Name: 角膜上皮机械和化学损伤的离体和体内动物模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 学习建立小鼠和兔子的角膜上皮机械与化学损伤离体及体内动物模型，利用荧光染色确认损伤区域。该方法为筛选新疗法和研究角膜损伤机制提供了可靠平台。

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本研究由台湾原子能委员会（资助编号：A-IE-01-03-02-02）、科技部（资助编号：NMRPG3E6202-3）以及长庚医疗研究计划（资助编号：CMRPG3H1281）提供经费支持。

所有动物实验程序均经长庚纪念医院研究伦理委员会批准，并遵循ARVO关于眼科和视觉研究中使用动物的声明。
1. 离体 小鼠角膜上皮伤口愈合模型
<ol>
	<li>小鼠的准备
	<ol>
		<li>通过腹腔注射盐酸氯胺酮（80-100&#160;mg/kg 体重）和赛拉嗪（5-10 mg/kg 体重）对 C57BL/6 小鼠实施全身麻醉。&#160;</li>
		<li>通过确认小鼠对有害刺激无反应及翻正反射消失，确保全身麻醉已生效。</li>
		<li>用手固定小鼠头部，并在双眼表面各滴加一滴 0.5% 盐酸丙帕他卡因滴眼液进行表面麻醉（图 1A）。用 5% 聚维酮碘对眼表及眼睑进行三次消毒。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠角膜上皮损伤模型的建立 
	注意：以下操作应在体视显微镜下进行。角膜损伤在体内（in vivo）而非离体（ex vivo）条件下建立，以便更好地操控眼球并更接近真实情况。该操作为终末性实验，因此仅需使用洁净器械（无需无菌操作）即可。&#160;&#160;
	<ol>
		<li>使用皮肤活检打孔器（直径 2 mm）标记小鼠角膜中央区域，以确保损伤区域边界清晰且易于测量。</li>
		<li>轻压打孔器于角膜中央，留下一个圆形印记（图 1B）。使用手持式角膜锈环去除器（配备 0.5 mm 磨头）刮除角膜上皮至 Bowman 层，注意避免损伤该层（图 1C）。用角膜镊清除伤口边缘内侧残留的松散组织。</li>
		<li>通过荧光素染色确认去上皮区域（图 1D）。进行荧光素染色时，将一滴生理盐水滴于荧光素试纸上以溶解荧光素，随后将含荧光素的液滴滴加至小鼠角膜上皮缺损处，并在钴蓝光下观察显影情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠角膜擦伤损伤模型的离体（ex vivo）培养。
	<ol>
		<li>按以下步骤获取小鼠眼球。</li>
		<li>在诱导室中使用 5% 异氟烷诱导麻醉后，通过颈椎脱臼法处死小鼠。通过确认小鼠对有害刺激无反应及翻正反射消失，确保麻醉已生效。</li>
		<li>用镊子尖端轻压眶上缘和眶下缘，使眼球突出。将闭合的角膜剪尖端沿眶下壁插入球后间隙，注意避免刺破眼球。</li>
		<li>用 0.3 mm 角膜镊固定眼球，然后用角膜剪剪断视神经及眶周软组织，以分离眼球。</li>
		<li>按以下步骤进行小鼠眼球的离体（ex vivo）培养。</li>
		<li>准备一个 48 孔板，在孔内加入熔化的石蜡，待其凝固。用结膜镊在凝固的石蜡表面打一个圆形孔洞，用于固定眼球。</li>
		<li>将获取的眼球直接放置于 48 孔板中（图 1E），底部和侧壁由石蜡覆盖以实现稳定固定（图 1F）。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO2 的湿润环境中，使用含 1% 胎牛血清（FBS）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）培养眼球，根据研究目的决定是否添加抗生素。 
		注意：若该模型用于研究角膜上皮损伤修复过程，则需使用抗生素以预防感染；但若该模型用于评估抗生素或复合制剂的疗效，则无需使用预防性抗生素。</li>
		<li>将培养液浸没眼表，但避免眼球漂浮。</li>
		<li>通过荧光素染色（步骤 1.2.3）并在钴蓝光下使用数码相机拍摄照片，记录伤口愈合过程。 
		&#8203;注意：在前瞻性实验中，对于机械性角膜损伤的小鼠模型，接受角膜擦伤并进一步测试治疗剂疗效的组别视为实验组，而仅接受角膜擦伤但无进一步处理的组别视为阴性对照组。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 体内 兔角膜碱烧伤模型
注意：在此模型中，先诱导碱烧伤损伤，随后对角膜上皮进行机械清创，以产生一个定义明确且均匀的伤口区域，用于后续定量分析。使用前对所有器械进行灭菌。
<ol>
