Name: 从土壤中分离可培养酵母和霉菌以研究真菌种群结构 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-27T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学习从土壤样品中分离培养酵母和霉菌的高效方法，利用无菌培养技术和聚合酶链反应鉴定物种。该方案可在七天内快速分离Aspergillus fumigatus等真菌，助力研究环境酵母多样性与病原菌追踪。

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本研究得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（资助号：ALLRP 570780-2021）和麦克马斯特大学的资助。

注意：任何使用国际土壤样本和/或A. fumigatus孢子与菌丝的步骤，均需在生物安全二级（BSCII）的生物安全柜中进行操作。
1. 从土壤中分离酵母
<ol>
	<li>抗菌和抗真菌溶液的制备
	<ol>
		<li>将氯霉素粉末悬浮于70%乙醇中，配制50 g/L的母液。使用注射器滤器除菌，4 °C保存。 
		&#8203;注意：该抗生素可在土壤酵母分离过程中抑制大多数细菌的生长。由于可能存在对氯霉素耐药的细菌，因此在区分酵母与细菌时，必须仔细考虑菌落形态。当处理疑似含有抗生素耐药菌株的土壤时，可向培养基中添加其他抗生素。在从环境土壤中分离酵母时，添加氯霉素的培养基中未出现细菌污染问题。</li>
		<li>将苯来特粉末悬浮于DMSO中，配制5 g/L的储备液。使用注射器滤器除菌，4 °C保存。 
		注意：该选择性抗真菌药物可在土壤酵母分离过程中抑制大多数丝状真菌的生长，而不会影响酵母的生长。26,27.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养基与无菌器材的准备
	<ol>
		<li>制备YEPD（酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖）液体培养基：将10 g酵母提取物、20 g蛋白胨和20 g葡萄糖加入1 L双蒸水中，搅拌至充分溶解，121 °C高压灭菌40 min。灭菌后于室温保存备用。</li>
		<li>YEPD 固体琼脂培养基
		<ol>
			<li>将10 g酵母提取物、20 g蛋白胨、20 g葡萄糖和20 g琼脂加入1 L水中，充分搅拌混匀，121 °C高压灭菌40 min。</li>
			<li>待充分冷却后，从储备液中加入1 mL氯霉素和苯来米，使两种抗菌剂的终浓度分别为50 mg/L和5 mg/L。</li>
			<li>充分搅拌混匀后，倒入直径为10 cm的培养皿中。室温下静置过夜使其凝固，随后于4 °C保存备用。 
			注意：从1 L YEPD培养基中可倒约40块平板。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过高压灭菌对木柄无菌棉签和可重复使用的细胞涂布棒进行灭菌，并在室温下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>土壤在液体培养基中的孵育
	<ol>
		<li>用土壤样品编号标记一组无菌的13 mL培养管。</li>
		<li>使用血清移液管，向每根试管中加入 5 mL 添加了氯霉素和苯菌灵的 YEPD 培养基。</li>
		<li>在BSCII级生物安全柜中，使用无菌的平头木质棉签将约0.1 g土壤转移至相应的培养管中。 
		注意：每个土壤样品均需使用新的采样器，使用后立即丢弃，以避免样品间的交叉污染。</li>
		<li>将试管牢固地盖紧至第一档位置，以防止培养过程中液体溢出，同时允许气体交换。将培养试管置于滚筒摇床中，在最适于促进酵母生长的温度下孵育24小时。 
		注意：培养温度应根据土壤样品来源国家的年平均气温来确定。例如，来自冰岛的土壤样品，其培养管在14 °C下培养；而来自沙特阿拉伯的土壤样品，则在30 °C下培养。由于较低温度下酵母生长较慢，培养时间可能需要延长至72小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将上清液转移至固体培养基中。
	<ol>
		<li>使用第1.2步制备的YEPD + 氯霉素 + 多菌灵琼脂平板，用土壤样品编号进行标记。</li>
		<li>从滚轴摇床中取出1.3步骤制备的培养管。在生物安全柜（BSCII）中操作，短暂涡旋振荡培养管，使可能沉降至管底的土壤颗粒和细胞重新悬浮。</li>
		<li>使用微量移液器将100 µL上清液转移至平板。用无菌的可重复使用涂布棒将液体在琼脂表面充分且均匀地涂布。 
		注意：以10个样本为一组进行操作可显著加快该过程。先将上清液移取到10个培养皿中，再进行涂布。每个样本使用新的涂布棒，以避免样本间的交叉污染。</li>
		<li>将培养皿叠放在塑料袋中，密封后倒置，于先前液体培养基培养所用的相同温度下孵育2-3天，直至可见微生物生长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酵母菌的检测与单菌落划线分离
	<ol>
		<li>在给予足够的孵育时间后（通常为2-3天，但在较低温度下可能需要更长时间），在BSCII中检查平板上是否有酵母生长。观察呈乳白色、圆形、哑光状的酵母菌落，其应易于与细菌和霉菌菌落相区分。 
		注意：某些酵母可产生有色色素，菌落可能呈黑色/棕色、黄色或红色，但其整体菌落质地和形态与无色素酵母相似。</li>
		<li>从每个平板上选择一个酵母样菌落进行后续处理。 
		注意：若在单个培养皿上观察到多种形态类型的菌落，应针对每种形态类型分别挑选一个具有代表性的菌落。</li>
		<li>使用无菌的木质平头涂布棒，将每个挑选出的菌落转移至新鲜的 YEPD + 氯霉素 + 多菌灵平板上，并划线分离以获得单菌落。每块平板进行三次独立划线。
		<ol>
			<li>使用涂布棒在平板约三分之一区域来回划线。进行第二区和第三区划线时，每次均需将涂布棒穿过前一区划线区域一次。每个划线区域均需使用新的涂布棒。 
