Name: 使用钙成像技术可视化神经元 - 神经胶质细胞回路上的位移 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: 学习使用Fura-2 AM钙成像技术监测活细胞胞质钙浓度变化，以氯化钾和ATP刺激区分神经元与胶质细胞反应。该方法利用鸡视网膜培养物揭示钙信号在神经胶质回路中的时空动态。

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基金、赞助商及资助来源：MH 获得巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）博士奖学金资助。HRF 获得由巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）资助的博士后奖学金（HRF 项目编号 152071/2020-2）。RAMR 获得巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）和里约热内卢州科研资助基金会（FAPERJ）的支持（项目编号 E-26/202.668/2018、E-26/010.002215/2019、426342/2018-6 和 312157/2016-9）以及国家转化神经科学研究所（INCT-INNT）的资助。

所有涉及动物的实验均经里约热内卢联邦大学机构动物护理与使用委员会批准，并遵循该委员会的指导方针进行 &#34;实验室动物护理原则&#34; （美国马里兰州贝塞斯达，美国国立卫生研究院）；受精白来航鸡卵的许可编号为IBCCF-035。
1. 溶液的配制
<ol>
	<li>配制 Krebs 溶液：（132 mM NaCl、4 mM KCl、1.4 mM MgCl2、2.5 mM CaCl2、6 mM 葡萄糖、10 mM HEPES，pH 7.4，373 mOsm）。</li>
	<li>配制盐水缓冲液（无 Ca2+ 和 Mg2+ 溶液，CMF）：76.55 g/L NaCl、3.05 g/L KCl、1.65 g/L Na2HPO4、0.610 g/L KH2PO4、21.95 g/L 葡萄糖和 7.90 g/L NaHCO3。</li>
	<li>配制孵育溶液（含 Fura-2 的 Krebs 溶液）：5 µM Fura-2-乙酰氧基甲酯（Fura-2）、0.1% 无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）和 0.02% Poloxamer 407。</li>
	<li>对于混合细胞群体或胶质细胞培养，使用含 10% 胎牛血清（FCS）和 40 mg/L 庆大霉素的 DMEM/F12 作为培养基。</li>
	<li>对于神经元富集培养，使用含 1% FCS、神经细胞培养添加剂和 40 mg/L 庆大霉素的 DMEM/F12 作为培养基。</li>
</ol>
2. 视网膜解剖与细胞培养制备
<ol>
	<li>打开8日龄鸡胚（E8）的蛋，定位气室位置。</li>
	<li>将蛋内容物移至培养皿中，使用镊子进行断头法处死胚胎。</li>
	<li>将头部转移至洁净的培养皿中，并加入适量无钙无镁溶液（CMF）清洗。</li>
	<li>小心摘除眼球，注意过程中不要损伤组织。 
	注意：在从眼窝中取出眼球时，应尽量避免切割或撕裂眼球各层结构。</li>
	<li>将眼球转移至另一含有CMF的洁净培养皿中。</li>
	<li>开始眼球解剖，首先去除晶状体。</li>
	<li>从晶状体留下的孔洞开始，在眼球上做3至4条纵向切口。操作时用镊子分别夹住巩膜相对两侧，向相反方向牵拉完成切开。</li>
	<li>小心移除透明的玻璃体，确保视网膜未与其粘连。</li>
	<li>将视网膜从色素上皮层上分离，并清除残留组织。</li>
	<li>将透明的视网膜切成小块。</li>
	<li>将视网膜转移至另一容器中，短暂离心（约1,800 × g，1分钟）以去除CMF。</li>
	<li>加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，在37 °C条件下孵育10分钟，对视网膜进行酶解消化。</li>
	<li>加入1 mL含10%胎牛血清（FCS）的培养基终止反应。</li>
