Name: 人鼻上皮类器官的培养和成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: 学习人鼻上皮类器官的培养和成像方法，用于囊性纤维化研究。该模型通过管腔大小评估CFTR活性，为个性化治疗提供体外疾病研究工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

我们衷心感谢所有为本方案的开发提供鼻上皮刷检样本的参与者。感谢Latona Kersh及儿童研究单位工作人员在研究志愿者招募和样本采集方面的协调工作。感谢本实验室前培训人员Lily Deng、Johnathan Bailey和Stephen Mackay提供的技术协助。感谢Zhong Liu和Rui Zhao提供的技术支持。阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）囊性纤维化研究中心主任Steven M. Rowe提供了领导支持和资源，没有这些支持，本工作将无法完成。我们还要感谢Biotek的Sarah Guadiana在仪器培训方面的协助，感谢UAB高分辨率成像中心的Robert Grabski在共聚焦显微镜方面的技术支持，以及感谢UAB组织学核心实验室的Dezhi Wang在组织学方面的协助。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目K23HL143167（授予JSG）、囊性纤维化基金会（CFF）资助项目GUIMBE18A0-Q（授予JSG）、Gregory Fleming James囊性纤维化中心［NIH资助项目R35HL135816和DK072482，以及囊性纤维化基金会阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）研发项目（Rowe19RO）］和UAB临床与转化科学中心（NIH资助项目UL1TR001417）的支持。

