利用钙成像技术可视化神经元-胶质细胞环路中的动态变化

本实验的总体目标是通过监测活细胞中胞质钙离子浓度的变化，以区分神经元或胶质细胞对氯化钾或三磷酸腺苷（ATP）刺激所产生的反应。钙离子是一种重要的第二信使，参与多种细胞过程，包括神经传递、可塑性和细胞凋亡。随着高选择性荧光钙染料（如Fura-2 AM）的出现，以及荧光显微镜技术和计算方法的进步，现已能够获得高空间和时间分辨率的光学数据，用于在活细胞和生物体中成像钙信号传导过程。

该方案适用于富集的神经元、纯化的胶质细胞或混合细胞群体培养。通过细胞对氯化钾和ATP的不同反应，可追踪哪些细胞类型对确定的刺激产生响应。氯化钾可改变细胞的膜电位。

这会打开主要由神经元表达的电压门控钙通道。另一方面，ATP 可激活主要存在于胶质细胞中的 P2X7 大孔道通道。通过将氯化钾和 ATP 刺激与其他药物联用，可根据细胞内钙离子浓度的升高情况，判断神经系统中哪个部分对这些刺激产生反应。

进行此操作时，您需要准备一些外科手术器械或镊子。请使用生物安全柜，并遵循最佳操作规范以避免污染。开始鸡视网膜培养时，小心地从受精卵底部（气室所在位置）打开鸡蛋。

将内容移至培养皿中，然后用镊子进行断头处理以完成胚胎捐献。头部去除后，将其转移至洁净的培养皿中，并加入一些无钙无镁溶液。接着小心摘除眼睛，注意在此过程中不要损伤眼睛。

将眼球移至另一含有CMF溶液的培养皿中。用一对镊子通过移除晶状体来开始解剖眼球。然后，从晶状体留下的孔洞处开始，在眼球上做三到四条纵向切口。

小心移除透明的玻璃体，确保视网膜未与其粘连。接着，轻柔地将视网膜从色素上皮层上分离。

去除任何残留的上皮组织。当视网膜完全清晰后，将其切成小块。使用自动移液器取走全部视网膜组织。

短暂离心以去除所有CMF。加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，于37°C孵育组织10分钟。

加入含有10%胎牛血清的1 mL培养基以终止胰蛋白酶反应。离心视网膜以去除全部胰蛋白酶。用含10%胎牛血清的培养基洗涤细胞两到三次。

接着，每份视网膜加入 2 mL 培养基，轻轻进行机械性解离。将细胞稀释至适合使用血细胞计数板进行准确计数的浓度。使用经多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白包被的 15 mm 盖玻片，以促进细胞贴壁。

将50 µL稀释后的细胞悬液滴加到每个盖玻片上。在37°C、5% CO₂的环境中孵育细胞。然后将其冷却，以使细胞贴附于玻璃表面。

此过程大约需要一到两个小时。加入 1 mL 培养基，然后放回培养箱中，直至实验当天。如有需要，每两到三天更换一半培养基。

用 50 µL DMSO 重悬一管 50 mg 的 Fura-2 AM。在实验过程中，Krebs 溶液是转移细胞的良好选择，因为它不会干扰荧光检测。实验开始前将溶液预热至 37 °C。

加入泊洛沙姆 407。加入 Fura-2 AM 和 DMSO。在水浴中超声处理七分钟。

准备一个6孔板，在三个孔中加入Krebs溶液，另取一孔加入工作浓度的Fura-2溶液。将载有细胞的盖玻片用Fura-2溶液孵育前，用Krebs溶液洗涤三次。将细胞置于37°C、5%CO2的避光培养箱中孵育30分钟。

孵育后，再次洗涤三次。将其转移至另一含有克列布斯液（Krebs）的容器中，并避光保护。可重复使用已配制的Fura-2来孵育更多载有细胞的盖玻片。

每次运行前在盖玻片支撑架和腔室中加入硅胶，以防止溶液泄漏。将盖玻片从Krebs溶液中取出，用蒸馏水小心冲洗底部，避免盐结晶附着在显微镜镜头上。将盖玻片放置于支撑架上，谨慎按压边缘。

将盖玻片支架和灌流 chamber 安装到显微镜上，并开始用 Krebs 溶液灌流细胞。选择合适的细胞并确定一个良好的视野。根据细胞形态的明显特征，手动选定感兴趣区域（ROI），即细胞体。

通过量化在340 nm和380 nm交替激发后于510 nm发射的荧光强度比值，评估钙离子浓度的变化。加入氯化钾后，可观察到许多细胞发出荧光，且图中荧光信号随之上升。氯化钾可打开电压门控钙通道，这类通道主要存在于神经元中。

图中的每一条曲线代表一个独特的兴趣区域。因此，可以在实验过程中追踪单个细胞的反应。ATP刺激可激活主要由胶质细胞表达的P2X7受体。

这是一种富集的神经元培养物，因此其中的胶质细胞很少。这也是对ATP刺激产生反应的细胞如此之少的原因。

使用 Metafluor 软件对获得的数值进行处理。实验结果以 Excel 表格形式表示，其中每一行代表一个单独的细胞，每一列代表一个时间点。通过 Excel 软件，可以分别绘制单个细胞的钙离子变化曲线，也可以将所有细胞的钙离子变化绘制在同一张图中。

为了量化对任何刺激产生反应的细胞数量，设定钙基线水平升高30%作为阈值。本实验中，我们采用孵化第8天小鸡的视网膜培养细胞，研究神经元和胶质细胞在接受50 mm氯化钾和1 mm三磷酸腺苷（ATP）刺激后，钙离子水平变化所介导的信号传导。每次实验可轻松分析约100个细胞。

图A代表一个含有神经元和胶质细胞的混合培养物，已维持培养一周。当我们对反应进行量化时，可以观察到约一半被分析的细胞对氯化钾有反应，另一半则对三磷酸腺苷（ATP）有反应。图B代表一个神经元富集的培养物。

仅培养了三天，因此大多数胶质细胞尚未分化。在此情况下，89%的细胞对氯化钾有反应，进一步证明神经元占主导地位。图C显示了纯化的胶质细胞培养物。

这些细胞在培养基中维持培养10天，每三天更换一次培养基。此后大多数神经元死亡，仅剩下胶质细胞。事实上，该培养物仅由ATP激活。

由于钙作为第二信使具有普遍的特性，该方法已被广泛使用。通过在钙成像后对固定细胞进行免疫化学染色，可进一步增强表型分析。该方案也可适用于表达其他钙通道的其他混合细胞系统。

重要的提示是找到不同类型的细胞与其表型表达相关的选择性反应。