	<li>用培养基洗涤视网膜2至3次，每次加入培养基后通过离心（约1,800 × g，1分钟）去除上清。</li>
	<li>每份视网膜加入2 mL完全培养基，通过轻柔吹打进行机械解离。 
	注意：在此步骤中，研究者可选择所需的培养类型。若需富集神经元培养，使用DMEM-F12 + 神经元补充剂 + 1% FCS + 抗生素；若需混合细胞群体或纯化胶质细胞培养，则使用DMEM-F12 + 10% FCS + 抗生素。</li>
	<li>计数细胞并稀释至所需密度。 
	注意：理想情况下应为低密度培养，细胞数量约为2 × 106个或更少。</li>
	<li>向每张盖玻片上加入50 µL细胞悬液。</li>
	<li>盖玻片处理
	<ol>
		<li>将盖玻片在37 °C条件下，用1 mL含10–50 µg/mL多聚赖氨酸（poly-L-lysine）的无菌纯化水溶液中孵育至少1小时（理想为过夜）。</li>
		<li>移除多聚赖氨酸溶液，并用无菌纯化水清洗盖玻片2–3次。</li>
		<li>将盖玻片置于开启紫外灯的安全柜中晾干。此后可将其密封保存于4 °C环境中，最长可保存1个月。</li>
		<li>可选步骤：对于神经元富集培养，可在每张盖玻片上加入50 µL含10–20 ng/mL层粘连蛋白（laminin）的PBS或培养基溶液，在37 °C孵育2小时。孵育结束后去除多余层粘连蛋白溶液，盖玻片即可使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育，直至其贴附于玻璃表面，通常需要1–2小时。</li>
	<li>向每个孔中加入1 mL完全培养基，将培养板放回培养箱继续培养至实验当天。必要时，每隔2–3天更换一次培养基。</li>
</ol>
3. 使用 Fura-2 AM 负载细胞
<ol>
	<li>用 50 µL DMSO 重悬一支 50 µg 的 Fura-2 AM 小瓶。</li>
	<li>配制工作用 Fura-2 AM 溶液时，加入 3 µL 10% Poloxamer 407、7.5 µL 溶于 DMSO 的 Fura-2 AM，并用 Krebs 溶液定容至 1.5 mL。</li>
	<li>将混合液在水浴中超声处理 7 分钟。</li>
	<li>在将盖玻片用于 Fura-2 孵育前，用 Krebs 溶液洗涤细胞培养样本 3 次。</li>
	<li>在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 30 分钟。</li>
	<li>孵育结束后，再次洗涤 3 次，并转移至另一含有 Krebs 溶液且避光的容器中。 
	&#8203;注意：工作用 Fura-2 AM 溶液若避光保存，可保持稳定达 24 小时。</li>
</ol>
4. 细胞钙成像
<ol>
	<li>每次运行前，在盖玻片支架和腔室上添加硅胶，以防止实验过程中发生泄漏。</li>
	<li>用蒸馏水清洗盖玻片底部，避免盐结晶沉积在显微镜物镜上。</li>
	<li>将盖玻片放置在支架上，轻轻按压边缘。</li>
	<li>将支架和腔室固定到显微镜上，并开始用Krebs溶液灌注细胞。 
	注意：单细胞钙成像实验中的细胞灌注流速校准为0.5 mL/min，平台内溶液完全更换需要8-10秒。</li>
	<li>观察细胞，并选择合适的视野。</li>
	<li>根据细胞独特的形态特征手动选择细胞体。</li>
	<li>施加任何刺激前，需等待基线稳定。每次刺激持续时间约为30秒。 
	&#8203;注意：所有溶液应在每次实验前立即配制。</li>
	<li>通过定量分析在340 nm和380 nm交替激发（每次激发750毫秒）后于510 nm发射的荧光强度比值，评估[Ca2+]i的变化。</li>
	<li>使用荧光分析软件处理所获得的数据。</li>
	<li>以表格形式呈现实验结果，其中每一行代表一个单独的细胞，每一列代表一个时间点。</li>
</ol>
5. 数据处理
<ol>
	<li>使用电子表格软件，分别或同时绘制单个细胞或所有细胞的 Fura-2 荧光比值变化。</li>
	<li>为量化对特定刺激产生反应的细胞数量，将钙基线水平增加 30% 设为阈值。</li>
</ol>