HNE 样本采集自阿拉巴马州儿童医院。本文所述所有操作和方法均已获得阿拉巴马大学伯明翰分校机构审查委员会（UAB IRB #151030001）的批准。为了促进人鼻上皮细胞（HNEs）的扩增并改善其功能，本培养方法借鉴了经典的气液界面（ALI）培养法28,34。HNEs 最初通过刷取活检获取，方法如先前所述12,14，唯一区别在于使用了细胞学刷。所有样本处理步骤和细胞培养均在生物安全柜中进行。
1. 鼻上皮细胞的培养与扩增
<ol>
	<li>刷取后，将鼻腔活检样本置于含有 8 mL RPMI 培养基的 15 mL 锥形管中，冰上保存，并在 4 小时内（不超过 24 小时）转移至实验室。</li>
	<li>将细胞学刷头在含有 8 mL RPMI 培养基的 15 mL 锥形管中进行解离，使用剪去尖端的 1 mL 大孔径移液器吸头反复吹打数次，直至刷头上无可见组织残留。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于 3 mL 细胞解离液中（见材料表），室温孵育 16 分钟以进行消化。</li>
	<li>使用 5 mL 扩增培养基（表 1）洗涤细胞两次。然后将细胞接种至预先接种了经辐照且失活的 3T3 成纤维细胞22（50%–60% 汇合度）的 T75 培养瓶中，进行共培养并在扩增培养基中培养 7–14 天（合适的克隆形态参见图 1）。使用前需检测经辐照的 3T3 成纤维细胞，确保其无法增殖，否则会负面影响上皮细胞的扩增。 
	注意：若鼻腔上皮细胞在 14 天内汇合度未达到 70%，则弃去该细胞样本。</li>
	<li>对于来自囊性纤维化（CF）患者的细胞，在培养最初 3 天，向扩增培养基中加入四种抗生素（100 µg/mL 妥布霉素、2.5 µg/mL 两性霉素 B、100 µg/mL 头孢他啶、100 µg/mL 万古霉素，见材料表）以对细胞进行消毒处理，之后更换为不含抗生素的扩增培养基，并每 2 天更换一次培养基。 
	注意：该短期使用抗生素的策略旨在减少因细菌定植导致的培养失败，同时在停用附加抗生素后促进细胞增殖。如有需要，可根据患者具体的微生物学检测结果及药敏情况调整抗生素种类。</li>
	<li>当细胞汇合度达到约 80% 时，采用双次胰酶消化法22收获人鼻上皮细胞（HNEs）。该方法可确保去除经辐照且失活的 3T3 成纤维细胞，避免其污染后续类器官接种。
	<ol>
		<li>用 1× DPBS 洗涤细胞，随后向 T75 培养瓶中加入 1.5 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，37 °C 孵育 4 分钟，以去除经辐照且失活的 3T3 成纤维细胞。</li>
		<li>用 1× DPBS 冲洗 T75 培养瓶两次，彻底清除残留的 3T3 成纤维细胞；再向瓶中加入 1.5 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，37 °C 孵育 10 分钟，以解离人鼻上皮细胞（HNEs）。</li>
		<li>按 1:1 比例加入大豆胰蛋白酶抑制剂中和胰酶活性（见材料表）。在 500 × g 离心 5 分钟后弃上清，用 5 mL 扩增培养基洗涤细胞一次，细胞即可用于类器官接种。 
		&#8203;注意：建议使用传代次数为三次的 HNEs 进行后续实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 载玻片和培养插件中类器官的生长与分化
<ol>
	<li>将类器官培养用细胞外基质（ECM）在4 °C条件下过夜解冻。将移液器吸头冷却至4 °C，并准备15孔血管生成载玻片（参见 材料表4 °C 下过夜 
	注意：在需要收获细胞的前一晚，应将ECM置于4 °C。</li>
	<li>在冰上用5 µL预冷的100% ECM包被载玻片（用预冷的移液枪头将5 µL预冷的100% ECM加入15孔载玻片的每个孔中），然后置于37 °C细胞培养孵箱中至少30分钟以完成凝固。</li>
	<li>使用血细胞计数板对共培养中收获的HNEs进行计数，并用分化培养基稀释20% ECM，将细胞浓度调整至500个细胞/µL表 2置于冰上。然后，将5 µL冰冷的细胞/ECM混合物接种到每个已包被ECM的载玻片孔中。</li>
	<li>立即把载玻片转移至37 °C培养箱中孵育1小时，以固化细胞/ECM混合物。</li>
	<li>向15孔血管生成载玻片的每个孔中加入50 µL分化培养基以喂养细胞。每隔一天更换一次培养基，直至类器官准备好进行后续实验。 
	注意：类器官通常在1-2天后即可观察到。每孔玻片中通常可形成20-90个类器官。当置于37 °C的湿润培养箱中并每隔一天换液时，类器官通常可在细胞外基质（ECM）中存活40-60天。</li>
	<li>在培养插件中培养类器官（参见 材料表）以获得更大量的组织，用于特定应用（如组织学或免疫荧光切片），具体步骤如下所述。
	<ol>
		<li>在培养插件中培养类器官时，按步骤 2.1–2.2 所述准备类器官培养用细胞外基质（ECM）、移液器吸头和插件。用 100 µL 冷的 100% ECM 对插件进行包被。</li>
		<li>在插入物的ECM包被层上接种60 µL细胞/ECM混合液（分化培养基中含500个细胞/µL，20% ECM）。 
		注意：在插入物中进行类器官培养的其余所有步骤均与载玻片中的操作相同，即步骤 2.4–2.5。</li>
		<li>向插入物的底部加入 600 µL 分化培养基。每隔一天更换一次培养基，直至类器官用于实验，通常为 2–3 周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 类器官的制备与分离用于整体免疫荧光染色
<ol>
	<li>类器官的分离与固定
	<ol>
		<li>按照参考文献35的方法，使用细胞黏附剂（见材料表）对8孔玻璃底培养板进行30分钟的预处理。弃去溶液后，将孔室在空气中干燥30分钟。</li>
		<li>收集类器官时，移除ECM上方的培养基，然后在冰上向15孔板的每个孔中加入50 µL预冷的1×PBS（与ECM体积比为1:1）。</li>
		<li>使用200 µL大孔径移液枪头反复吹打3–5次，随后将溶液转移至8孔培养板每个孔的中央位置。</li>
		<li>立即用细尖移液枪头吸除孔内多余液体。然后将培养板置于37 °C培养箱中孵育40分钟，以促进类器官贴附于玻璃底面。</li>
		<li>用1×PBS轻柔洗涤两次后，在室温下每孔加入300 µL 4%多聚甲醛固定30分钟。</li>
		<li>用1×PBS洗涤两次后，将类器官置于1×PBS中，4 °C保存，可用于免疫染色，最长可保存2周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光染色
	<ol>
		<li>为降低自发荧光，将每孔加入250 µL含50 mM NH4Cl的1×PBS溶液，在室温下轻轻振荡（20 rpm）孵育30分钟。</li>
		<li>用1×PBS洗涤两次后，在室温下用0.1% Triton X-100处理细胞30分钟以实现通透，同时保持20 rpm的轻柔振荡。</li>
		<li>用1×PBS洗涤两次后，每孔加入300 µL封闭液（含5% BSA和0.1% Triton X-100的1×PBS），室温孵育1小时。</li>
		<li>洗涤后，向相应孔中加入一抗，随后加入二抗（见材料表）。一抗和二抗溶液使用含2% BSA和0.3% Triton X-100的1×PBS配制。所有一抗在4 °C孵育2天，所有二抗在4 °C孵育1天。 
		NOTE: 最终抗体浓度取决于实验目标蛋白。请查阅厂家产品说明书中的储存浓度，并根据材料表中所用稀释比例计算最终工作浓度。</li>
		<li>孵育结束后，用1×PBS充分洗涤孔板，然后每孔加入含2% BSA和0.3% Triton X-100的DAPI溶液进行细胞核染色。</li>
