Name: 从蜱 离体 唾液腺培养物和细胞外囊泡中分离microRNA (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 学习从蜱唾液腺培养物及细胞外囊泡中分离microRNA的实验方法。该方案仅需约20只蜱，适用于多种蜱种及不同发育阶段，可获得高质量microRNA用于测序分析。

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我们非常感谢德克萨斯州埃丁伯格牛蜱实验室提供的协助。我们谨向迈克尔·摩西斯（Michael Moses）、杰森·蒂德韦尔（Jason Tidwell）、詹姆斯·赫勒姆斯（James Hellums）、塞萨里奥·阿加多（Cesario Agado）和霍默·巴斯克斯（Homer Vasquez）表示感谢。我们还要感谢萨拉·夏普顿（Sarah Sharpton）、伊丽莎白·洛斯特罗（Elizabeth Lohstroh）、艾米·菲利普（Amy Filip）、凯尔西·约翰逊（Kelsey Johnson）、凯莉·科奇坎（Kelli Kochcan）、安德鲁·希尔豪斯（Andrew Hillhouse）、查鲁兹·阿罗乔·罗萨里奥（Charluz Arocho Rosario）和斯蒂芬妮·古兹曼·瓦伦西亚（Stephanie Guzman Valencia）在项目全程中的帮助。我们谨向德克萨斯农工大学（Texas A&amp;#38;M 农学院女性昆虫学家（AWE）写作小组在本文撰写过程中提供的帮助与建议。以下试剂由美国疾病控制与预防中心提供，经 BEI Resources（NIAID，NIH）分发： Ixodes scapularis 成年（活体），NR-42510。雌性 I. scapularis 蜱虫还来自俄克拉荷马州立大学的蜱虫饲养设施。该项目由德克萨斯农工大学资助&amp;#38;M 大学 T3：用于转化资助的三联体，以及美国农业部农业研究局（USDA-ARS）授予 AOC 的合作协议 #58-3094-1-003。

所有动物实验均依照德克萨斯农工大学机构动物照护与使用委员会（AICUC）批准的动物使用方案（AUP#2020-0026）进行&amp;#38;M 大学。蜱虫物种， Ixodes scapularis&#160;和 微小牛蜱（Rhipicephalus (Boophilus) microplus），本研究使用了42至72日龄的新西兰雄性白兔。 I. scapularis 来自疾病控制中心（CDC）和俄克拉荷马州立大学，经认证无病原体。&#160;R. microplus 在中国台湾的Edinburg，Tx的牛蜱热研究实验室饲养。兔子来自商业来源（参见 材料表该方案可通用性地从不同蜱种、不同生活阶段及不同组织中分离出细胞外囊泡和miRNA。
1. 雌性I. scapularis的饲养与包囊制备
<ol>
	<li>按照硬蜱饲喂兔子的程序制备乙烯-醋酸乙烯酯泡沫胶囊45。在兔子的每侧肩胛骨处各放置一个胶囊，每次感染共使用两个胶囊。 
	注：简而言之，这些胶囊由两块乙烯-醋酸乙烯酯泡沫组成，中间留有空腔。其中一块泡沫使用组织粘合剂粘贴于动物（本实验中为兔子）背部（参见材料表）。将细网筛粘贴在第二块泡沫上，以防止蜱逃逸。使用自粘搭扣带将两块泡沫封闭固定。</li>
	<li>在将胶囊粘贴至兔子体表前，先静置24小时。泡沫胶囊可在室温下保存。 
	&#8203;注：胶囊可在室温下长期保存。</li>
	<li>将胶囊粘贴于已剃毛至皮肤的兔子体表，放置24小时后再进行蜱感染。</li>
</ol>
2. 无囊泡培养基的制备
<ol>
