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEICA KL300 LED</td><td>Leica, Solms, Germany</td><td></td><td>显微镜照明光源</td></tr><tr><td>Leica M60</td><td>Leica, Solms, Germany</td><td></td><td>手术用显微镜</td></tr><tr><td>LEICA MC120 HD</td><td>Leica, Solms, Germany</td><td></td><td>显微镜用相机</td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Pfizer Pharma, Berlin, Germany</td><td></td><td>麻醉</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany</td><td></td><td>麻醉</td></tr><tr><td>多光子显微镜</td><td>Lavision</td><td>TRIMScope II</td><td>波长 820 nm</td></tr><tr><td>NaCl 0.9%</td><td>Braun, Melsungen, Deutschland</td><td>3570310</td><td>用于造袋的生理盐水</td></tr><tr><td>Naloxone</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td><td></td><td>拮抗麻醉</td></tr><tr><td>30 G 针头</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>305128</td><td>用于静脉导管的针头</td></tr><tr><td>丝线编织缝线（7-0）</td><td>Pearsalls Ltd., Taunton, UK</td><td>SUT-S&amp;nbsp;103</td><td>用于股动脉结扎的缝线</td></tr><tr><td>超声耦合凝胶</td><td>SONOSID-ASID BONZ 250 mL</td><td>782012</td><td>成像用凝胶</td></tr><tr><td>Vicryl 6.0 缝线</td><td>Vicryl, Johnson&amp;amp;Johnson, New Brunswick, NJ, USA</td><td>NW-2347</td><td>用于构建皮下袋的缝线</td></tr><tr><td>VivoFollow 漂移校正软件</td><td>由 Mykhailo Vladymyrov 开发</td><td></td><td>参考文献 9</td></tr></tbody></table>

多光子活体成像监测小鼠后肢模型中动脉生成过程中的白细胞募集

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

动脉生成在很大程度上依赖于白细胞和血小板向增生性侧支血管周围区域的募集。分析动脉生成过程中侧支动脉和白细胞的标准方法是 离体 （免疫）组织学方法。然而，该技术无法测量血流、剪切应力、细胞间相互作用以及颗粒速度等动态过程。本文介绍了一种用于监测 体内 利用活体成像技术研究动脉发生过程中侧支动脉的生长机制。本文所述方法是一种可靠的动态测量工具，通过多光子激发显微镜实现高对比度分析，并具有最低的光毒性。在分析生长中的侧支动脉之前，通过单侧股动脉结扎在小鼠的内收肌中诱导动脉发生。
连接后，由于剪切应力增加，已有的侧支动脉开始生长。术后24小时，移除侧支动脉上方的皮肤和皮下脂肪，构建一个用于进一步分析的腔隙。为观察血流和免疫细胞在 体内 成像，通过尾静脉导管静脉内（i.v.）注射CD41-异硫氰酸荧光素（FITC）（血小板）和CD45-藻红蛋白（PE）（白细胞）抗体。本文介绍活体多光子成像作为一种替代或 在体 对常用静态方法的补充 离体 （免疫）组织学分析方法，用于研究与动脉生成相关的生物学过程。综上所述，本文介绍了一种新颖且动态的 体内 一种用于研究动脉生成过程中免疫细胞迁移、血流及剪切应力的后肢模型方法，显著增强了评估的可能性。

多光子显微镜可实现高时空分辨率的白细胞追踪，能够跟踪和监测细胞迁移的步骤与速度（图4A、B）。然而，样本的生理运动带来了挑战，尤其是在长时间活体显微成像过程中。因此，成功的稳定成像需要良好的组织制备和固定组织的装置，以及用于实时校正组织漂移的工具。本研究中采用了实时漂移校正工具VivoFollow，以校正在长时间成像过程中产生的组织漂移。
该工具的应用可实现长期图像采集，并能够收集高质量数据，适用于细胞运动速度的追踪分析。如图3B所示，在未进行漂移校正的情况下，感兴趣区域会逐渐偏离记录视野，影响对细胞速度的追踪分析能力。然而，如图3C所示，使用漂移校正软件后，可记录稳定的视频，从而在较长时间内追踪更多细胞。漂移校正软件还可提供系统在x、y和z方向上随时间校正的偏移量可视化结果，如图3D所示。
<p cla...