		<li>使用共聚焦激光扫描显微镜对类器官成像，物镜选择20–60倍油镜（见材料表）。采用Z-stack模式设定图像的上下边界，并使用共聚焦软件推荐的最佳Z步进尺寸。 
		&#8203;NOTE: 使用以下四种共聚焦激光激发波长：408.7 nm、489.1 nm、561.7 nm 和 637.9 nm。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 用于组织学切片的类器官制备与分离
<ol>
	<li>为获取用于组织学研究的类器官，移除培养基，并在冰上向每孔载玻片中加入 50 µL 冷的 1x PBS。</li>
	<li>使用 200 µL 大孔径枪头吹打 3 至 5 次，将 15 孔板或培养插件中的所有溶液合并至一个置于冰上的 15 mL 锥形管中。通过添加额外的冷 1x PBS，将管中溶液总体积调整至 10 mL。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 5 分钟；吸除上清液，并加入 60 µL 预热的组织凝胶（见材料表），使用 200 µL 大孔径枪头与类器官沉淀充分混匀。</li>
	<li>立即将悬液转移至组织学模具中。待组织凝胶在室温下凝固后，将模具块放入 4% 多聚甲醛中，于 4 °C 过夜固定。</li>
	<li>石蜡包埋后，将组织凝胶块切成 5 µm 的横切片（例如使用切片机），将切片贴附于玻璃载片上，并使用苏木精和伊红（H&amp;#38;E）或免疫荧光标记抗体进行染色。使用明场显微镜或倒置落射荧光显微镜成像（见材料表）。</li>
</ol>
5. 活体类器官成像
注意：以下步骤使用自动化成像系统进行（参见材料表）。不同成像系统需根据其特定制造商的说明调整这些步骤。无论使用何种设备，活体类器官成像均需要配备CO2气体控制器的温控且加湿的环境培养室。
<ol>
	<li>在进行功能性肿胀实验之前，为监测类器官的分化情况36，可使用任何明场显微镜或自动化成像系统手动采集全片图像，具体步骤如下。
	<ol>
		<li>打开自动化成像系统和CO2/O2气体控制器的电源，使系统完成自动校准（约30分钟）。</li>
		<li>校准完成后，将成像系统温度设置为37 °C；向加湿储液槽中加入15 mL无菌水，打开CO2阀门，盖上盖子，并让成像系统预孵育至少30分钟后再开始成像。</li>
		<li>打开自动化成像软件以建立成像方案，并选择保存原始实验数据的位置。 
		注意：已提供一个示例方案文件（补充文件1），该文件针对特定成像系统，可作为自动化成像监测类器官分化的模板。</li>
		<li>当环境条件达到设定值后，立即将最多两张带盖的15孔载玻片转移至自动成像系统的载物台插槽内的环境培养室中（见材料表）。</li>
		<li>选择需要成像的孔位并开始成像，完成目标孔位的图像采集。 
		注意：推荐的基本设置如下：使用4倍和10倍空气物镜，明场通道，4倍物镜采用2×2拼接以覆盖整个孔区域，10倍物镜采用4×4拼接。Z轴堆栈设置：3至6层Z轴切片，Z步长=50–100 µm，自动对焦点下方1至2层，上方3至5层。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为在佛司可林诱导肿胀（FIS）实验中对活体类器官进行成像，应使用配备自动化载物台并带有环境控制成像室的显微镜，该成像室可调控温度和CO2浓度。
	<ol>
		<li>从步骤5.1.1至5.1.4开始操作，在步骤5.1.3中将方案文件替换为提供的示例方案文件（补充文件2），该文件包含专用于执行FIS实验的设置参数。</li>
		<li>每次实验前，通过评估每张载玻片至少三个孔（最左侧、中间和最右侧）来调整曝光参数。应用X和Y坐标偏移量，确保所有孔位的物镜均位于孔中心位置。 
		注意：推荐的基本设置如下：4倍空气物镜，通道1=明场，通道2=DAPI，2×2拼接（共四幅图像拼接）。Z轴堆栈设置：3至4层Z轴切片，Z步长=50–100 µm，自动对焦点下方1层，上方2至3层。图像采集时间：8小时，间隔20分钟（总读数=25；第一次读数为T=0）。</li>
		<li>在所有设置正确选定后，选择两张载玻片中需要成像的孔位（或全选），并根据设备说明开始运行实验。</li>
		<li>运行结束后，保存实验数据，关闭成像软件，并关闭成像系统37。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 基线管腔测量
注意：此步骤使用手动图像分析软件完成（参见材料表）。也可采用开源软件38或任何能够测量图像上某一区域面积的软件执行类似方法。
<ol>
	<li>在软件中，通过右键单击屏幕底部，选择测量，然后选择自动测量结果，以打开自动测量面板。每个被测感兴趣区域（ROI）的面积将显示在此处。</li>
	<li>在软件中打开类器官图像，并选择5-10个具有可见管腔的类器官。 
	注意：管腔将表现为类器官中央一个颜色明显不同于类器官其余部分的圆形区域（图2A）。</li>
	<li>使用多边形ROI测量功能，右键单击图像以打开菜单，选择多边形ROI，勾勒出整个类器官轮廓以获得类器官的总表面积（TSA）。然后使用相同功能，勾勒出管腔面积（LA）（图2B）。</li>
	<li>对孔板中其余类器官以及实验中所有孔板重复上述步骤。</li>
	<li>将数据导出至Excel。用LA除以TSA，并对样本中所有类器官的结果取平均值，以获得基线管腔比率（BLR）11,13。 
	&#8203;注意：通常，约87%的非囊性纤维化（non-CF）类器官BLR超过0.6，97%超过0.5；而仅有14%的囊性纤维化（CF）类器官BLR超过0.6，31%超过0.5。</li>
</ol>
7. HNE 类器官的预处理与自动化成像
注意：所有预处理步骤均在洁净的生物安全柜中进行。在步骤7.1之前，预先设置好自动成像系统及用于记录检测数据的软件。DAPI染色孵育步骤为可选，但若明场图像质量不佳时，建议进行此步骤作为备用方案。在此情况下，可改用DAPI通道（377 nm）进行分析。
<ol>
	<li>将类器官置于15孔载玻片的孔中，加入50 µL含DAPI的分化培养基，可选择性添加100 µM CFTRinh-172（参见材料表），在37 °C培养箱中预孵育1小时。在类器官孵育期间，按照补充文件2中的自定义方案执行步骤5.2.1的肿胀实验。</li>
	<li>使用玻璃巴斯德吸管吸取并移除预孵育培养基。每孔加入10 µM佛司可林和100 µM IBMX（刺激混合物）（参见材料表），用分化培养基补足至总体积50 µL。 
	注意：确保不要在孔中引入气泡。图像中的气泡会影响自动分析结果。</li>
	<li>立即开始FIS成像方案，按步骤5.2.2至5.2.4进行操作。每20分钟采集每个孔的图像一次，总运行时间为8小时。</li>
</ol>
8. HNE 类器官中佛司可林诱导肿胀实验的自动化分析
<ol>
	<li>打开自动成像分析软件，找到之前在步骤 7.3 中保存的实验，并调出该实验的图像。</li>
	<li>选择待评估的孔位窗口，并选择包含已拼接和Z轴投影处理后图像的选项。此步骤应提供整个孔的完整图像，使所有类器官均位于成像视野内，以便进行掩膜评估和测量。</li>
	<li>选择要评估的孔图像，点击“分析”（Analyze）。对其他图像重复此过程，以确保所有纳入自动测量的图像均具有合适的掩膜效果。保存设置参数。</li>
	<li>完成分析设置后，应用更改。软件将根据所设参数更新测量结果。 
	注意：初始图像预处理完成后，应执行质量控制（QC）措施，以确保掩膜的一致性。这些措施包括手动检查所有孔，确认类器官位于成像视野内，气泡或碎片未被错误掩膜，并在明场和 DAPI 通道中核查掩膜效果。</li>
	<li>导出数据以进行汇总分析（包括作图和统计分析）。</li>
</ol>