	<li>制备无囊泡培养基13，加入0.5 mL胎牛血清、0.5 mL胰蛋白胨磷酸盐肉汤、0.1 mL 10%脂蛋白-胆固醇浓缩液、0.5 mL 5%碳酸氢钠（NaHCO₃）3)，0.25 mL 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和 8.125 mL L15C300 培养基（参见 材料表根据需要调整培养基体积，将培养基加入26.3 mL聚碳酸酯离心管中。</li>
	<li>将离心管之间的重量差异控制在最大0.01 g以内，以确保超速离心机的正常运行。</li>
	<li>在 100,000 × g 条件下超速离心培养基 18 小时 g 在 4 °C 下。移除上清液 通过 移液，小心操作，避免扰动任何已形成的沉淀。</li>
	<li>将上清液转移至新的离心管中，再次以100,000 x g超速离心18小时 g 在 4 °C 下，保持适当平衡。</li>
	<li>分离剩余上清液，经0.22 µm注射器滤器过滤以去除污染物。用移液器将上清液转移至50 mL离心管中。</li>
	<li>将上清液储存于 -20 °C 冰箱中，直至后续使用或最长可保存 3 年。</li>
</ol>
3. 兔子侵扰
<ol>
	<li>剪去一个10 mL注射器的顶部，并使用标准画笔装载成年I. scapularis雌性蜱虫。</li>
	<li>用无菌纱布覆盖注射器开口（图1）。</li>
	<li>将兔子水平放置在实验台或工作台面上；用毛巾将兔子紧密包裹，并遮盖双眼，仅暴露已准备好的胶囊（步骤1.1），以便用蜱虫感染兔子。</li>
	<li>打开胶囊，通过推动注射器推杆将蜱虫送入，将蜱虫放置于靠近兔子皮肤的位置。迅速关闭胶囊，防止蜱虫逃逸。</li>
	<li>根据实验设计，让雌性蜱虫吸血至所需时间。雄性Ixodes scapularis在胶囊中停留时间不得超过24小时，以避免脱水。 
	&#8203;注意：感染动物所用蜱虫的数量由研究人员自行决定。本方案每次感染使用约100只蜱虫，以弥补死亡率并确保获得足够的重复样本材料。初步实验确定，每个重复至少需要20只蜱虫，才能获得足量材料用于miRNA测序。</li>
</ol>
4. 移除已吸血的雌虫
<ol>
	<li>使用气体扩散器，将感染的兔子置于2%异氟烷的氧气环境中进行麻醉，氧气流速设定在700-1000 L/min之间。 
	注意：可使用其他麻醉剂以避免动物产生痛苦或不适。</li>
	<li>用精细镊子夹住蜱虫的口器部分，尽可能贴近皮肤，将已吸血的雌性蜱虫移除。确保完全清除口器，以避免细菌感染。</li>
	<li>将蜱虫放入15 mL离心管中。</li>
	<li>用70%乙醇清洁叮咬部位，并涂抹少量三联抗生素（ fingertip worth，参见材料表），以预防蜱虫叮咬部位发生感染。</li>
	<li>将蜱虫运送至实验室进行解剖（步骤5）。应在移除蜱虫后的24-48小时内完成解剖，以避免唾液腺降解15,43。</li>
</ol>
5. 唾液腺解剖与细胞外囊泡分泌
<ol>
	<li>向每个孔中加入 500 µL 无囊泡培养基（步骤 2），并加入 5 µL 100 倍青霉素、5 µL 100 倍链霉素、5 µL 10 mg/mL 利福平和 5 µL 100 倍两性霉素（参见材料表）。对于不含无囊泡培养基的孔，加入含利福平的 1× PBS，以防止细菌生长。</li>
	<li>用双面地毯胶带将蜱虫固定在透明的显微镜玻片上，并置于解剖显微镜下。为防止组织干燥，在解剖前向每只蜱虫加入 10 µL 1× PBS。</li>
	<li>使用 4 mm 眼科剪刀（参见材料表），在每只雌蜱侧面做约 1 mm 的小切口。完全移除蜱虫的背侧部分（图 2），并取出两侧唾液腺。</li>
	<li>将 20–40 对蜱虫唾液腺放入 24 孔组织培养板的一个孔中，孔内已加入 500 µL 无囊泡培养基（图 3）。</li>
	<li>将唾液腺样本在 32 °C 下孵育 24 小时，以促进细胞外囊泡（EVs）的分泌。</li>