			注意：每个分离株使用一个培养皿。使用后立即丢弃接种环，以避免样本间的交叉污染。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将培养皿叠放在塑料袋中，密封后倒置，在先前使用的相同温度下孵育2-3天，直至单菌落可见。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酵母菌物种鉴定 通过 ITS测序
	<ol>
		<li>为每个土壤分离物挑选一个分散良好的单菌落，转接至新的YEPD + 氯霉素 + 多菌灵平板进行继代培养，以获得更多的细胞。在先前使用的相同温度下培养2–3天。</li>
		<li>收获新鲜培养的细胞，将其悬浮于含有1 mL无菌30%甘油（溶于双蒸水中）的-80 °C冻存管中，制备成细胞悬液。将这些悬液作为储备液保存在-80 °C。</li>
		<li>使用新鲜细胞，用引物 ITS1（5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3'）和 ITS4（5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3'）进行菌落 PCR（聚合酶链式反应），以扩增真菌条形码基因 ITS9采用以下热循环条件：95 °C 预变性 10 分钟，随后进行 35 个循环，每个循环包括 (i) 95 °C 变性 30 秒，(ii) 55 °C 退火 30 秒，(iii) 72 °C 延伸 1 分钟。 
		注意：菌落PCR的成功率高于先进行DNA提取再进行PCR的方法，且周转时间更短。</li>
		<li>若某菌株的菌落PCR反复失败，则选用合适的方案提取DNA，并以提取的基因组DNA为模板进行ITS PCR（使用与上述相同的热循环条件）。 
		注意：建议采用一种基于氯仿的、成本相对较低的DNA提取方法28.</li>
		<li>对每种菌株扩增的ITS区域进行Sanger测序，以确定其DNA序列。</li>
		<li>将获得的酵母菌株ITS序列与公共数据库（如NCBI GenBank和UNITE）中已收录的序列进行比对，以确定其物种分类。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从土壤中分离烟曲霉（Aspergillus fumigatus）
<ol>
	<li>为每份土壤样品准备1 mL添加了抗生素氯霉素的无菌沙氏葡萄糖肉汤（SDB）。
	<ol>
		<li>将10 g蛋白胨和20 g葡萄糖加入1 L蒸馏水中。121 °C高压灭菌40 min。</li>
		<li>待SDB冷却至约50 °C后，加入1 mL浓度为50 g/L的氯霉素，使终浓度为50 mg/L。 
		注意：氯霉素的配制方法与上述酵母分离中的配制方法相同。除抑制细菌生长外，氯霉素还可防止细菌产气，避免在2.2步骤所述的孵育过程中导致试管开启。</li>
		<li>使用移液器无菌操作将1 mL SDB分装至每份土壤样品对应的1.5 mL微量离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将土壤加入1.5 mL微量离心管中。
	<ol>
		<li>在 BSCII 内放置实验台防护罩或吸水垫，以方便处理洒落的土壤。</li>
		<li>使用灭菌的涂布棒，将约 0.1 g 土壤转移至含有 1 mL SBD 的 1.5 mL 微离心管中。盖紧管盖并涡旋振荡。将土壤悬液于 50 °C 培养 3 天。 
		注意：孵育期间无需振荡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>土壤接种肉汤的菌丝收获
	<ol>
		<li>制备麦芽提取物琼脂（MEA）平板。
		<ol>
			<li>每升MEA培养基：将20 g麦芽提取物、20 g葡萄糖、6 g蛋白胨和15 g琼脂加入1 L蒸馏水中，121 °C高压灭菌40 min。</li>
			<li>让MEA冷却至约50 °C，然后加入1 mL浓度为50 g/L的氯霉素，使其终浓度为50 mg/L。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将接种土壤的肉汤中的菌丝转移到MEA平板上。
		<ol>
			<li>鉴定在SDB与空气交界处可见菌丝生长的土壤接种物。</li>
			<li>使用无菌的 plain-tipped 木制涂布棒将菌丝转移至 MEA 平板中央。将 MEA 平板在 37 °C 下培养 3 天。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>菌丝体筛选 A. fumigatus 形态学特性。
	<ol>
		<li>鉴定具有特征性的霉菌菌落 A. fumigatus 形态特征（绿色绒面革状生长）。</li>
		<li>在BSL-2实验室中，使用无菌的木质平头涂布棒或接种环轻轻刮取一次培养基表面，收集分生孢子/菌丝。通过在MEA平板琼脂表面划线，将孢子/菌丝转移至平板中央，以获得单菌落。于37 °C培养2天。 
		注意：由于多个 A. fumigatus 平板上可能存在多种菌株和/或其他真菌，因此必须进行单菌落划线分离。可采用酵母分离方案中步骤1.5.3的单菌落划线操作程序。</li>
		<li>使用无菌接种棒或接种环，将第2.4.1.2步中获得的单个菌落划线转接至MEA培养基上，仅划线一次。将收集的孢子均匀涂布于平板中央。在37 °C下培养2天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收获 A. fumigatus 用于培养物保存的孢子/菌丝
	<ol>
		<li>制备无菌30%甘油溶液（配制100 mL溶液时，将30 mL 100%甘油与70 mL双蒸水混合，于121 °C灭菌40 min）。</li>
		<li>在BSCII级生物安全柜中，使用p1000移液器吸取1 mL 30%甘油溶液。将1 mL甘油溶液滴加至 A. fumigatus 菌落以收获孢子/菌丝。
