多光子活体成像用于监测小鼠后肢模型中动脉生成过程中白细胞募集

白细胞和血小板的募集是动脉生成过程中侧支动脉有效生长所必需的基本组成部分。多光子显微镜是一种有效的工具，用于跟踪体内 高 时空分辨率和较少光毒性的细胞动力学，以研究动脉生成过程中的白细胞募集和外渗。

我们的协议允许研究人员通过实时跟踪生长中的侧支动脉中的免疫细胞粘附和外渗来分析体内动脉生成过程。多光子显微镜技术允许以低光毒性和高时空分辨率可视化活小鼠模型深层组织中的细胞动力学。显微镜程序将由Helen Ishikawa-Ankerhold博士实验室多光子成像平台的技术助理Dominic van den Heuvel演示。

我将演示外科手术。首先，将麻醉的小鼠置于仰卧位。然后将两块模制粘土放在小鼠的上后肢下，以确保内收肌的平面位置。

将鼠标放在体视显微镜下。去除双腿的毛发后，在右后肢早期股动脉结扎的疤痕周围消毒并切开皮肤。从腿部顶部去除皮肤和脂肪层，并使用缝合线拉开剩余的皮肤，在内收肌周围与侧支血管形成一个口袋。

接下来，去除皮下脂肪，以清楚地看到内收肌、深动脉和静脉以及侧支血管。使用细镊子去除侧支血管顶部的浅表肌肉层。用生理盐水填充准备好的口袋以防止组织干燥，并对假手术的左后肢继续相同的程序。

在成像之前，在两个口袋中添加超声凝胶，以防止干燥，并用作与物镜光学耦合的浸没介质。打开钛蓝宝石激光盒、电子接口盒、培养箱加热单元、荧光灯和计算机的钥匙。启动采集软件。

将波长设置为800纳米并打开显微镜快门。在测量向导对话框中，选择仪器模式为单光束，选择测量模式为3D扫描延时摄影。然后将麻醉小鼠转移到显微镜的预热培养室中，并将超声凝胶直接与物镜前透镜接触的区域定位。

打开落射荧光显微镜快门。然后为富时可视化选择适当的过滤器或二向色性设置。通过在落射荧光照明下跟踪血流来定义感兴趣的区域。

将感兴趣区域带入中心视野后，关闭落射荧光显微镜快门。在XY扫描仪对话框中，设置图像大小、像素、频率、线平均值所需的参数。调整激光功率并设置绿色、红色和蓝色通道的光电倍增管增益。

为活体成像和漂移校正设置选择合适的物镜。通过按下测量向导对话框窗口中的红色按钮启动预览采集模式来定义图像堆栈范围。要获得良好的图像，请通过聚焦来定义感兴趣的区域和结构。

观察屏幕时，通过移动物镜直到图像消失并将其设置为零来改变焦点。将目标位置设置为轴向上的最后一个位置。然后通过向下移动物镜来改变相反方向的焦点，直到图像再次从屏幕上消失。

单击测量向导对话框左上角的停止按钮，并将步长设置为两微米。在测量向导对话框中选择 python 轴作为第一个轴设备，然后选择不激活自动保存模式。然后仅在时间轴上选中自动保存框。

接下来，按可用设备窗口中的 Python 图标以打开 Python 对话框窗口。在 Python 对话框轴设置中，输入"从"和"到"部分，然后输入步数。转到XYZ载物台Z对话窗口，将两端的扫描范围扩大200微米。

为此，请在开始输入 200 微米，在末尾输入负 240 微米，范围将自动设置为负 440 微米。打开 VivoFollow 前端对话框。通过按测量向导对话框左上角的绿色箭头开始图像采集。

如果使用实时漂移校正，请查找要显示的漂移校正配置的对话框。然后设置在移动地标参考中使用的采集通道。输入添加到第一个和最后一个 Z 位置的最大校正偏移（以微米为单位），然后单击"确定"。在体内流前端对话窗口中实时监测图像采集过程中X、Y和Z的电流漂移偏移，并在需要另一个麻醉重新注射周期时在35分钟后停止成像采集。

注入半剂量的MMF混合物并重新开始成像采集，直到实验完成。该工具允许长期图像采集，实现高质量的数据收集，适用于跟踪细胞以进行速度测量。如未进行漂移校正时所示，感兴趣区域会逐渐偏离记录视图，从而影响跟踪细胞以进行速度分析的能力。

但是，可以使用漂移校正软件记录稳定的动画，并且可以长时间跟踪更多的细胞。漂移校正软件还可以提供系统校正的 X、Y 和 Z 偏移随时间变化的可视化。多光子显微镜为白细胞跟踪提供了高时空分辨率，其中可以跟踪和监测细胞迁移步骤和速度。

通过准备用于多光子成像的侧支血管，必须避免对侧支动脉的损伤。在影像学检查之前，安全识别正确的侧支动脉非常重要。通过这种侧支动脉活体多光子成像的新程序，可以通过改变抗体标记来分析体内所有血细胞的粘附和外渗。