白细胞和血小板的募集是动脉生成过程中侧支动脉有效生长所必需的关键组成部分。多光子显微镜是一种能够以高时空分辨率追踪细胞动态的高效工具。 体内 研究动脉生成过程中白细胞募集和血管外渗时，光毒性更小。

动脉生成在很大程度上依赖于白细胞和血小板向生长中的侧支血管周围血管外膜空间的募集。目前的标准方法是……

本方案使研究人员能够通过实时追踪生长中的侧支动脉内免疫细胞的黏附和渗出过程，在活体条件下分析动脉生成。多光子显微镜技术可在光毒性较低的情况下，以高时空分辨率对活体小鼠模型深层组织中的细胞动态进行可视化观察。显微镜操作步骤将由来自海伦·伊什卡瓦-安克尔霍尔德博士实验室多光子成像平台的技术助理多米尼克·范登赫弗尔（Dominic van den Heuvel）进行演示。我将演示手术操作步骤。首先，将麻醉后的小鼠置于仰卧位。然后，在小鼠后肢上部下方放置两块成型的黏土，以确保内收肌处于水平位置。将小鼠置于体视显微镜下。去除双侧腿部的毛发后，对右侧后肢先前股动脉结扎处的瘢痕周围皮肤进行消毒，并环形剪开皮肤。去除腿部表面的皮肤和脂肪层，用缝线将剩余皮肤向两侧拉开，于内收肌周围形成一个包含侧支血管的囊腔。接下来，去除皮下脂肪，以清晰暴露内收肌、股深动脉和静脉，以及侧支血管。使用精细镊子去除侧支血管上方的浅层肌层。用生理盐水填充制备好的组织腔隙，防止组织干燥，并对假手术处理的左侧后肢重复相同操作。成像前，在两个凹槽中加入超声耦合凝胶，以防止干燥，并作为物镜光学耦合的浸没介质。打开钛蓝宝石激光器电源开关、电子接口箱、培养室加热装置、荧光灯以及计算机的电源。启动图像采集软件。将波长设置为 800 纳米，并打开显微镜快门。在测量向导对话框中，选择仪器模式为单光束，测量模式为三维扫描时间序列。然后将麻醉后的小鼠转移至预热的显微镜培养室中，并调整位置，使涂抹超声耦合剂的区域与物镜前端镜头直接接触。打开落射荧光显微镜的快门。然后选择适合FTSE观察的滤光片或二向色镜设置。在落射荧光照明下，通过追踪血流来确定感兴趣区域。将目标区域移至视野中心后，关闭落射荧光显微镜的快门。在XY扫描对话框中，设置图像尺寸、像素、扫描频率和线条平均等参数。调节激光功率，并为绿色、红色和蓝色通道设置光电倍增管增益。选择适合活体成像和漂移校正设置的物镜。通过点击测量向导对话框中的红色按钮启动预览采集模式，以确定图像堆栈范围。为了获得良好的图像，通过调焦来定义感兴趣区域和结构。观察屏幕时，通过移动物镜直至图像消失，将此时的位置设为零点。将物镜位置设定为轴向的最后一个位置。然后反向调焦，向下移动物镜，直到图像再次从屏幕上消失。单击测量向导对话框左上角的停止按钮，并将步长设置为两微米。在测量向导对话框中选择 python 轴作为第一轴设备，并取消激活自动保存模式。然后仅在时间轴上勾选自动保存选项。接下来，在可用设备窗口中点击 Python 图标以打开 Python 对话框。在 Python 对话框的轴设置中，分别在“起始”和“终止”栏输入数值，然后输入步数。转到 XYZ 平台 Z 轴对话框，并将扫描范围在两端各增加 200 微米。为此，在“起始”位置输入 200 微米，在“结束”位置输入 -240 微米，范围将自动设置为 -440 微米。打开 VivoFollow 前端对话框。在测量向导对话框的左上角，按下绿色箭头开始图像采集。如果使用实时漂移校正，请等待漂移校正配置对话框出现。然后设置用于移动标志点参考的采集通道。输入在第一个和最后一个Z位置处添加的最大校正偏移量（单位为微米），然后点击“确定”。在活体成像前端对话框中实时监测X、Y和Z方向的当前漂移偏移量，并在成像35分钟后停止图像采集，此时需要进行下一轮麻醉剂重新注射。注射半剂量的MMF混合液，并重新启动成像采集，直至实验结束。该工具支持长期图像采集，能够实现高质量的数据收集，适用于细胞运动速度测量的追踪。如图所示，在未进行漂移校正的情况下，感兴趣区域会逐渐偏离记录视野，影响对细胞速度分析的追踪能力。然而，利用漂移校正软件可以记录稳定的视频，并在较长时间内追踪更多的细胞。漂移校正软件还可以提供随时间变化的X、Y和Z方向偏移量的可视化图像，这些偏移量已由系统进行校正。多光子显微镜具有高时空分辨率，可用于白细胞追踪，能够追踪和监测细胞迁移的步长与速度。在准备侧支血管进行多光子成像时，必须避免对侧支动脉造成损伤。在成像前，安全地识别出正确的侧支动脉至关重要。通过这种新的活体多光子成像侧支动脉技术，只需更换抗体标记，即可在体内分析所有血细胞的黏附和外渗行为。

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体内成像揭示白细胞在关节内的迁移行为

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多光子活体成像监测小鼠后肢模型中动脉生成过程中的白细胞募集

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