		<ol>
			<li>由于其疏水性 A. fumigatus 孢子/菌丝：使用移液器吸头刮取平板上孢子密集的区域。 
			注意：当将甘油滴加到划线上时，甘油会附着在划线区域，而不会在琼脂表面滚动。</li>
			<li>缓慢将甘油滴加到划线区域，以使孢子脱落并悬浮于甘油溶液中。</li>
			<li>完全加入后，轻轻倾斜平板，吸出甘油孢子/菌丝悬浮液。 
			注意：将吸取约 750 至 800 µL。</li>
			<li>将抽吸物转移至无菌冻存管中，并于 -80 °C 保存。如需制备工作液，可重复步骤 2.5.2.1 至 2.5.2.4。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>表型鉴定 A. fumigatus 菌株
	<ol>
		<li>使用步骤 2.5.2 制备的孢子储备液，在水中进行 100 倍稀释。
		<ol>
			<li>吸取10 µL菌丝和孢子储备液，加入990 µL水中。涡旋振荡悬浮液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在标准显微镜载玻片上滴加10 µL稀释后的孢子悬浮液。</li>
		<li>可选：用亚甲蓝对菌丝和孢子悬液进行染色。
		<ol>
			<li>用亚甲蓝染色时，将分生孢子和分生孢子梗通过在本生灯火焰上烘烤载玻片至干燥，以固定于载玻片上。</li>
			<li>甲烯蓝染色1-2分钟，用水洗去。</li>
			<li>用吸水纸将玻片干燥。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在400倍放大倍数下使用复式显微镜观察悬液，找到分生孢子梗。将观察到的分生孢子梗形态与 A. fumigatus 分生孢子梗形态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分子鉴定 A. fumigatus 菌株
	<ol>
		<li>按照常见的真菌DNA提取方案，从每个分离株中提取DNA。</li>
		<li>使用特异性引物针对 曲霉属&#160;β-tubulin 基因（β-tub1 和 β-tub4），进行PCR并获取扩增产物的序列，具体操作参照Alcazar-Fuoli等描述的实验方案。17.
		<ol>
			<li>将获得的序列与公共数据库（如NCBI GenBank）中存储的序列通过BLAST进行比对。</li>
			<li>确认菌株序列与顶级匹配序列一致 A. fumigatus 数据库中的序列。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>替代步骤 2.7.2，进行多重 PCR 反应，以目标序列为靶点 A. fumigatus 交配型 MAT1-1 和 MAT1-229.
		<ol>
			<li>在多重 PCR 反应中使用以下三种引物序列： AFM1：5'-CCTTGACGCGATGGGGTGG-3'； AFM2：5′-CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3′； AFM3：5′-CGGAAATCTGATGTCGCCACG-3′。</li>
			<li>使用以下PCR扩增程序：95 °C预变性5分钟；然后进行35个循环，每个循环包括95 °C变性30秒、60 °C退火30秒、72 °C延伸1分钟；最后72 °C终延伸5分钟。</li>
			<li>运行凝胶电泳以鉴定产物；检测834 bp的MAT-1或438 bp的MAT1-2。使用 A. fumigatus 已确认交配型扩增的菌株，作为阳性和阴性对照。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微卫星基因分型 A. fumigatus 通过片段分析鉴定菌株 
	注意：尽管以下列出的步骤大致涵盖了基因分型 A. fumigatus 在九个微卫星（STR）位点上，仅强调了一些重要的注意事项。有关详细信息，请参见 A. fumigatus STR基因分型，请参考De Valk等人的研究。24,30.
	<ol>
		<li>使用De Valk等人先前描述的STRAf引物，配制三份PCR多重扩增主混合液。24.
		<ol>
			<li>通过毛细管电泳测定片段大小，需对正向引物进行荧光标记。确保在混合引物体系中，正向引物的浓度为反向引物浓度的一半（正向引物 0.5 μM，反向引物 1 μM）。 
			注意：为了获得最佳结果，应使用在毛细管电泳过程中与所选染料标准品吸收波长相匹配的荧光标记。</li>
			<li>为获得最佳结果，请使用热启动聚合酶。</li>
			<li>使用每反应0.1 ng的DNA浓度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用以下PCR程序对每种菌株进行多重PCR扩增：95 °C预变性10 min，然后进行40个循环（95 °C变性30 s，60 °C退火30 s，72 °C延伸60 s），随后72 °C最终延伸10 min，最后在4 °C保存。</li>
		<li>通过凝胶电泳检测扩增产物。</li>
		<li>根据片段分析专家的建议，将产物稀释至所需浓度（通常约为50倍），并进行毛细管电泳。每种菌株进行三次运行，每次运行包含三个使用不同荧光探针的多重反应。</li>
		<li>为确定九个STR位点中每个位点的正确片段大小，应使用能够进行片段分析的软件。
		<ol>
			<li>获取毛细管电泳得到的原始数据。使用片段分析软件（例如 Osiris），根据最大峰对片段大小进行判读。</li>
			<li>将九个位点的片段大小转换为重复次数。参照De Valk等人先前所述方法，使用参考菌株Af293的重复次数片段大小。24. 
			注意：不同毛细管电泳平台之间片段大小可能存在轻微差异。因此，在对菌株进行分型时，为九个位点中的每一个位点包含已知片段大小的共同参考菌株（以及内部分子量标准）至关重要。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