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<li>Faria, R. X., Freitas, H. R., Reis, R. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X7+receptor+large+pore+signaling+in+avian+M%C3%BCller+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">P2X7 receptor large pore signaling in avian Müller glial cells.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 215-229 (2017).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们利用视网膜组织证明，由KCl或ATP介导的钙反应分别明确地定位于神经元和胶质细胞中（图1）。尽管文献中一些数据表明P2X7受体在神经元中表达，并可调节神经元活性和突触神经递质释放20，但其他研究者对神经元中是否存在P2X7受体提出质疑。事实上，目前的研究结果支持这一观点：在病理组织中，当细胞外ATP浓度显著升高时，主要由胶质细胞上的P2X7受体介导对神经元的影响21。
我们先前已将视网膜细胞的功能分化与其表型表现相关联，具体表现为：由KCl或AMPA（一种谷氨酸激动剂）激活的[Ca2+]i变化可表达微管相关蛋白（MAP-2），即成熟神经元的标志物1。相反，由ATP激活的细胞则表达谷氨酰胺合成酶，这是典型的Müller胶质细胞标志物。
我们已使用多种类型的细胞培养，如图所示（混合培养、富集神经元或纯化的...

由于钙离子作为第二信使具有普遍的特性，该离子参与了大量信号传导活动：基因转录、细胞生死、增殖、迁移与分化、突触传递以及可塑性。因此，一种能够准确且灵敏地追踪钙离子活化动态的方法，将有助于观察独特的时空响应。这种方法即细胞钙成像技术，它根据细胞特有的响应模式，将钙离子变化的功能数据与特定的细胞表型相关联。
Ca2+ 探针最早于20世纪80年代开发，后续的改进使其可用于活细胞检测1。作为一种化学指示剂，Fura-2 被认为是定量测定细胞内[Ca2+]i的金标准。该指示剂的乙酰氧基甲酯形式（即 Fura-2 AM）可轻易穿透细胞膜，达到比孵育稀释浓度高20倍的细胞内浓度（例如，[5 µM]o/[100 µM]i）。Fura-2 的另一个优势是具有良好的抗光漂白性能；因此，长时间成像不会显著影响其荧光能力。最后，Fura-2 对较宽范围的钙浓度具有敏感性，从约100 nM到约100 µM，其解离常数Kd约为145 nM，与静息状态下的[Ca2+]i2相当。随后，随着更先进的荧光显微镜、计算方法以及不受染料加载影响的比率型探针的发展，细胞钙成像技术得以进一步提升。
每种细胞都表达不同的钙信号装置（泵、转运蛋白、受体和通道），这些装置共同作用，形成具有特征性的最终反应。关键在于发现不同类型细胞的特异性反应，并将其与细胞的表型表达相关联。因此，至少存在两类通过钙离子转移发挥作用的受体：一类是快速通透 Ca2+ 的离子型受体；另一类是代谢型受体，其通过信号通路和细胞内钙库发挥作用，由第二信使（如三磷酸肌醇和环腺苷二磷酸核糖）激活释放 Ca2+3。
例如，前体细胞在未成熟视网膜中表达巢蛋白（nestin），并表现出由γ-氨基丁酸（GABA）或蝇蕈醇（muscimol）引起去极化的GABAA受体4。这是由于细胞内氯离子（Cl-）浓度较高，形成特定的Cl−电化学梯度所致；随着组织发育，KCC2转运蛋白的作用使GABA对前体细胞的兴奋性效应转变为对成熟GABA能神经元的抑制性效应5。另一方面，在出生后啮齿类动物未成熟的脑室下区（SVZ）表达sox-2的干细胞也具有代谢型H1受体，组胺可激活该受体并缓慢升高细胞内Ca2+浓度6。另一种属于蛋白酶激活受体-1（PAR-1）家族的代谢型受体，可被凝血酶激活，并通过G(q/11)和磷脂酶C（PLC）通路介导，引起源自多能性SVZ神经干细胞的少突胶质细胞（表达O4和PLP）产生缓慢的Ca2+变化7。
通常，神经元表达电压依赖性钙通道以及对 Ca2+ 通透的主要神经递质受体，如谷氨酸能受体（AMPA、NMDA、红藻氨酸）以及外周和中枢的烟碱型受体。氯化钾通常用作去极化剂，以激活外周神经元（如背根神经节神经元8）或中枢神经元（如来自脑室下区9或视网膜10的神经元）。另一方面，ATP 被公认为主要的胶质递质（除 D-丝氨酸外），可激活对 Ca2+ 通透的特定 P2X 受体亚型，如 P2X7 和 P2X4。这两种受体产生的 Ca2+ 电流相当，类似于被公认为由递质激活的最大 Ca2+ 电流的 NMDA 受体11。P2X7 受体在小胶质细胞中高表达，而在星形胶质细胞和少突胶质细胞中表达水平较低，并参与促炎性细胞因子的释放12。P2X7 受体也在施万细胞13以及视网膜中的 Müller 胶质细胞上表达14,15。
视网膜已知几乎表现出大脑中所见的所有神经递质。例如，垂直通路（光感受器、双极细胞和视网膜神经节细胞）主要为谷氨酸能性，其中OFF型双极细胞表达钙通透性AMPA或海人藻酸受体，ON型双极细胞表达mGluR6受体16。有趣的是，这三种受体也均存在于Müller胶质细胞中，而Müller胶质细胞与钙信号和三磷酸肌醇通路相偶联17,18。由水平细胞和无长突细胞构成的横向抑制通路不仅分泌GABA，还分泌多巴胺、乙酰胆碱及其他经典神经递质。无长突细胞是禽类视网膜培养物中主要的细胞类型，表现出多种钙离子调控通道，包括谷氨酸能、嘌呤能、烟碱型及电压依赖性钙通道。因此，该模型是研究神经元与胶质细胞之间钙离子动态变化不同特性的理想体系。
因此，在发育过程中，不同受体和通道与特定表型标志物的组合，以及其独特的激动剂反应模式，使得干细胞、前体细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞具有通过特定信号装置发挥作用的独特特征。