</ol>
6. 细胞外囊泡的分离
<ol>
	<li>孵育24小时后，用移液器将含有唾液腺的全部培养基转移至1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>将样品在 300 x g 4 °C 下离心 10 分钟以分离唾液腺。此步骤将分为两相：（1）含有细胞外囊泡（EVs）的上清液，以及（2）唾液腺（沉淀）。</li>
	<li>为了继续分离EVs，将上清液用移液器转移至新的1.5 mL微量离心管中。将含有唾液腺的沉淀（步骤6.2）重悬于500 µL RNAlater中（参见 材料表）并保存于 -80 °C，直至使用或长期保存。 
	注意：这些唾液腺将在第8步用于miRNA提取。</li>
	<li>将上清液在2000 x g条件下离心 g 在 4 °C 下离心 10 分钟以去除细胞碎片。用移液器将上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。弃去沉淀。</li>
	<li>将上清液在10,000 x g条件下离心 g 在4 °C下离心30分钟，以去除凋亡小体和较大的细胞外囊泡。弃去沉淀，将上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>将一支10 mL注射器连接至一个1 µm尼龙注射式滤器。将注射器和滤器置于超速离心管上方图 4A）。然后加入样品（图4B）并用10 mL 1×PBS填充注射器（图4C），并相应地平衡离心管（图4D).</li>
	<li>将离心管放入70Ti转子中（参见 材料表）并在 100,000 x g 4 °C下孵育18小时。</li>
	<li>超速离心18小时后，观察试管底部出现沉淀图5沉淀物即为浓缩的细胞外囊泡。</li>
	<li>去除上清液的90%-100%，注意不要重新悬浮EV沉淀。用1×PBS重悬沉淀。若无法完全去除上清液，则使用剩余的上清液重悬沉淀。</li>
	<li>将500 µL的EV沉淀/上清液用移液器转移至300 K离心滤器中（参见 材料表). 
	注意：此步骤将去除所有非囊泡相关蛋白、miRNA 及其他分子，而囊泡则无法通过滤膜。</li>
	<li>以 8,000 x g 离心 g 在室温下孵育10分钟。重复步骤6.10，直至所有EV沉淀/上清液均通过滤膜。</li>
	<li>向柱中加入 400 µL 灭菌的 1x PBS，充分混匀 通过 用移液器去除附着在膜上的细胞外囊泡。将样品放入1.5 mL无DNase/RNase的离心管中。样品可于-80 °C长期保存，直至使用。避免反复冻融，以防样品降解。 
	&#8203;注意：从超速离心机中取出离心管后应立即置于冰上，以防止细胞外囊泡（EV）降解。最终样本为含有400 µL 1×PBS的EV沉淀。其中25 µL用于纳米颗粒追踪分析（NTA，步骤7），375 µL用于miRNA提取（步骤8）。</li>
</ol>
7. 纳米颗粒示踪分析（NTA）
<ol>
	<li>取25 µL终末样品（步骤6.12），加入375 µL的1x PBS。</li>
	<li>将稀释后的样品加入1 mL无针头注射器中，并牢固拧紧至NTA仪器的光学镜头上。</li>
	<li>根据需要调整参数设置，并依据设定偏好采集视频。 
	注意：本研究中每次采集60秒，共采集三次读数。每次NTA读数代表一个技术重复。相同吸血蜱取样时间下的不同样品代表独立的生物学重复。相机增益设为7级，检测阈值设为5级。</li>
	<li>使用以下公式估算最终EV数量： 
	（起始EV浓度 × 稀释倍数）×（样品管中剩余总体积）/ 1000 = 样品中EV总数 
	注意：体积需除以1000，因为NTA输出结果单位为每毫升浓度（个/mL）。</li>
</ol>
8. 从唾液腺和细胞外囊泡中提取miRNA
<ol>