从土壤中分离酵母菌和A. fumigatus的实验方案是一种快速高效的高通量土壤处理与真菌分离方法。该方案每个样品仅需少量土壤（0.1–0.2 g），可在相同工作量下增加采样位点数量。快速的实验周期确保在短时间内获得结果，并为必要时的问题排查和重复实验留出时间。本方案可利用标准的微生物学和细胞培养设备，在多种实验室条件下轻松复制。然而，在从国际来源的土壤中分离酵母或霉菌时，需采取额外的预防措施。所有非一次性塑料器具，如塑料托盘和涂布棒，应先浸入10%次氯酸钠溶液中消毒，随后进行高压灭菌。使用过的实验服应密封于塑料袋中，在丢弃前进行高压灭菌处理。
需要注意的是，采用上述方案分离得到的酵母菌数量和种类可能受到培养条件和培养基的限制。例如，在滚筒培养箱中培养24小时可能更有利于快速生长的好氧酵母生长，而抑制了生长较慢的酵母物种的分离。此外，使用营养丰富的YEPD培养基进行酵母分离，可能会排除那些具有不同营养需求和偏好的酵母物种。再者，本研究采样的多数地点全年存在温度及其他气候条件的季节性变化。若时间和资源允许，可将相同的土壤样品在不同温度条件下进行处理，以利于分离出更广...