	<li>术前镇痛处理，包括肌肉注射全身性镇痛药和局部滴眼液。
	<ol>
		<li>通过在后肢肌肉注射氯胺酮盐酸盐（35-44 mg/kg 体重）与赛拉嗪（5-10 mg/kg 体重）的混合液，对中国台湾产新西兰白兔实施全身麻醉。</li>
		<li>将兔子安置妥当并用毛巾覆盖后，在右眼滴加一滴0.5%盐酸丙帕卡因滴眼液进行表面麻醉（图2A在体视显微镜下。&#160;用5%聚维酮碘对眼表和眼睑进行三次消毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在角膜上诱导碱烧伤损伤
	<ol>
		<li>将直径为8 mm的圆形滤纸片（使用8 mm打孔器制备）放入培养皿中。用滴管向培养皿中加入0.5 N氢氧化钠（NaOH）溶液，浸湿滤纸片。在将滤纸片放置于兔角膜前，沥干滤纸片上多余的NaOH溶液。 
		警告：0.5 N NaOH 可能对人类组织造成严重腐蚀性损伤。操作时需佩戴手套。若皮肤或眼睛接触 NaOH 液滴，须立即用大量生理盐水冲洗，并寻求医疗救助以减少进一步损伤。</li>
		<li>使用眼睑撑开器打开眼睑，并确认兔瞬膜未妨碍滤纸插入后（图2B），将浸有0.5 N NaOH的圆形滤纸置于角膜中央30秒，然后用镊子移除（图2C).</li>
		<li>去除滤纸后，用10 mL生理盐水冲洗眼表，以清除碱性物质。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成角膜上皮缺损修复
	<ol>
		<li>使用带有0.5 mm钻头的角膜锈环去除器，将混浊区域的角膜上皮刮除至鲍曼膜层图 2D).</li>
		<li>在钴蓝光下用荧光素染色确认清创区域，并使用角膜镊去除残留的角膜上皮图2E).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用睑缘缝合固定伤口状态
	<ol>
		<li>确认瞬膜平滑地覆盖眼球表面及鼻侧角膜上皮缺损处。确保瞬膜无过度折叠或扭曲，以免影响伤口愈合过程及实验结果。</li>
		<li>使用6-0缝线进行暂时性睑缘缝合，可联合或不联合局部用药，以保护眼表并防止兔子抓挠眼部图 2F确保睑缘缝合的缝线距离上下眼睑边缘3-4 mm，打4-5个结，并留较长的线结，以防止兔子挣断缝线。 
		注意：如果实验不涉及抗生素研究，可考虑使用含抗生素的局部用药。</li>
		<li>在此兔模型中，接受碱烧伤及角膜上皮切除的个体被视为对照组。 
		注意：在前瞻性实验中，接受碱烧伤角膜损伤并进一步给予治疗剂的兔子被视为实验组；仅接受碱烧伤处理而无后续治疗的兔子被视为阴性对照组。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后镇痛与疼痛管理
	<ol>
		<li>术后7天内通过监测动物的疼痛和痛苦情况评估其生理状况及美国农业部（USDA）疼痛等级。根据评估结果，考虑使用妥布霉素软膏以及一滴0.5%盐酸丙帕卡因滴眼液。每6至8小时给予一次盐酸丁丙诺啡（0.03 mg/kg）。&#160;3天。 
		注意：术后每日对缺损区域进行测量和观察的操作属于美国农业部（USDA）D类。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sridhar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+cornea+and+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Anatomy of cornea and ocular surface.</a> Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).</li>
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<li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mesenchymal+stem+cells+on+cornea+wound+healing+induced+by+alkali+burn%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Role of mesenchymal stem cells on cornea wound healing induced by alkali burn.</a> PLoS One. 7 (2), 30842(2012).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