	<li>加入100 µL裂解试剂（参见 材料表) 加入步骤 6.12 剩余的样品中，并用灭菌研杵充分匀浆图6).</li>
	<li>加入剩余的600 µL裂解试剂，室温孵育5分钟。</li>
	<li>加入140 µL氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3分钟。</li>
	<li>12,000 x g 离心 g 4 °C 下孵育 15 分钟。</li>
	<li>用移液器将上层透明相转移至新的1.5 mL离心管中，注意避免触及中间相。预计可获得约525 µL样品体积。随后，加入等体积的100%分子生物学级乙醇。</li>
	<li>将700 µL样品加入RNA提取离心柱中（参见 材料表).</li>
	<li>8,000 x g 离心 g 室温下静置30秒，弃去穿流液。</li>
	<li>用700 µL RTE缓冲液洗涤样品（参见 材料表），在8,000 x g 30 秒后，弃去穿流液。</li>
	<li>用500 µL RPE缓冲液洗涤样本（参见 材料表），在8,000 x g 30 秒后，弃去穿流液。</li>
	<li>加入500 µL 80%分子生物学级乙醇，8,000 x g离心 g 2 分钟后弃去流出液。</li>
	<li>以最大转速离心5分钟，以干燥膜。弃去收集管，将柱子置于新的1.5 mL微量离心管上。</li>
	<li>加入14 µL无RNase/DNase的水至膜上，室温孵育5分钟。</li>
	<li>在 21,000 x g 条件下离心 g 室温下持续1分钟。</li>
	<li>加入1 µL RNase抑制剂（参见 材料表) 加入洗脱的miRNA中，充分混匀 通过 移液器 
	注意：在从唾液腺中提取miRNA之前，加入1 ml 1×PBS（1:1体积），通过最大转速在4 °C下离心15分钟，以去除任何RNAlater。此步骤需重复三次，或直至唾液腺组织充分沉淀以便移除上清液。此时，样品代表了大小约为20–150 bp的小RNA混合物补充图1).</li>
</ol>
9. 测定miRNA浓度
<ol>
	<li>测定小RNA的浓度 通过 一种市售的RNA检测试剂盒41 （参见 材料表).</li>
	<li>在每个试管中，根据试剂盒说明书，每份样品加入199 µL稀释缓冲液（按样品提供组分A和B）、1 µL用于miRNA检测的特异性荧光染料（检测波长260 nm，按样品）以及2 µL小RNA（步骤8）。</li>
	<li>在读取样本管之前，先读取试剂盒中提供的预稀释miRNA标准品1和标准品2，以在样本检测前建立标准曲线。 
	注意：标准品用作比较工具，以确定样品中测得的miRNA浓度。</li>
	<li>将每个标准品和样品管放入专用荧光计中（参见 材料表) 以测定浓度，单位为 ng/µL。</li>
</ol>
10. 确定 miRNA 质量
<ol>
	<li>确定miRNA及其他小RNA的质量 通过 使用生物分析仪进行凝胶电泳46，按照制造商的说明进行（参见 材料表).</li>
	<li>在样品检测前，将各样品归一化至相同浓度。</li>
	<li>通过小RNA芯片读取样品41,46，按照制造商的说明进行操作（参见 材料表). 
	&#8203;注意：为了确定miRNA的质量，凝胶图像（条带）和电泳图谱（峰）是评估样本质量的指标。凝胶中条带越深，表明miRNA质量越好；条带越浅（或无条带），则表明质量较差或样本已降解46,47.</li>
</ol>
11. microRNA 富集
<ol>
	<li>使用小RNA测序试剂盒，按照小RNA样本制备试剂盒的制造商说明书进行miRNA富集（参见 材料表).</li>
	<li>用3'腺苷酸化接头连接每个样本，并去除过量的接头 通过 珠纯化。接着，连接5'接头，并通过珠纯化去除过量接头48. 