<table><tbody><tr><td>15 mm 盖玻片</td><td>Paul Marienfeld GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>111550</td><td>细胞支持</td></tr><tr><td>510 nm 长通滤光片</td><td>卡尔·蔡司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A1852</td><td></td></tr><tr><td>B-27 补充剂</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>补充剂</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>CoolSNAP 数字相机</td><td>Roper Scientific，新泽西州特伦顿</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>霓虹</td><td>1466</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12400-24</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>Excel 软件</td><td>微软</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>补充剂</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Axiovert 200；Carl Zeiss</td><td>B 40-080</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>分子探针</td><td>F1221</td><td>比率法钙成像&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 指示剂</td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>Calbiochem</td><td>1405-41-0</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG-4装置</td><td>Sutter Instrument，诺瓦托，加利福尼亚州</td><td>DG-4PLUS/OF30</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>促进细胞黏附</td></tr><tr><td>Metafluor 软件</td><td>Universal Imaging Corp.，美国宾夕法尼亚州西切斯特</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Vetec</td><td>129</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>异佛尔</td><td>310</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Vetec</td><td>306</td><td></td></tr><tr><td>PH3 平台</td><td>Warner Instruments，康涅狄格州哈姆登</td><td>64-0286</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>分子探针</td><td>P6866</td><td>非离子型表面活性剂</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>促进细胞黏附</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>解离酶</td></tr></tbody></table>