角膜损伤的小鼠和兔模型为监测伤口愈合、测试新疗法以及研究伤口愈合和治疗通路的潜在机制提供了有用的离体（ex vivo）和在体（in vivo）平台。根据研究目的的不同，可选择使用不同的动物模型进行短期或长期实验。例如，在小鼠角膜上在体（in vivo）制造上皮缺损后，可利用局限性上皮缺损来监测小体积的液态治疗剂。同时，与细胞培养或离体（ex vivo）培养条件不同，在体（in vivo）条件下还可评估眼睑、泪器系统和结膜等周围功能单位。在这种情况下，如果小鼠的活动可能影响实验条件，仍可能需要进行睑缘缝合术。与简单的线性划痕伤口相比，环形伤口更易于观察和量化4。然而，使用皮肤打孔法在角膜上创建边界线时应谨慎操作，避免切穿鲍曼层，否则将导致深层角膜损伤或穿透性伤口。在兔模型中，也可使用8 mm角膜环钻和手术刀片制造机械性角膜伤口15，该方法可产生深达前基质层而非仅限于角膜上皮层的伤口。
角膜锈环清除是另...

人角膜由五层主要结构组成，在眼球屈光中起关键作用，以维持视觉敏锐度和结构完整性，从而保护眼内组织1。角膜最外层为角膜上皮，由五到六层细胞构成，这些细胞从基底细胞逐级分化，并向上移动，最终从眼表脱落1。与人类和新西兰兔的角膜相比，小鼠角膜具有相似的角膜结构，但由于上皮层和基质层较薄，其周边部比中央部更薄2。由于其在眼球光学系统中的特殊位置，许多外界损伤因素，如机械性损伤、细菌接种和化学试剂，可能轻易破坏上皮完整性，进而导致威胁视力的上皮缺损、感染性角膜炎、角膜溶解，甚至角膜穿孔。
尽管已有多种治疗剂被用于促进再上皮化并减少瘢痕形成，例如润滑剂、抗生素、抗炎药物、自体血清制品以及羊膜，但其他潜在的治疗手段仍在不断开发和测试中，这些手段旨在促进伤口愈合、减轻炎症反应并抑制瘢痕形成。目前已提出多种用于角膜上皮伤口愈合研究的动物模型，包括使用角膜锈环去除器在糖尿病小鼠中去除角膜上皮3，用无菌25 G针头在小鼠角膜上皮表面制造线性划痕以进行细菌接种4，借助环钻辅助并使用角膜锈环去除器去除角膜上皮5，对半侧角膜及角膜缘实施上皮烧灼6，利用钝化手术刀片通过环钻辅助在兔角膜上制造擦伤7，以及通过液氮瞬时冷冻造成牛角膜损伤8。
除了角膜上皮的机械性损伤外，化学物质也是眼表常见的损伤因素，尤其是酸性和碱性物质。氢氧化钠（NaOH，0.1–1 N，作用30–60秒）是小鼠和兔角膜化学烧伤模型中常用的化学试剂之一。9,10,11,12,13在大鼠化学烧伤模型中，也曾将100%乙醇应用于角膜，随后使用手术刀进行额外的机械刮除14由于健康眼表的维持依赖于包括眼睑、睑板腺、泪液系统、结膜和角膜在内的功能单位， 体内 动物模型相较于其他研究方法具有一些优势 离体 培养的角膜上皮细胞或角膜组织。本文展示了角膜擦伤创面的小鼠模型以及角膜碱烧伤的兔模型。