	注意：用于纯化的接头和磁珠均来自第11.1节的小RNA测序试剂盒（参见 材料表).</li>
	<li>为了合成第一条链，准备一个主混合液，包含已连接双端接头的样品、RT缓冲液以及试剂盒中提供的M-MuLV逆转录酶（参见 材料表随后，将混合物在42 °C孵育30分钟，再在90 °C孵育10分钟。接着按照说明书进行样品纯化。</li>
	<li>使用试剂盒中提供的RT上游引物和通用下游引物扩增第一条链（参见 材料表) 通过 常规聚合酶链式反应（PCR）：95 °C 预变性 2 分钟，然后进行 12–25 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 20 秒、60 °C 退火 30 秒、72 °C 延伸 15 秒，最后 72 °C 终延伸 2 分钟。 
	注意：PCR 产物大小预计约为 150 bp（图7).</li>
	<li>检测PCR产物的质量 通过 按照制造商说明使用 TapeStation（参见 材料表).</li>
	<li>使用下一代测序系统（75个循环）对样本进行测序，具体操作遵循制造商说明书（参见 材料表). 
	&#8203;注意：在文库构建之前，必须对样本的数量和质量进行检测（步骤9-10），以确保miRNA富集效果。</li>
</ol>
12. 生物信息学分析
<ol>
	<li>使用miRNA鉴定的整合应用工具来鉴定保守和特有的miRNA。 
	注意：在本研究中，miRNA 的鉴定是通过以下方法进行的 通过 miRDeep249,50miRDeep2 是一个免费的在线目录，收录了在多种物种中发现的所有已鉴定的保守型及新型miRNA。49,50 （参见 材料表).</li>
	<li>使用软件集成的比对工具将测序读段比对至相应基因组。</li>
	<li>将以下参数输入到映射模块中。
	<ol>
		<li>切除第11.2步中添加的接头序列，去除长度短于18个核苷酸的序列，并去除冗余的读段序列。</li>
		<li>如果文件不是 FASTA 格式，则使用解析为 FASTA 格式的参数转换文件49.</li>
		<li>将过滤和修剪后的序列比对到相应的基因组。若目标物种无可用基因组，则比对至最近缘的同源物种。</li>
		<li>显示输出文件为 &#34;reads.fa&#34; 和 &#34;reads_vs_genome.arf&#34;。该 &#34;read.fa&#34; 将仅包含非冗余序列读段，以及 &#34;reads_vs_genome.arf&#34; 将包含比对到基因组的已映射读段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用步骤12.2产生的两个输出文件，利用软件内置的定量工具进行miRNA表达谱分析。
	<ol>
		<li>从 miRBase 下载目标物种的 miRNA 前体序列和成熟 miRNA 序列51,52,53,54,55,56. 如果目标物种没有前体或成熟序列，请下载 &#34;hairpin.fa.gz&#34; 和 &#34;mature.fa.gz&#34; 包含 miRBase 上所有可用生物体的全部前体及成熟序列。</li>
		<li>解压 &#34;hairpin.fa.gz&#34; 和 &#34;mature.fa.gz&#34; 文件。</li>
		<li>输入 &#34;reads.fa&#34; 和 &#34;read_vs_genome.arf&#34; 第12.3.4节的压缩文件和第12.4.2节的未压缩文件</li>
		<li>读取输出文件 &#34;outputname.csv&#34;,&#34;outputname.html&#34;，以及 &#34;outputname.pdf&#34;输出文件名可根据研究者自行设定。 