土壤生态系统中的真菌在有机物分解、养分循环和土壤肥力维持中发挥着关键作用1。在土壤真菌研究中，非培养依赖性方法（即高通量测序）和培养依赖性方法均被广泛应用2,3。尽管高通量 metabarcode 测序产生的大量数据有助于揭示群落结构和多样性的宏观格局，但培养依赖性方法能够提供关于真菌群落分类和功能结构的高度互补信息，并且由于可以获得纯真菌培养物，通过后续的多样性与功能分析，还能获得单个生物体更具体的特征谱型。
尽管每克土壤中的酵母菌数量通常很少超过数千个细胞，但作为单细胞真菌的广义酵母在土壤生态系统中是重要的分解者，也是其他土壤生物的食物来源4,5。事实上，在南极大陆等寒冷生物圈中，酵母可能是占主导地位的土壤真菌6,7。土壤同时也是与医学相关酵母的重要储存库，这些酵母可导致人类及其他哺乳动物发生严重的机会性感染8。尽管形态相似，酵母菌在系统发育上具有高度多样性，分布于真菌界两大门类——子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）中的丝状真菌之中9。酵母缺乏在真菌条形码基因——核糖体RNA基因簇的内转录间隔区（ITS）——中可定义的DNA特征序列10，因此在宏基因组学研究中无法与其他真菌区分开来，必须依赖培养依赖性方法来分离酵母菌种。
以下方案已用于表征九个国家的土壤酵母群落，并揭示全球范围内土壤酵母多样性中的趋势与模式9,11,12。在研究酵母等特定生物类群时，宏基因组学方法的应用具有局限性2,3。由于酵母具有较高的系统发育多样性，仅依靠DNA序列无法将其与其他真菌区分开来。因此，研究酵母种群仍需依赖基于培养的分离方法。然而，培养过程通常耗时较长，且需要更多人员参与实验操作。为此，本方案已优化并简化，以便在人员有限的情况下实现更快速的处理。培养法的主要优势在于所鉴定出的酵母物种为活体酵母而非死细胞，因此更可能是真正的土壤定居者，而非暂时存在于土壤中的细胞。据估计，土壤中约40%的真菌DNA来源于其他环境的污染物、游离的胞外DNA，或来自已失去完整性的细胞，这导致高通量测序方法可能将真菌丰富度高估达55%13。基于培养的分离方法不仅能明确确认酵母物种的身份，还可获得纯培养物，用于后续分析。事实上，利用该土壤分离方案已成功鉴定出44种潜在的新酵母物种，并可通过多种方法对其分类学和功能特性进行深入研究14。
以下方案也可用于分离土壤中存在的霉菌，例如 A. fumigatus。Aspergillus fumigatus 是一种嗜热性腐生霉菌，在全球范围内的土壤中广泛分布15&#160;。该菌已从多种临床和非临床环境中被分离获得。非临床采样通常包括空气、有机碎屑（堆肥、锯末、郁金香鳞茎废弃物）以及土壤（农业用地、花园和自然土壤）16,17,18,19。Aspergillus fumigatus 是一种人类机会性病原体，可引起一组统称为曲霉病的感染，全球受影响人数超过800万16,20。全球约有30万人罹患侵袭性曲霉病，这是曲霉病中最严重的形式16。根据患者群体、感染部位以及抗真菌治疗效果等因素的不同，其死亡率可高达90%。在过去几十年中，对抗真菌药物的耐药性逐渐增加，因此需要在全球范围内对临床和环境中的菌株进行监测，以追踪这些耐药基因型21,22,23。鉴于其能够在50 °C以上的温度下生长，这一特性可用于基于培养的方法，从土壤中选择性分离A. fumigatus菌株。Aspergillus fumigatus菌株通常在九个高度多态性的短串联重复序列（STR）位点进行基因分型，这些位点在不同菌株之间具有很高的区分能力24。这些STR基因型可与先前调查的其他种群进行比对，以追踪A. fumigatus基因型（包括耐药基因）在全球范围内的传播情况。
以下我们描述了一种通过依赖培养的方法快速从土壤样品中分离酵母菌和A. fumigatus的实验方案。根据每个样品所获取的土壤量，土壤样品可在两个方案之间共享使用。与现有的从土壤中分离酵母菌和A. fumigatus的类似方法相比，本方案每获得一个分离株所需的土壤量减少至十分之一。以往研究中为分离A. fumigatus通常需要每株1至2克土壤，而本方案仅需0.1–0.2克土壤18,19,25。本方案采用更小规格的塑料器皿和容器，有利于实现高通量设计。因此，可在更小的空间内使用更少的设备（如培养箱和滚轴混合仪）处理更多数量的样品。土壤样品可在最短7天内完成全部处理并获得分离株。本方案已优化至每人每天可处理150–200个样品。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Sarstedt Inc</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>苯菌灵粉末&amp;nbsp;</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>B161380</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素粉末&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SKU: C0378-5G</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SKU: D9434-500G</td><td></td></tr><tr><td>片段分析软件</td><td>NCBI's Osiris</td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/</td></tr><tr><td>ITS 序列数据库</td><td>NCBI GenBank&amp;nbsp;</td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/</td></tr><tr><td>ITS 序列数据库</td><td>UNITE&amp;nbsp;</td><td></td><td>https://unite.ut.ee/</td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SKU: P5905-500G</td><td></td></tr><tr><td>可重复使用涂布棒&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-12</td><td></td></tr><tr><td>无菌 10 cm 直径培养皿&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt Inc</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>无菌 13 mL 培养管&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt Inc</td><td>62.515.006</td><td></td></tr><tr><td>木质钝头涂抹棒&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-112</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SKU: Y1625-250G</td><td></td></tr></tbody></table>

