人鼻上皮类器官的培养和成像

这里提出了一个详细的方案来描述来自人类鼻上皮细胞的 体外 类器官模型。该协议具有需要标准实验室设备的测量选项，以及用于专用设备和软件的其他可能性。

囊性纤维化患者的个体化治疗可以通过体外疾病模型来实现，以了解基线时的CFTR活性。人鼻上皮类器官或HNE类器官产生与CFTR活性相关的不同大小的管腔，区分CF和非CF类器官。在这里，我们详细描述了一种培养和成像这些HNE类器官的方法。

功能失调的上皮离子转运，特别是氯离子和碳酸氢盐的上皮离子转运，导致上皮衬里液体积减少。这也会影响导致粘液淤积和梗阻的粘液分泌物。因此，我们的HNE模型已经针对各种应用进行了开发，具体取决于研究者的实验设计和资源。

除了在基线或响应治疗时评估CFTR活性外，该技术还可以应用于涉及上皮细胞功能的其他疾病，特别是上皮细胞液运输。这些方法主要用于囊性纤维化研究。其他评估气道上皮的研究，如原发性睫状体运动障碍，也可能发现这些方法有帮助。

这些技术需要注意细节和精度。它们还需要仔细观察，以确保细胞的初始扩增是适当的。每天监控所有文化，成功的可能性将更大。

首先，通过将细胞学刷通过1毫升大口径移液器尖端几次，在15毫升锥形管中将鼻刷活检解离到8毫升RPMI培养基中。将细胞以500倍g在四摄氏度下离心五分钟。弃去上清液，然后将细胞沉淀重新悬浮在三毫升的细胞分离溶液中。

在室温下孵育16分钟以消化。使用五毫升的扩增培养基将细胞洗涤两次。然后，将它们加入T75烧瓶中，预先播种有辐照，灭活和50%至60%融合的3T3成纤维细胞。

让细胞在扩增培养基中共培养和扩增7至14天。如果对囊性纤维化患者的细胞引入抗生素，应在培养的最初三天后用无抗生素扩增培养基替换培养基，并可继续每两天更换培养基，直至 80% 汇合。用1x DPBS洗涤细胞。

然后，向T75烧瓶中加入1.5毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA，并在37摄氏度下孵育4分钟，以从培养物中除去照射和灭活的3T3成纤维细胞。用1x DPBS冲洗T75烧瓶两次，以彻底洗掉任何剩余的3T3成纤维细胞。将1.5毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA加入T75烧瓶中，并在37摄氏度下孵育10分钟以分离HNE。

用大豆胰蛋白酶抑制剂以一比一的比例中和胰蛋白酶。将细胞以500倍gi离心五分钟。然后，弃去上清液并用五毫升扩增培养基洗涤细胞一次。

这些细胞现在已经准备好接种以生长类器官。将类器官培养物细胞外基质或ECM在四摄氏度下解冻过夜。在相同温度下冷却15孔血管生成载玻片过夜。

接下来，将移液器吸头冷却至四摄氏度。在冰上涂上五微升冷的100%ECM。将它们放入37摄氏度的细胞培养箱中至少30分钟以进行巩固。

使用血细胞计数器计算从共培养中收获的HNE。然后，将细胞稀释至每微升500个细胞，用20%的ECM在冰上用分化培养基稀释。将 ECM 包衣载玻片从培养箱中取出，将五微升冷池 ECM 混合物接种到每个孔中。

立即将载玻片转移到37摄氏度的培养箱中一小时，以巩固细胞ECM混合物。之后，将载玻片从培养箱中取出，并用50微升分化培养基将细胞送入15孔血管生成载玻片的每个孔中。将载玻片放回37摄氏度的培养箱中，每隔一天更换培养基，直到类器官准备好进行进一步的实验。

用细胞粘合剂预处理8孔玻璃底腔载玻片30分钟。丢弃溶液，将孔再风干30分钟。接下来，从ECM顶部丢弃培养基，然后将50微升的冷1x PBS加入冰上15孔载玻片的每个孔中。

使用200微升的大口径移液器吸头上下移液三到五次。将溶液分配到8孔载玻片孔的中心。通过细吸管立即从孔中除去多余的液体。

然后，将腔室载玻片放入37摄氏度的培养箱中40分钟，以增强粘附在玻璃底部的类器官。40分钟后，用1x PBS轻轻洗涤类器官两次，并用300微升4%多聚甲醛在每个孔中固定30分钟，设定室温。用1x PBS洗涤两次，并将类器官储存在1x PBS设定的4摄氏度中，以进行免疫染色长达两周。

为了收获用于组织学研究的类器官，从培养物中取出培养基，并在冰上的每个载玻片孔中加入50微升的1x PBS。使用200微升大口径移液器吸头上下移液三到五次。将15孔载玻片或培养插件中的所有溶液合并到冰上的15毫升锥形管中。

通过加入冷的1x PBS将管中的总溶液体积调节至10毫升。将管子在四摄氏度下离心，300倍g，持续五分钟。然后，吸出上清液并加入60微升温组织凝胶，使用200微升大口径移液器吸头与类器官沉淀混合。

立即将悬浮液转移到组织学模具中。在室温下固结组织凝胶后，将模具块放入4%多聚甲醛中，在4摄氏度下固定过夜。打开软件，然后右键单击屏幕底部。

然后，选择"分析控件"，然后选择"自动测量结果"。打开类器官图像，选择5至10个具有可见管腔的类器官。右键单击图像以打开菜单，然后选择多边形ROI以勾勒出完整的类器官，以获得类器官的总表面积。

然后，勾勒出流明以获得流明面积。对孔中剩余的类器官以及测定中的所有孔重复此操作。最后，将数据导出到 Excel。

将管腔面积除以总表面积，并平均样品中的所有类器官，以获得基线流明比。明场图像代表成功和不成功样本收集的HNE。HNEs在一个大集群中增长良好。

相比之下，HNE在照射的3T3细胞周围的两个小簇中生长不良。15孔载玻片中的类器官比培养插入物中的类器官具有更精确，更清晰的图像。除此之外，在这两种培养方法中没有观察到显着的形态学差异。

非CF类器官通常比CF类器官具有更大的管腔和更多的液体。这些图像显示了来自非CF，F508del / F508del受试者的类器官中的HNE染色以及类器官中纤毛的免疫荧光染色。这里显示了用乙酰化微管蛋白染色的纤毛，FITC标记的二抗和用DAPI标记的细胞核。

通过全贴片免疫荧光染色对两种代表性类器官的最大投影图像及其相应的三维重建图像如下所示。显示类器官腔内的粘液和纤毛。图形图像代表毛喉素诱导的肿胀测定，以测试原发性鼻上皮细胞上的CFTR功能。

这里显示了非CF志愿者的具有代表性的毛喉素剂量反应实验。将 FSK 剂量反应与 1 小时时的平均分数变化进行比较，而 8 小时时，这表明 8 小时测定在不同 FSK 剂量之间产生的肿胀差异比 1 小时时的肿胀差异更显著。与八小时时的平均分数变化相比，曲线下方的区域可以显示肿胀的微小差异。

在尝试此程序时，请记住，在收集，固定和染色过程中会丢失类器官。因此，在每个步骤中都必须小心谨慎，并且必须获得足够的起始数字以确保成功。随着这些技术的发展，在培养物插入物中生长类器官可以在这方面有所帮助。

在这里，我们使用市售的试剂和耗材，以促进扩展到其他研究人员。还开发了一种功能测定法，使用常见的显微镜技术和更专业的设备。