利用钙成像技术可视化神经元-胶质细胞环路中的动态变化

Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

本文报道了基于胶质细胞（星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞）和/或外周组织（背根神经节）及中枢组织（皮层、脑室下区、类器官）来源的神经元的体外选择性环路模型，这些模型通过钙离子动态变化进行动态研究。为展示研究结果，我们选用视网膜作为模型，视网膜是一种结构简单但具有复杂细胞相互作用的组织。钙离子是参与大多数重要细胞功能的通用信使。我们以逐步操作方案的形式，详细说明如何制备和评估培养中的视网膜神经元-胶质细胞，并观察其钙离子变化。在该模型中，我们依据细胞对KCl和ATP的选择性反应，区分神经元与胶质细胞。钙离子通透性受体和通道在不同细胞区室中选择性表达。为分析钙离子反应，我们采用比率型荧光染料如Fura-2。该探针通过检测Ca2+游离态与Ca2+结合态在两种不同波长下的荧光强度，形成两个不同的吸收峰，从而定量细胞内游离Ca2+浓度。

本研究采用孵化第8天的鸡胚视网膜细胞培养物，以研究神经元和胶质细胞在钙离子动态变化方面的信号传导机制。细胞培养方法基本如文献所述15,19，制备成混合的神经元-胶质细胞培养物（密度 ≥ 1 × 106 个细胞/皿），体外培养7天后进行实验（图1A）。另外，还制备了低密度（5 × 105 个细胞/皿）的富集神经元细胞，接种于经多聚-L-赖氨酸（10 µg/mL）处理的盖玻片上，体外培养3天后使用（图1B）。此外，在去除神经元后，纯化的穆勒胶质细胞（Müller glia）在含10%胎牛血清（FCS）的DMEM培养基中维持培养10天。为定量评估神经元和胶质细胞的功能性反应，使用50 mM KCl或1 mM ATP对细胞进行刺激。如图所示（图1A），在302个细胞中，50%对KCl产生反应，53%对ATP产...

细胞钙成像是一种多功能方法，可用于研究培养物中混合细胞群体甚至清醒动物个体细胞的动态信号传导，该方法基于钙通透性通道/受体的表达，从而产生独特的功能特征。

在此，我们报道基于胶质细胞（星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞）和/或外周神经元的体外选择性神经环路模型