从土壤中分离可培养的酵母菌和霉菌以研究真菌种群结构

Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure

土壤中栖息着数量惊人的微生物，每克土壤可含有高达数十亿个细菌、古菌和真菌细胞。多细胞真菌（如霉菌）和单细胞真菌（广义上称为酵母）在土壤生态系统中发挥着至关重要的作用，既是有机物质的分解者，也是其他土壤生物的食物来源。土壤中真菌物种的多样性受多种气候因素（如降雨量和温度）以及土壤特性（包括有机质含量、pH值和湿度）的影响。由于在亚洲、非洲、南美洲和中美洲等地区缺乏充分的环境采样，限制了对土壤真菌群落的表征以及新物种的发现。
我们利用来自六大洲九个国家的约4000份土壤样本，以及实验室开发的酵母菌和霉菌分离方案，对土壤真菌群落进行了表征。该方案首先分别对酵母菌和具有医学意义的霉菌进行选择性富集培养。 Aspergillus fumigatus在液体培养基中培养，同时抑制细菌生长。随后将形成的菌落转移至固体培养基，进一步处理以获得纯培养物，继而进行下游遗传学表征。酵母菌种的鉴定通过以下方式确定 通过 核糖体RNA基因簇的内转录间隔区（ITS）测序，以及全球种群结构分析 A. fumigatus 被探讨 通过 微卫星标记分析 
该方案已成功应用于喀麦隆、加拿大、中国、哥斯达黎加、冰岛、秘鲁、新西兰、沙特阿拉伯以及中国台湾的土壤酵母菌和A. fumigatus种群的分离与表征。这些研究结果揭示了全球土壤酵母多样性格局，以及A. fumigatus的全球种群结构和抗真菌药物耐药特征，提供了亟需的科学依据。本文介绍了从国际范围的土壤样本中分离酵母菌和A. fumigatus的方法。