<ol><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), (2018).</li>
<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492(2018).</li>
<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+CFTR+function+and+modulation+in+primary+human+nasal+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).</li>
<li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+and+control+nasal+epithelial+cells+harvested+by+a+brushing+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).</li>
<li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+nasal+epithelial+multicellular+spheroids%3A+polar+cyst-like+model+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues.</a> Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).</li>
<li>Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+sweat+gland+epithelial+cells+from+normal+individuals+and+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).</li>
<li>Conger, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+and+ciliary+beat+frequency+activation+by+the+CFTR+Modulators+Genistein%2C+VRT-532%2C+and+UCCF-152+in+primary+sinonasal+epithelial+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Otolaryngology-Head+%26+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures.</a> JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).</li>
<li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li>
<li>Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+normal+and+cystic+fibrosis+epithelial+cells+grown+under+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).</li>
<li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).</li>
<li>Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+function+and+clinical+response+to+modulators+parallel+nasal+epithelial+organoid+swelling%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).</li>
<li>Guimbellot, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasospheroids+permit+measurements+of+CFTR-dependent+fluid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+nasal+epithelial+organoids+for+therapeutic+development+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis.</a> Genes (Basel). 11 (6), (2020).</li>
<li>Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).</li>
<li>Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+opportunities+for+CFTR-targeting+drug+development+using+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids.</a> Rare Diseases. 1, 27112(2013).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li>
<li>Okiyoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism-based+corrector+combination+restores+DeltaF508-CFTR+folding+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function.</a> Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).</li>
<li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR%2FCas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li>
<li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li>
<li>Bove, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+in+vitro+alveolar+type+II+cell+proliferation+barrier+while+retaining+ion+transport+properties%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).</li>
<li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor%28s%29+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li>
<li>Scudieri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionocytes+and+CFTR+chloride+channel+expression+in+normal+and+cystic+fibrosis+nasal+and+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li>
<li>Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+three-dimensional+explant+spheroids+derived+from+human+nasal+airway+epithelium%3A+a+simple+methodological+approach+for+ex+vivo+studies+of+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia.</a> Cilia. 6, 3(2017).</li>
<li>Blouquit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+and+fluid+transport+properties+of+small+airways+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).</li>
<li>Birket, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+with+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+modulators+augment+the+airway+functional+microanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).</li>
<li>Birket, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+anatomic+defect+of+the+cystic+fibrosis+airway%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).</li>
<li>Chu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-tracking+microrheology+using+micro-optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography.</a> Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).</li>
<li>Chu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vivo+imaging+of+airway+cilia+and+mucus+clearance+with+micro-optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography.</a> Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+quantitative+study+of+airway+functional+microanatomy+using+micro-optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography.</a> PLoS One. 8 (1), 54473(2013).</li>
<li>Tuggle, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+defects+in+ion+transport+and+tissue+development+in+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29-knockout+rats%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats.</a> PLoS One. 9 (3), 91253(2014).</li>
<li>McCravy, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalised+medicine+for+non-classic+cystic+fibrosis+resulting+from+rare+CFTR+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations.</a> European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062(2020).</li>
<li>Mutyam, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+benefit+observed+with+the+CFTR+potentiator%2C+ivacaftor%2C+in+a+CF+patient+homozygous+for+the+W1282X+CFTR+nonsense+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).</li>
<li>Corning Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CORNING+CELL-TAK+CELL+AND+TISSUE+ADHESIVE%22">CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE</a>. , Discovery Labware, Inc. Bedford, MA. (2013).</li>
<li>Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+function+and+clinical+response+to+modulators+parallel+nasal+epithelial+organoid+swelling%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling.</a> The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).</li>
<li>Biotek Instruments, Incorporated. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Lionheart+FX+Live+Cell+Imager+Operator%27s+Manual%22">Lionheart FX Live Cell Imager Operator's Manual</a>. , (2016).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Simmonds, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+cystic+fibrosis%3F+The+challenges+of+diagnosing+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Paediatric+Respiratory+Reviews%22%5BJournal%5D)">Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis.</a> Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).</li>
<li>McGarry, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+ivacaftor+response+in+cystic+fibrosis+patients+with+residual+CFTR+function%3A+N-of-1+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Pulmonology%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies.</a> Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).</li>
<li>Garratt, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+culture+success+in+an+airway+epithelium+sampling+program+of+young+children+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Lung+Research%22%5BJournal%5D)">Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis.</a> Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).</li>
</ol>