本实验的总体目标是通过监测活细胞中胞质钙离子浓度的变化，以区分神经元或胶质细胞对氯化钾或三磷酸腺苷（ATP）刺激所产生的反应。钙离子是一种重要的第二信使，参与多种细胞过程，包括神经传递、可塑性和细胞凋亡。随着高选择性荧光钙染料（如Fura-2 AM）的出现，以及荧光显微镜技术和计算方法的进步，现已能够获得高空间和时间分辨率的光学数据，用于在活细胞和生物体中成像钙信号传导过程。该方案适用于富集的神经元、纯化的胶质细胞或混合细胞群体培养。通过细胞对氯化钾和ATP的不同反应，可追踪哪些细胞类型对确定的刺激产生响应。氯化钾可改变细胞的膜电位。这会打开主要由神经元表达的电压门控钙通道。另一方面，ATP 可激活主要存在于胶质细胞中的 P2X7 大孔道通道。通过将氯化钾和 ATP 刺激与其他药物联用，可根据细胞内钙离子浓度的升高情况，判断神经系统中哪个部分对这些刺激产生反应。进行此操作时，您需要准备一些外科手术器械或镊子。请使用生物安全柜，并遵循最佳操作规范以避免污染。开始鸡视网膜培养时，小心地从受精卵底部（气室所在位置）打开鸡蛋。将内容移至培养皿中，然后用镊子进行断头处理以完成胚胎捐献。头部去除后，将其转移至洁净的培养皿中，并加入一些无钙无镁溶液。接着小心摘除眼睛，注意在此过程中不要损伤眼睛。将眼球移至另一含有CMF溶液的培养皿中。用一对镊子通过移除晶状体来开始解剖眼球。然后，从晶状体留下的孔洞处开始，在眼球上做三到四条纵向切口。小心移除透明的玻璃体，确保视网膜未与其粘连。接着，轻柔地将视网膜从色素上皮层上分离。去除任何残留的上皮组织。当视网膜完全清晰后，将其切成小块。使用自动移液器取走全部视网膜组织。短暂离心以去除所有CMF。加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，于37°C孵育组织10分钟。加入含有10%胎牛血清的1 mL培养基以终止胰蛋白酶反应。离心视网膜以去除全部胰蛋白酶。用含10%胎牛血清的培养基洗涤细胞两到三次。接着，每份视网膜加入 2 mL 培养基，轻轻进行机械性解离。将细胞稀释至适合使用血细胞计数板进行准确计数的浓度。使用经多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白包被的 15 mm 盖玻片，以促进细胞贴壁。 将50 µL稀释后的细胞悬液滴加到每个盖玻片上。在37°C、5% CO₂的环境中孵育细胞。然后将其冷却，以使细胞贴附于玻璃表面。此过程大约需要一到两个小时。加入 1 mL 培养基，然后放回培养箱中，直至实验当天。如有需要，每两到三天更换一半培养基。用 50 µL DMSO 重悬一管 50 mg 的 Fura-2 AM。在实验过程中，Krebs 溶液是转移细胞的良好选择，因为它不会干扰荧光检测。实验开始前将溶液预热至 37 °C。加入泊洛沙姆 407。加入 Fura-2 AM 和 DMSO。在水浴中超声处理七分钟。准备一个6孔板，在三个孔中加入Krebs溶液，另取一孔加入工作浓度的Fura-2溶液。将载有细胞的盖玻片用Fura-2溶液孵育前，用Krebs溶液洗涤三次。将细胞置于37°C、5%CO2的避光培养箱中孵育30分钟。孵育后，再次洗涤三次。将其转移至另一含有克列布斯液（Krebs）的容器中，并避光保护。可重复使用已配制的Fura-2来孵育更多载有细胞的盖玻片。每次运行前在盖玻片支撑架和腔室中加入硅胶，以防止溶液泄漏。将盖玻片从Krebs溶液中取出，用蒸馏水小心冲洗底部，避免盐结晶附着在显微镜镜头上。将盖玻片放置于支撑架上，谨慎按压边缘。将盖玻片支架和灌流 chamber 安装到显微镜上，并开始用 Krebs 溶液灌流细胞。选择合适的细胞并确定一个良好的视野。根据细胞形态的明显特征，手动选定感兴趣区域（ROI），即细胞体。通过量化在340 nm和380 nm交替激发后于510 nm发射的荧光强度比值，评估钙离子浓度的变化。加入氯化钾后，可观察到许多细胞发出荧光，且图中荧光信号随之上升。氯化钾可打开电压门控钙通道，这类通道主要存在于神经元中。图中的每一条曲线代表一个独特的兴趣区域。因此，可以在实验过程中追踪单个细胞的反应。ATP刺激可激活主要由胶质细胞表达的P2X7受体。这是一种富集的神经元培养物，因此其中的胶质细胞很少。这也是对ATP刺激产生反应的细胞如此之少的原因。使用 Metafluor 软件对获得的数值进行处理。实验结果以 Excel 表格形式表示，其中每一行代表一个单独的细胞，每一列代表一个时间点。通过 Excel 软件，可以分别绘制单个细胞的钙离子变化曲线，也可以将所有细胞的钙离子变化绘制在同一张图中。为了量化对任何刺激产生反应的细胞数量，设定钙基线水平升高30%作为阈值。本实验中，我们采用孵化第8天小鸡的视网膜培养细胞，研究神经元和胶质细胞在接受50 mm氯化钾和1 mm三磷酸腺苷（ATP）刺激后，钙离子水平变化所介导的信号传导。每次实验可轻松分析约100个细胞。图A代表一个含有神经元和胶质细胞的混合培养物，已维持培养一周。当我们对反应进行量化时，可以观察到约一半被分析的细胞对氯化钾有反应，另一半则对三磷酸腺苷（ATP）有反应。图B代表一个神经元富集的培养物。仅培养了三天，因此大多数胶质细胞尚未分化。在此情况下，89%的细胞对氯化钾有反应，进一步证明神经元占主导地位。图C显示了纯化的胶质细胞培养物。这些细胞在培养基中维持培养10天，每三天更换一次培养基。此后大多数神经元死亡，仅剩下胶质细胞。事实上，该培养物仅由ATP激活。由于钙作为第二信使具有普遍的特性，该方法已被广泛使用。通过在钙成像后对固定细胞进行免疫化学染色，可进一步增强表型分析。该方案也可适用于表达其他钙通道的其他混合细胞系统。重要的提示是找到不同类型的细胞与其表型表达相关的选择性反应。