从土壤中分离酵母 
采用上述酵母分离方案，从来自九个国家共53个地点的土壤样品中培养酵母9,12。总共从3,826份土壤样品中分离出1,473株酵母菌株。鉴于这九个国家的气候条件不同，每个国家的最佳培养温度根据其年平均气温确定（表1）。由于在14 °C时酵母生长较慢，来自冰岛的土壤样品在滚筒摇床上额外培养48小时（总计96–120小时）。在固体培养基上培养2–3天后，所有样品的培养皿上均可观察到微生物生长（图1A）。对每块培养皿上出现的不同酵母形态，随机选取一个菌落，在新鲜培养皿上划线以获得单菌落（图1B）。
不同国家之间酵母分离的成功率存在差异（表1）。例如，从562份沙特阿拉伯土壤样本中培养出97株酵母（17.3%），而从300份加拿大土...

本方案是一种高效且快速的方法，可在短短7天内从大量土壤样本中培养酵母和烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。该方法可根据实验需求，轻松调整以适用于多种培养基和培养温度。

土壤蕴藏着极为丰富的微生物生命，每克土壤中可含有高达数十亿个细菌、古菌和真菌细胞。多细胞……

本方案通过采集不同气候区域的土壤样品，研究土壤中酵母菌和霉菌的多样性。该方法有助于了解环境中的酵母菌多样性，并追踪致病性物种。本方案提供了一种经济高效且快速的从土壤中分离酵母菌和霉菌的方法。土壤样品最快可在七天内完成全部处理并获得分离菌株。实验前做好充分准备，例如提前一天标记培养管并配制培养基，是避免实验过程中手忙脚乱的关键。首先准备一组无菌的13毫升培养管。用土壤样品编号进行标记后，使用血清移液管向每支试管中加入5毫升添加了氯霉素和苯来特的酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖培养液。在生物安全二级柜内，使用无菌木质扁头涂布棒将约0.1克土壤转移至相应的培养管中。将管盖拧紧至第一档位置，以防止泄漏，同时允许培养期间的气体交换。接下来，将培养管置于滚筒式培养箱中，在最适酵母生长的温度下孵育24小时。然后，在将上清液转移至固体培养基之前，用土壤样品编号标记添加了氯霉素和苯来特的酵母提取物蛋白胨葡萄糖琼脂平板。从滚筒式培养箱中取出培养管。然后在生物安全二级柜内，短暂涡旋离心管，使可能已沉降至管底的土壤颗粒和细胞重新悬浮。接着，使用微量移液器将100 µL上清液转移至培养皿中。用无菌可重复使用的涂布棒将液体在琼脂表面充分且均匀地涂布。在孵育两到三天以确保充分培养后，在生物安全柜中检查二级生物安全水平的平板上是否有酵母生长。观察呈乳白色、圆形、哑光状的酵母菌落，这些菌落可轻易与细菌和霉菌菌落区分开来。使用无菌的木质直头涂布棒，从每块平板上选取一个类似酵母的菌落。将每个挑选的菌落转移至添加了氯霉素和苯来特的新鲜酵母提取物蛋白胨葡萄糖琼脂平板上，划线分离单菌落。进行三次独立划线，每次划线均使用新的接种棒。随后，利用平板上生长的新鲜菌落进行菌落聚合酶链式反应。使用ITS1和ITS4引物扩增真菌条形码基因。将获得的酵母菌株内转录间隔区序列与公共数据库（如美国国家生物技术信息中心GenBank和UNITE）中已收录的两条序列进行比对，以确定物种分类。将土壤加入含有1毫升沙保葡萄糖肉汤的1.5毫升微量离心管中，在50摄氏度下培养2至4天。将菌丝从接种了土壤的肉汤转移至麦芽提取物琼脂平板时，首先识别已出现可见菌丝生长的土壤接种物，并将沙氏葡萄糖肉汤加入至气液交界面。然后使用灭菌的木质扁头涂布棒将菌丝转移至麦芽提取物琼脂平板的中心，并将这些麦芽提取物琼脂平板置于37°C条件下培养三天。在筛选具有烟曲霉形态特征的菌丝时，应识别具有典型绿色绒毛状生长特征的霉菌菌落。在生物安全二级操作柜内，使用无菌的木质平面尖头涂抹棒或接种环刮取一次菌落表面的分生孢子或菌丝体，并通过在琼脂表面划线的方式将其转移至麦芽提取物琼脂平板中央，以获得单菌落。将平板置于37°C条件下培养两天。使用无菌接种棒或接种环，将所获得的单菌落再次划线转接至麦芽提取物琼脂平板上进行继代培养。将收获的孢子均匀涂布于平板中央。配制无菌的30