JSG 是北卡罗来纳大学一项专利申请 20170242033 的发明人之一，该专利申请描述了一种类似模型。当来自北卡罗来纳大学的授权技术产生 royalties 时，发明人将获得部分收入。除此之外，作者声明不存在利益冲突。资助方在研究设计、数据收集、分析或解释、论文撰写，以及决定发表结果等方面均未发挥任何作用。

本论文提供了对源自人鼻上皮（HNE）刷检样本的气道上皮类器官进行活体和固定成像的详细方法。文中描述了可用于测定个体CFTR活性的功能性检测方法。HNE是一种微创获取的原代组织，适用于多种研究用途。本文所提供的扩增技术可用于气道疾病建模，包括类器官模型。类器官可用于精准治疗策略，监测基因或mRNA疗法随时间推移的稳定性，助力精准临床试验设计，并有助于解决诊断不明确的情况39。目前的研究聚焦于囊性纤维化（CF），但这些模型亦可应用于其他影响上皮功能的疾病。
活检后人鼻上皮细胞（HNE）的初始扩增至关重要。已有观察表明，细胞刷取法获得的初始细胞数量更多，效果优于其他活检工具14。根据以往经验，我们将双侧鼻腔刷取样本合并至同一管中，并在4小时内完成处理，可获得最佳结果。其他研究者也曾成功采用更长时间间隔的活检与处理方案3。高质量的初始活检样本采集对于后续类器官的扩增和接种至关重要。共培养所需的高质量经照射和灭活的成纤维细胞需在实验室内部自行培养和处...

技术简介 
基于ex vivo（离体）培养的检测方法正日益成为精准医学和疾病病理生理学研究中的重要工具。原代人鼻上皮（HNE）细胞培养已被广泛应用于囊性纤维化研究中1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13，囊性纤维化是一种常染色体隐性遗传病，会影响多个器官中的上皮细胞功能。HNE细胞培养可提供一种可再生的气道上皮来源，能够前瞻性地获取，并重现用于检测囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）活性的电生理和生化特性。HNE细胞的采集副作用极小14，类似于常见的病毒性呼吸道拭子采样。近期已有研究报道了基于HNE刷取活检建立的囊性纤维化研究模型11,13。尽管该模型与其他使用原代HNE细胞2,3或肠道组织15,16,17,18,19的模型相似，本文将详细描述该模型的分化过程及成像特征，以供囊性纤维化研究及其他气道疾病研究参考13。该类类器官模型虽不像永生化细胞系那样可无限增殖，但可通过条件性重编程技术（使用经辐照灭活的饲养层成纤维细胞和Rho激酶抑制剂）使其向更接近干细胞的状态扩增20,21,22,23。采用该方法处理HNE刷取活检样本，可获得大量上皮细胞，适用于多种高通量应用，同时仍保留完全分化的能力。尽管本实验方案采用饲养层细胞进行开发，但希望避免使用饲养层细胞技术的研究人员也可采用其他方法14,24。
该技术对肺部生物学的重要性 
已有大量研究致力于阐明上皮细胞膜中缺乏正常功能的CFTR蛋白如何导致肺、胰腺、肝脏、肠道或其他组织的功能障碍。上皮细胞离子转运功能异常，特别是氯离子和碳酸氢根离子的转运障碍，会导致上皮衬液量减少以及黏液分泌改变，从而引起黏液淤积和阻塞。在其他气道疾病中，例如原发性纤毛运动障碍，纤毛运动异常会损害黏液纤毛清除功能，同样导致黏液淤积和阻塞25。因此，目前的人鼻上皮（HNE）类器官模型已根据研究者实验设计和资源条件被开发用于多种应用。这些应用包括使用活细胞染料进行活细胞成像；固定和切片以表征形态结构；利用抗体进行免疫荧光染色并结合整体封片共聚焦成像，以避免破坏管腔内结构；以及采用明场成像和微光学相干断层扫描技术对纤毛搏动频率和黏液纤毛转运进行定量测量13。为了便于推广至其他研究者，培养过程中采用了 commercially available（商品化）的试剂和耗材。同时建立了一种功能检测方法，结合了常规显微镜技术和更专业的设备。总体而言，尽管该模型最初设计用于评估基础状态下或药物干预后CFTR的功能活性，但本方案中描述的技术也可应用于其他涉及上皮细胞功能的疾病研究，尤其是上皮细胞液体转运相关的疾病。
与其他方法学的比较 
最近，通过将这种类器官模型与其他数据进行关联，其应用价值得到了进一步拓展。 体外 患者类器官对CFTR调节剂的反应与其临床反应的相关性11值得注意的是，在相同患者中，本模型的结果与评估CFTR功能的当前金标准——短路电流反应——呈平行关系。短路电流与肿胀实验不同，前者测量的是CFTR功能 通过 离子转运26相比之下，该检测方法通过测量液体运输这一更下游的效应，提供了关于CFTR整体功能的额外信息27,28,29,30,31,32短路电流测量一直是测定CFTR氯离子通道活性的常用且可靠方法1,33这些电生理检测需要专用且昂贵的设备，每次实验重复所需的细胞数量远多于类器官检测，难以实现自动化，也不适合扩展用于高通量应用。另一种源自肠上皮的类器官模型则具有额外的优势15,16,17,18，例如具有更强的复制能力，但并非来源于气道组织，也不易普遍获取。HNE刷取样本可通过廉价的细胞学刷子获取，无需镇静，风险极低。刷取操作无需临床医生参与，经培训的研究协调员及其他科研人员即可完成14人鼻上皮类器官模型可由具备原代细胞培养能力的实验室进行培养，部分应用可通过标准显微镜技术完成。上述优势共同为一些实验室提供了原本可能无法获得的气道上皮功能评估技术。此外，人鼻上皮类器官还可用于研究其他影响气道的疾病状态，例如原发性纤毛运动障碍。25 或病毒感染，而肠道类器官无法做到这一点。