<table><tbody><tr><td>6/0 Ethicon vicryl 缝线</td><td>Ethicon</td><td>6/0VICRYL</td><td>睑缘缝合术</td></tr><tr><td>Barraquer 眼睑撑开器</td><td>katena</td><td>K1-5355</td><td>15 mm</td></tr><tr><td>Barraquer 持针器</td><td>Katena</td><td>K6-3310</td><td>无锁扣</td></tr><tr><td>Barron 真空环钻 8.0 mm</td><td>katena</td><td>K20-2108</td><td>用于切割滤纸</td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>国家实验动物中心</td><td>RMRC11005</td><td>小鼠品系</td></tr><tr><td>Castroviejo 镊子 0.12 mm</td><td>katena</td><td>K5-2500</td><td></td></tr><tr><td>角膜锈环去除器，带 0.5 mm 磨头</td><td>Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX</td><td>CHI-675</td><td>用于角膜上皮清创</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Toyo Roshi Kaisha,Ltd.</td><td>1.11</td><td></td></tr><tr><td>荧光素钠眼科试纸 U.S.P</td><td>OPTITECH</td><td>OPTFL100</td><td>用于角膜上皮缺损染色</td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61763-23-3</td><td>腹腔或肌肉麻醉剂</td></tr><tr><td>新西兰白兔</td><td>中国台湾行政院农业委员会畜产试验所</td><td></td><td>兔模型</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>TAIWAN BIOTECH CO., LTD.</td><td>100-120-1101</td><td></td></tr><tr><td>丙帕卡因</td><td>Alcon</td><td>ALC2UD09</td><td>局部麻醉剂</td></tr><tr><td>2 mm 皮肤活检穿孔器</td><td>STIEFEL</td><td>22650</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-73-2</td><td>碱烧伤用化学试剂</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA</td><td>SV11</td><td>手术用显微镜</td></tr><tr><td>Westcott 肌腱剪 中号</td><td>katena</td><td>K4-3004</td><td></td></tr><tr><td>盐酸赛拉嗪 23.32 mg/10 mL</td><td>Elanco animal health Korea Co., LTD.</td><td>047-956</td><td>腹腔或肌肉麻醉剂</td></tr></tbody></table>

ex vivo 和 in vivo 角膜上皮机械性与化学性损伤动物模型

Ex Vivo and In Vivo Animal Models for Mechanical and Chemical Injuries of Corneal Epithelium

眼表角膜损伤，包括化学烧伤和外伤，可能导致严重的瘢痕形成、睑球粘连、角膜缘干细胞缺乏，并引发大而持久的角膜上皮缺损。上皮缺损继发角膜混浊及周边新生血管化，将导致不可逆的视力损害，并妨碍后续治疗，尤其是角膜移植术。由于动物模型可作为有效的药物研发平台，本文建立了小鼠角膜损伤模型及兔角膜上皮碱烧伤模型。碱烧伤模型采用新西兰白兔，在肌内及局部麻醉下，将不同浓度的氢氧化钠溶液作用于角膜中央圆形区域30秒。经大量等渗生理盐水冲洗后，用角膜旋转锉深入至鲍曼层，去除该圆形区域内残留的松脱角膜上皮。在钴蓝光下通过荧光素染色记录伤口愈合情况。创伤性小鼠角膜上皮损伤模型采用C57BL/6小鼠，使用直径2 mm的皮肤打孔器标记小鼠角膜中央区域，随后在体视显微镜下用角膜锈环刮除器配合0.5 mm旋转锉进行清创。这些模型可前瞻性地用于验证滴眼液或混合制剂（如干细胞）等治疗手段对促进角膜上皮再生的疗效。通过体视显微镜结合成像软件观察角膜混浊程度、周边新生血管化及结膜充血情况，可对这些动物模型中的治疗效果进行监测。

离体 小鼠角膜上皮伤口愈合模型 
之后 体内 使用手持式角膜锈环去除器对小鼠角膜上皮进行清创后，可在中央2 mm区域观察到轻度凹陷的角膜中央区域，并呈荧光素钠染色阳性（图3A-B）。摘取小鼠眼球后，可轻松固定于经石蜡包被的48孔培养板上，无明显旋转。按照方案， 离体 在48孔培养板中，可在体视显微镜下每日观察并记录小鼠眼球的培养情况图3C）。小鼠角膜上皮清创术后一天，在钴蓝光下拍摄的数字照片中可见一个圆形荧光素染色的上皮缺损，直径为2 mm图3D）。初始染色不规则的伤口边缘或荧光素染色阴性表示角膜上皮去除不完全或失败。在正常的伤口愈合过程中，角膜上皮缺损将在2-3天内随着荧光素染色面积减小而愈合。
<st...