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使用钙成像技术可视化神经元 - 神经胶质细胞回路上的位移

利用钙离子敏感型指示剂染料的AM酯形式，可检测发育中神经元网络的自发活动。通过单光子或双光子成像技术，可观察到指示剂荧光的瞬时变化，从而反映细胞内钙离子浓度的改变，指示神经元的激活状态。该方案可适用于多种依赖发育阶段的神经元网络研究。 体外.

发育中皮层网络的功能性钙成像

本文描述了一种将钙离子指示剂染料加载至脑室下区（SVZ）细胞以记录钙活性的方法。出生后的脑室下区包含紧密排列的细胞，如神经前体细胞和成神经细胞。与浴式加载不同，我们通过压力将染料直接注入组织内部，从而实现更佳的染料扩散效果。...

制备用于钙成像的急性侧脑室下区脑片

在本方案中，我们介绍了利用红色荧光Ca2+指示剂染料对脑组织切片中GFP标记的神经元进行Ca2+信号成像的最新进展。...

对下丘脑小鼠脑切片中GFP标记神经元的钙反应进行成像

本视频介绍了钙成像背后的概念，并包含一个示例方案，用于对置于模制琼脂糖小孔中的线虫进行延时成像。...

钙成像：一种在活体 C. elegans 中可视化神经活动的方法

来源： Bancroft, E. A., et al. 定量分析原代小鼠中脑神经元中的自发性 Ca2+ 流动及其下游效应. J. Vis. Exp. (2020)...

小鼠胚胎来源腹侧中脑神经元中钙离子内流的可视化

我们描述了一种通过双侧初级躯体感觉皮层（S1）上方的双光窗记录神经元活动的实验方法 Thy1- 使用双光子（2P）显微镜的GCaMP6s转基因小鼠 体内.

使用 Thy1-GCaMP6s 转基因小鼠对初级躯体感觉皮层中的神经活动进行成像

我们介绍一种结合全细胞膜片钳记录与双光子成像的方法，用于在急性脑片中的神经元树突内记录 Ca2+...

脑片中神经元树突的双光子钙成像

我们提出了一项分为两个部分的实验方案，该方案结合了荧光钙成像与原位杂交技术，使实验人员能够在单细胞水平上将钙活动模式与基因表达谱相关联。...

荧光钙成像与后续原位杂交用于神经前体细胞表征 Xenopus laevis

当前方法描述了一种用于高分辨率、亚区室钙成像的非比率测量法 体内 在 秀丽隐杆线虫 使用 readily available 遗传编码钙离子指示剂.

神经元钙处理的亚细胞成像 在体

视网膜假体能够产生视觉感知。为了推动新型假体的开发，需要在植入前使用离体（ex...

电刺激下平铺视网膜的钙成像

学习使用Fura-2 AM钙成像技术监测活细胞胞质钙浓度变化，以氯化钾和ATP刺激区分神经元与胶质细胞反应。该方法利用鸡视网膜培养物揭示钙信号在神经胶质回路中的时空动态。

利用钙成像技术可视化神经元-胶质细胞环路中的动态变化

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