<table><tbody><tr><td>鼻刷</td><td>Medical Packaging CYB1</td><td>CYB-1</td><td>长度：8 英寸，宽度约 7 mm</td></tr><tr><td>大孔移液器吸头</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-707-141</td><td>大口径移液吸头</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1110501</td><td>细胞解离溶液</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>大豆胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td>工作液：1 mg/mL 溶于 1×DPBS</td></tr><tr><td>Matrigel 基质</td><td>Corning</td><td>356255</td><td>细胞外基质（EM）</td></tr><tr><td>&amp;micro;-Slide 血管生成实验板</td><td>Ibidi</td><td>81506</td><td>15 孔载玻片</td></tr><tr><td>24 孔 Transwell 小室</td><td>Corning</td><td>7200154</td><td>培养插件</td></tr><tr><td>腔室盖玻片</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>155409</td><td>8 孔玻璃底腔室载片</td></tr><tr><td>Cell-Tak 细胞与组织粘附剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>354240</td><td>细胞粘附剂</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50980487</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37605</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Eclipse Ts2-FL（倒置常规显微镜）</td><td>Nikon</td><td></td><td>倒置落射荧光显微镜或明场显微镜</td></tr><tr><td>Nikon A1R-HD25</td><td>Nikon</td><td></td><td>共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>NIS Elements-基础研究版</td><td>Nikon</td><td></td><td>手动图像分析软件</td></tr><tr><td>Histogel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>一次性基模</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41-740</td><td></td></tr><tr><td>Lionheart FX</td><td>BioTek</td><td>BTLFX</td><td>自动成像系统</td></tr><tr><td>Lionheart 盖板</td><td>BioTek</td><td>BT1450009</td><td>环境控制盖</td></tr><tr><td>湿度培养室</td><td>BioTek</td><td>BT1450006</td><td>载物台插件（环境培养室）</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气体控制器</td><td>BioTek</td><td>BT1210013</td><td>气体控制器</td></tr><tr><td>微孔板/载玻片载物台插件</td><td>BioTek</td><td>BT1450527</td><td>载玻片支架</td></tr><tr><td>Gen5 成像 Prime 软件</td><td>BioTek</td><td>BTGEN5IPRIM</td><td>自动成像分析软件</td></tr><tr><td>4× 相差物镜</td><td>BioTek</td><td>BT1320515</td><td></td></tr><tr><td>10× 相差物镜</td><td>BioTek</td><td>BT1320516</td><td></td></tr><tr><td>LED 滤光立方体</td><td>BioTek</td><td>BT1225007</td><td></td></tr><tr><td>滤光立方体（DAPI）</td><td>BioTek</td><td>BT1225100</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>CFTRinh-172</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S7139</td><td></td></tr><tr><td>佛司可林</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;扩增培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>F12 营养混合物</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11765</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;16140-071</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>霍乱毒素</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;C8052</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子（EGF）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;PHG0314</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松（HC）</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;H0888</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;I9278</td><td></td></tr><tr><td>腺嘌呤</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;A2786</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Stemgent</td><td>&amp;nbsp;04-0012-02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗生素培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>头孢他啶</td><td>Alfa Aesar</td><td>&amp;nbsp;J66460-03</td><td></td></tr><tr><td>妥布霉素</td><td>Alfa Aesar</td><td>&amp;nbsp;J67340</td><td></td></tr><tr><td>万古霉素</td><td>Alfa Aesar</td><td>&amp;nbsp;J67251</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;A2942</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;分化培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12（1:1）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;11330-32</td><td></td></tr><tr><td>Ultroser-G</td><td>Pall</td><td>&amp;nbsp;15950-017</td><td></td></tr><tr><td>胎牛克隆 II</td><td>Hyclone</td><td>&amp;nbsp;SH30066.03</td><td></td></tr><tr><td>牛脑提取物</td><td>Lonza</td><td>&amp;nbsp;CC-4098</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;I-9278</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;H-0888</td><td></td></tr><tr><td>三碘甲腺原氨酸</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;T-6397</td><td></td></tr><tr><td>转铁蛋白</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;T-0665</td><td></td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;E-0135</td><td></td></tr><tr><td>肾上腺素</td><td>Sigma</td><td>E-4250</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-磷酸乙醇胺</td><td>Sigma</td><td>P-0503</td><td></td></tr><tr><td>维甲酸</td><td>Sigma</td><td>R-2625</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;一抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>人 CFTR 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1660</td><td>稀释比例：100 倍</td></tr><tr><td>ZO-1 抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA3-39100-A647</td><td>稀释比例：1000 倍</td></tr><tr><td>抗 MUC5B 抗体</td><td>Sigma</td><td>HPA008246</td><td>稀释比例：100 倍</td></tr><tr><td>抗乙酰化微管蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td>T7451</td><td>稀释比例：100 倍</td></tr><tr><td>抗 β IV 微管蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab11315</td><td>稀释比例：100 倍</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;二抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>驴抗小鼠 IgG（H+L），Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>稀释比例：2000 倍</td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG（H+L），Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A21207</td><td>稀释比例：2000 倍</td></tr></tbody></table>