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科研

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Biology

生物学

从土壤中分离可培养酵母和霉菌以研究真菌种群结构

市面上有标称为“可生物降解”的塑料薄膜，可用于农业覆盖地膜。耕作是一种具有吸引力的处置方式，但此类薄膜在田间条件下的降解过程尚不明确。本研究的目的是建立从田间掩埋后的塑料地膜上分离定殖的本土土壤真菌和细菌的方法。...

分离具有降解农业用可生物降解塑料地膜潜力的天然土壤微生物

黑粉菌会引起多种严重的农业病害。它们以休眠的冬孢子形式传播，这些冬孢子会响应环境信号而萌发。我们概述了两种研究萌发过程中分子变化的方法：通过测量呼吸作用的增强来检测代谢活化，以及通过在不同形态发育阶段分离冬孢子来评估分子事件的动态变化。...

利用微呼吸分析和显微解剖技术研究冬孢子萌发

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从土壤样品中分离与筛选昆虫病原真菌及其对害虫的致病力评估

从热带土壤样品中分离昆虫病原真菌菌落 Tenebrio 诱饵， 大蜡螟 诱饵，以及选择性人工培养基，即.添加氯霉素、噻苯咪唑和环己酰亚胺的酵母提取物增强马铃薯葡萄糖琼脂（CTC...

土壤样品中昆虫病原真菌分离方法的比较

本文介绍了一种用于筛选土壤生物多样性中参与难降解材料降解的真菌菌株的实验方案。首先，分离能够在腐殖酸或木质纤维素上生长的真菌菌株，随后通过酶学实验以及对烃类和塑料等污染物的降解能力测试其活性。...

从土壤生物多样性中分离与筛选降解难降解材料的真菌

由于土壤不透明，其内部微生物组分之间的相互作用难以在细胞分辨率下直接观察。本文介绍了两种微流控工具，为研究真菌-微生物相互作用提供了新的机会。这些装置用途广泛且操作简便，能够实现高时空控制，并在细胞水平上进行高分辨率成像。...

用于在细胞水平上探究真菌-微生物相互作用的微流控工具

本文旨在提供详细的实验方案，用于分离植物相关内生真菌、长期保存分离物、形态学表征，以及提取总DNA，以用于后续的分子鉴定和宏基因组分析。...

分离、鉴定及全基因组DNA提取以鉴定菌根异养植物中的内生真菌

本方案提供了详细的步骤，用于构建、灭菌、组装、使用以及重复利用真菌通道柱，以从多种环境基质中富集通过真菌通道相互作用的细菌-真菌配对。...

利用多样化环境与基质中的真菌高速公路柱研究细菌-真菌相互作用

本方案描述了一种分离芯片（iChip）的设计与使用方法，用于 原位 在其自然环境中培养顽固性土壤微生物。同时还描述了 原位 抗微生物物质产生菌的土壤细菌培养。该方案可经调整用于从不同生态位中分离具有其他理想特性的细菌。...

原位 分离与培养难培养土壤细菌的分离芯片（iChip）方法

本文描述了一种从土壤微生物群落中分离高分子量、高质量基因组DNA的方法。...

从土壤和沉积物中提取高分子量基因组DNA

学习从土壤样品中分离培养酵母和霉菌的高效方法，利用无菌培养技术和聚合酶链反应鉴定物种。该方案可在七天内快速分离Aspergillus fumigatus等真菌，助力研究环境酵母多样性与病原菌追踪。

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