本文建立了基于小鼠和兔的动物模型，用于角膜上皮机械性和化学性损伤的研究，以筛选新的治疗方法及其潜在机制。

Ex Vivo 和 In Vivo 角膜上皮机械性与化学性损伤动物模型

眼表角膜损伤，包括化学烧伤和外伤，可能导致严重瘢痕、睑球粘连、角膜缘干细胞缺乏……

建立了离体和在体动物模型，用于研究角膜的机械性和化学性损伤。该技术为研究人员提供了一个易于构建的平台，用于研究角膜的机械性和化学性损伤。为建立小鼠角膜上皮损伤模型，使用皮肤活检打孔器在麻醉小鼠的角膜中央进行标记，以确定边界清晰且易于测量的损伤区域。轻轻按压中央角膜上的角膜环钻，留下一个圆形标记。使用手持式角膜锈环去除器（带0.5毫米钻头）刮除角膜上皮至鲍曼层，注意避免损伤鲍曼层。用角膜镊清除伤口边缘残留的松散组织。通过荧光素染色确认清创范围：将一滴生理盐水滴在荧光素试纸上溶解荧光素，然后将含荧光素的液滴置于小鼠上皮缺损处，在钴蓝光下观察染色情况。通过轻轻按压已处死小鼠的眼眶上缘和下缘，使眼球突出，进而对小鼠角膜擦伤伤口模型进行离体培养。将闭合的角膜剪尖端沿下眼眶壁插入球后间隙，注意避免刺穿眼球。用0.3毫米角膜镊固定眼球，然后用角膜剪剪断视神经及眶周软组织，以分离眼球。对于小鼠眼球的离体培养，先在48孔板的孔内加入熔化的石蜡，待其凝固后，用结膜镊的尖端在凝固的石蜡表面打一个圆形小孔，以容纳眼球。将获取的眼球直接放置于底部和侧壁均覆盖石蜡的48孔板中，以实现固定。使用含1%胎牛血清的DMEM培养基对眼球进行培养，可根据研究目的决定是否添加抗生素。将眼表浸入培养基中，避免眼球漂浮，并通过荧光素染色及在钴蓝光下用数码相机拍照，记录伤口愈合过程。为诱导碱烧伤损伤，将直径为8毫米的圆形滤纸置于培养皿中。使用滴管向培养皿中加入0.5 N氢氧化钠溶液，浸透滤纸，然后在将滤纸放置于麻醉后的兔角膜之前，去除滤纸上多余的溶液。使用眼睑撑开器打开眼睑后，确保兔的瞬膜不妨碍滤纸的放置，将浸有碱性物质的滤纸置于角膜中央，持续30秒。移除滤纸后，用10毫升生理盐水冲洗眼表，以清除残留的碱性物质。为完成角膜缺损的处理，使用角膜锈环去除器将混浊区域内的角膜上皮刮除至鲍曼层。在钴蓝光下通过荧光素染色确认清创区域，并使用角膜镊去除残留的角膜上皮。为通过睑缘缝合固定伤口状态，需确认瞬膜能够平滑覆盖眼球表面及鼻侧的角膜上皮缺损区域。使用6-0缝线进行暂时性睑缘缝合，可选择性联合局部用药，以保护眼球表面并防止兔子抓挠；确保睑缘缝合缝线位于上下眼睑边缘3至4毫米处，打四到五个结，并留较长线头，以防止兔子自行扯断缝线。在小鼠角膜上皮离体伤口愈合模型中，小鼠角膜上皮体内刮除后，中央2毫米区域出现轻度凹陷并呈现荧光素阳性染色。将固定于蜡涂层48孔培养板上的小鼠眼球进行离体培养，并在立体显微镜下每日于48孔培养板中观察和记录。刮除小鼠角膜上皮一天后，在钴蓝光下获取的数码照片中可见一个直径为2毫米的圆形荧光素染色上皮缺损区。在建立兔角膜上皮碱性损伤后，中央角膜区域可见阳性荧光素染色，无论是否使用钴蓝光观察，染色区域边界清晰且呈完整环形。角膜上皮缺损的再上皮化伴随翼状胬肉样组织从角膜缘长入。最关键的步骤是建立小鼠

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