人鼻上皮类器官的培养与成像

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

为囊性纤维化（CF）患者实现个体化治疗可通过以下方式达成 体外 疾病模型，用于理解囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）的基础活性以及小分子化合物对CFTR功能的恢复作用。本研究团队近期致力于建立一种直接来源于原代人鼻上皮细胞（HNE）的高度分化类器官模型。对类器官进行切片组织学分析、整体免疫荧光染色及成像（使用共聚焦显微镜、免疫荧光显微镜和明场显微镜）是表征类器官并确认上皮细胞分化的关键步骤，为后续功能检测做好准备。此外，HNE类器官可形成大小不一的管腔，其管腔大小与CFTR活性相关，从而可区分囊性纤维化（CF）与非囊性纤维化（non-CF）类器官。本文详细描述了HNE类器官的培养方法，重点介绍利用上述成像技术评估分化状态的流程，包括基础管腔面积的测量（一种任何配备显微镜的实验室均可采用的CFTR活性检测方法），以及我们开发的自动化功能检测方法（该方法需要更专业的设备）。

HNE细胞的扩增对于成功的类器官培养至关重要。一次成功的样本采集所获得的HNE细胞，应在约10天内扩增至超过70%的融合度。成功与不成功样本的示例如下所示： 图1A 和 图1B分别地。若细胞与经辐照的3T3细胞共培养14天后仍无法达到70%汇合度，则必须弃用。若细胞发生污染且无法通过快速添加额外抗菌剂挽救，则应立即弃用。
在15孔载玻片和培养插件中比较了类器官的生长情况。与光学优化的载玻片相比，培养插件更厚，且距离物镜更远，这会影响成像效果和分辨率。尽管如此，如图2所示，这两种培养方法在形态学上未观察到显著差异。非囊性纤维化（非CF）与囊性纤维化（CF）类器官之间的形态学差异可见，如图3A所示。非CF类器官通常具有较大的管腔，且管腔内含有较多液体；相比之下，CF类器官的管腔通常较小，液体较少，有时充满黏液和碎片。...

本文提供了一项详细的实验方案，用于描述一种 体外 来自人鼻上皮细胞的类器官模型。该方案提供了使用常规实验室设备进行测量的选项，同时也可结合特殊设备和软件进行更深入的分析。

