从蜱 离体 唾液腺培养物和细胞外囊泡中分离microRNA

本方案描述了从蜱唾液腺和纯化的细胞外囊泡中分离microRNA。这是一种通用程序，结合了常用试剂和耗材。该方法还允许使用少量的蜱虫，从而产生易于测序的高质量microRNA。

该协议允许我们使用减少的蜱虫数量，从而降低菌落维护的成本并减少蜱虫喂养所需的椎骨动物数量。该协议大约需要 20 个即时报价。然而，除了使用小样本量之外，主要优点是该协议可以应用于多种蜱虫物种和不同的生命阶段。

除了蜱解剖或应用于宿主 - 寄生虫相互作用外，病原体感染对microRNA分泌的影响以及生理变化对蜱虫分泌的microRNA的影响。首先，通过将胎牛血清、磷酸色糖肉汤、10% 脂蛋白胆固醇浓缩物、5% 碳酸氢钠、HEPES 和 L15C300 培养基加入 26.3 毫升聚碳酸酯离心瓶中来制备无囊泡培养基，并根据需要调整体积。现在将培养基在4摄氏度下以100， 000倍G超速离心18小时。

小心地除去上清液而不干扰沉淀，并将上清液转移到新鲜的离心管中。再次超速离心管。取上清液并通过0.22微米过滤器以去除污染物。

将上清液移液到50毫升离心管中，并将其储存在零下20摄氏度直至需要或长达三年。在24孔培养板的每个孔中向500微升无囊泡培养基中加入适量的抗生素。现在，将PBS与利福平添加到不含无囊泡培养基的孔中，以防止细菌生长。

在解剖显微镜下将蜱虫放在带有双面地毯胶带的载玻片上。在解剖之前，将含有利福平的PBS加入蜱虫中，并使用四毫米的Vannas剪刀，在每个雌性的侧面做一个约一毫米的切口。现在，去除蜱的背侧和唾液腺，然后将20至40个蜱唾液腺放入500微升无囊泡培养基中，添加到24孔组织培养处理板中的单个孔中。

将唾液腺样品在32摄氏度下孵育24小时，以允许细胞外囊泡的分泌。在孵育结束时，将所有含有唾液腺的培养基移液到1.5毫升微量离心管中，并在4摄氏度下以300倍G离心10分钟。将上清液转移到新的1.5毫升微量离心管中。

稍后将含有唾液腺的沉淀重悬于RNA中，并在零下80摄氏度下储存，直到使用或无限期使用。现在，通过将上清液在4摄氏度下以2， 000倍G离心10分钟来除去细胞碎片，并将上清液移液到新的1.5毫升微量离心管中。接下来，在4摄氏度下以10， 000倍G离心30分钟以除去凋亡小体和较大的细胞外囊泡，并将上清液转移到新鲜的1.5毫升微量离心管中。

然后将一微米尼龙注射器过滤器组装在10毫升注射器上，并将其保持在超速离心管上。然后加入样品并用10毫升PBS填充注射器。将上清液通过过滤器进入管中。

过滤和平衡试管后，将它们放入 70 Ti 转子中，并在 100， 000 倍 G 下在 4 摄氏度下超速离心管 18 小时。浓缩的细胞外囊泡在超速离心后形成沉淀。在不干扰沉淀的情况下除去上清液，并将沉淀重悬于PBS中。

将500微升细胞外囊泡移液到300K离心过滤器中，并在环境温度下以8， 000倍G离心10分钟，并重复此过程，直到过滤所有细胞外囊泡。最后，向色谱柱中加入400微升灭菌的PBS并充分混合以去除附着在膜上的细胞外囊泡。然后将样品放入1.5毫升DNAase Free RNAse管中。

细胞外囊泡的浓度和大小根据雌性、雄性和若虫的生物学重复之间的蜱的性别和生命阶段而变化。对于所有合并的生物学重复，观察到相似的结果。对从唾液腺分离的小RNA的分析显示出与核糖体RNA和microRNA对应的条带。

然而，从唾液腺分离的囊泡中不存在核糖体RNA，从细胞外囊泡纯化的microRNA样品显示出更多的降解。富集后，从EV纯化的microRNA样品显示出最小的降解和足够的microRNA浓度用于cDNA文库合成。获得cDNA文库制备后，预期的条带大小约为150个碱基对，这意味着RNA cDNA文库很小。

在无囊泡制备过程中，请确保遵循防止外部囊泡污染的步骤。在孔板制备过程中，确保添加抗生素以防止蜱虫微生物组的细菌污染。使用该协议提取的microRNA可用于分析和功能实验，以验证microRNA的作用，例如预测microRNA途径靶标，抑制和模拟实验。