为囊性纤维化（CF）患者实现个体化治疗可通过体外疾病模型来理解囊性纤维化基础状态……

通过体外疾病模型了解患者基础状态下的CFTR活性，可实现囊性纤维化患者的个体化治疗。人鼻上皮类器官（HNE类器官）可形成大小不同的管腔，其尺寸与CFTR活性相关，从而区分囊性纤维化与非囊性纤维化类器官。本文详细描述了HNE类器官的培养与成像方法。上皮细胞离子转运功能障碍，特别是氯离子和碳酸氢根离子的转运异常，会导致上皮衬液量减少。这还会影响黏液分泌，导致黏液滞留和阻塞。因此，我们的原代人鼻上皮（HNE）模型已根据研究者实验设计和资源条件的不同，开发用于多种应用。除了用于评估基础状态或治疗干预下CFTR的活性外，该技术还可应用于其他涉及上皮细胞功能的疾病，尤其是上皮细胞液体转运相关的疾病。这些方法最初主要是为囊性纤维化研究而开发的。其他针对气道上皮的研究，例如原发性纤毛运动障碍，也可能从中获益。这些技术需要注重细节和精确性，同时也需要仔细观察，以确保细胞的初始扩增状态合适。每天监测所有培养物，将更有可能获得成功。首先，将鼻腔刷检样本放入15毫升锥形管中，加入8毫升RPMI培养基，通过1毫升大孔径移液枪头反复吹打细胞刷数次，以充分解离样本。随后，在4摄氏度条件下，以500 × g离心5分钟。弃去上清液，再将细胞沉淀重悬于3毫升细胞解离溶液中。在室温下孵育16分钟以进行消化。用5毫升扩增培养基将细胞洗涤两次。然后将其加入预先接种了经照射灭活且融合度为50%至60%的3T3成纤维细胞的T75培养瓶中。将细胞在扩增培养基中共同培养并扩增7至14天。若因囊性纤维化患者来源的细胞而添加了抗生素，则在初始培养三天后，应将培养基更换为不含抗生素的扩增培养基，并可每两天换液一次，直至细胞融合度达到80%。用1x DPBS洗涤细胞。然后，向T75培养瓶中加入1.5毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA，于37摄氏度孵育4分钟，以去除经照射失活的3T3成纤维细胞。用1×DPBS冲洗T75培养瓶两次，彻底清除残留的3T3成纤维细胞。向T75培养瓶中加入1.5毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA，于37摄氏度孵育10分钟，使HNEs脱落。按1:1比例加入大豆胰蛋白酶抑制剂以中和胰蛋白酶。将细胞在500 × g条件下离心5分钟。然后弃去上清液，并用5 mL扩增培养基洗涤细胞一次。细胞现已准备好用于接种以培养类器官。将类器官培养用细胞外基质（ECM）在4°C条件下过夜解冻。将15孔血管生成载玻片在相同温度下过夜冷却。接下来，将移液器吸头冷却至四摄氏度。在冰上用五微升冷的100% ECM包被载玻片。将其放入37摄氏度的细胞培养孵育箱中，至少孵育30分钟以完成凝固。使用血细胞计数板对共培养收获的HNE细胞进行计数。然后，用预冷的分化培养基将细胞稀释至每微升500个细胞，总体积中含20% ECM，并置于冰上。从培养箱中取出经ECM包被的载玻片，向每个孔中加入5微升冰冷的细胞-ECM混合液。立即将载玻片转移

culture-and-imaging-of-human-nasal-epithelial-organoids

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

人鼻上皮类器官的培养和成像

通过人体志愿者浅表刮取活检获得的鼻上皮细胞，在组织培养插件中进行扩增和转移。当细胞达到汇合状态后，于气液界面培养，从而获得纤毛细胞和非纤毛细胞的培养物。分化的鼻上皮细胞培养物为研究呼吸道黏膜提供了可行的实验模型。...

人鼻上皮细胞在气液界面的培养

本出版物展示了从儿童鼻腔上皮黏膜成功采样和培养的方法，并将这些细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）。...

从儿童鼻腔上皮细胞中进行原代培养并重编程为诱导性多能干细胞

我们描述了一种简单的方法，用于从非洲爪蟾（Xenopus...

利用非洲爪蟾胚胎细胞生成黏液纤毛上皮类器官：培养、传代与高分辨率活体成像

本方案描述了鼻上皮细胞的采集、扩增和分化为类器官型气道上皮细胞模型的过程，并通过活细胞成像和自定义脚本对纤毛摆动频率进行定量分析。...

原代人类鼻上皮细胞模型的采集、扩增与分化及其用于纤毛搏动频率的定量分析

本方案介绍了一种从原代肺组织中获取人肺类器官、扩增肺类器官并诱导其向近端分化，从而生成能够真实模拟人类气道上皮的三维和二维气道类器官的方法。...

建立人类肺类器官及近端分化以生成成熟气道类器官

本文介绍了一种新型培养基底的制备方案，该基底每平方毫米含有数百个微容器2，其中可培养类器官并利用高分辨率显微镜进行观察。还详细描述了细胞接种和免疫染色方案。...

一种用于类器官培养与三维成像的高通量平台

本方案介绍了一种通过差速离心法从原代正常及肿瘤乳腺组织中生成上皮类器官的方法。此外，还包括对包埋类器官进行三维培养以及免疫荧光成像的操作说明。...

无需传代培养的小鼠与人正常及肿瘤乳腺组织上皮类器官的生成与成像

鼻腔上皮是所有呼吸道病原体首先接触的主要屏障部位。本文概述了利用气液界面（ALI）培养的原代鼻腔上皮细胞，以在生理相关系统中表征人类冠状病毒与宿主相互作用的方法。...

在气液界面培养的原代鼻上皮细胞感染模型中表征人冠状病毒与宿主相互作用

在此，我们展示了在基于纳米纤维膜的双层系统中与成纤维细胞共培养的上皮细胞能够稳定地黏附于膜上并生长。...

利用纳米纤维膜建立上皮细胞三维共培养模块

本文描述了一种从人胎儿胰腺细胞中分离、培养和成像胰岛细胞簇（ICCs）的实验方案。...

人胎儿胰腺细胞簇的分离、培养与成像

学习人鼻上皮类器官的培养和成像方法，用于囊性纤维化研究。该模型通过管腔大小评估CFTR活性，为个性化治疗提供体外疾病研究工具。

人鼻上皮类器官的培养与成像

探索更多视频