		注意： &#34;outputname.csv&#34; 文件将包含表达谱信息。具体而言，表达谱将包括miRNA ID、所有样本中比对到该miRNA的读段总数、每个样本中比对到特定miRNA的读段数，以及对应成熟miRNA的前体ID。 &#34;outputname.html&#34; 来自步骤12.4.4的结果将包含指向加州大学圣克鲁兹基因组浏览器（USCS）、美国国家生物技术信息中心（NCBI）以及miRBase的链接。USCS和NCBI将提供当前前体序列针对非冗余核苷酸数据库的比对结果，而miRBase则包含当前miRNA前体的相关信息。 &#34;outputname.pdf&#34; 将具有所表达miRNA的RNA二级结构以及前体序列的比对结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 miRDeep2 鉴定特异性和保守性 miRNA。
	<ol>
		<li>使用第12.3.4步和第12.4.2步的输出文件作为输入文件。 
		注意：读取为 &#34;outputname.html&#34; 将包含样本中独特且保守的miRNA的预测结果。</li>
		<li>使用评分 &#62;1 用于 miRNA 表达谱分析及评分 &#62;4 进行进一步的实验分析，例如 miRNA 抑制及模拟内源性 miRNA34,36,57.</li>
		<li>根据以下标准从 miRBase 中筛选并鉴定独特的 miRNA：miRDeep2 得分（步骤 12.5.3）、真实概率估计（&#62;90%），显著的 randfold p 值（&#60;0.05)49,50,56. 
		注意：生物信息学分析已完成 通过 在 Cyverse 发现环境中的 miRDeep258,59一个用于生物信息学分析的免费在线平台。通过miRDeep2鉴定出的保守性和特异性miRNA将与miRBase中所有物种的miRNA进行比对。未来的miRDeep2鉴定可与目标物种相应的基因组进行比对。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案详细介绍了从蜱虫唾液腺及细胞外囊泡（EVs）中提取miRNA的具体方法。然而，在操作过程中需注意若干重要事项，这些事项已在本方案各部分的备注中详述。在蜱虫吸血期间，必须固定好胶囊和网状外罩，以防止蜱虫逃逸。胶囊的制备与放置方法参见Koga等人的研究40。若某个样本不符合要求而被弃用，则需要进行多次蜱虫解剖的重复实验。此外，在从蜱虫组织中分离EVs时，可能会遇到多种挑战18,20,43。例如，解剖过程中应始终保持组织湿润，以防干燥，这可通过在解剖过程中持续添加PBS来实现。用于器官解剖和培养的PBS及培养基均应添加抗生素，以避免蜱虫微生物组引起的细菌污染60。所用抗生素应能同时靶向革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，因为这两类细菌均可能存在于蜱虫组织中。同样，在解剖过程中需谨慎操作，以尽量减少其他器官组织的交叉污染。因此，解剖操作应缓慢进行，随着操作者经验的积累...

蜱是外寄生虫，可将多种病原体传播给野生动物、家畜、人类及其宠物1,2。蜱的吸血行为会导致严重的经济损失，包括造成皮肤损伤、因严重贫血导致体重下降和产奶量减少，以及传播可能致命的致病性病原体1,3,4,5。目前控制蜱种群的主要方法依赖于杀螨剂的使用。然而，寄生在家畜身上的蜱对杀螨剂抗性的持续出现5,6、蜱叮咬事件的增加7，以及在居民区范围内病原体的传播8,9，促使人们亟需开发新型的蜱防控替代方案。
蜱虫的唾液腺是确保其生物学成功的关键器官。唾液腺由不同类型的腺泡（I、II、III 和 IV 型）构成，具有多种生理功能。唾液腺通过分泌唾液，在离宿主和附着宿主期间均发挥渗透调节作用，将多余的水分和铁排出至宿主via salivation2,10。I 型腺泡还通过分泌亲水性唾液，参与从大气中吸收水分10,11。效应蛋白（如粘附蛋白和胱抑素）在 II 型和 III 型腺泡的分泌细胞内合成10,12。I 型腺泡不影响蜱的吸血过程，表明血液摄取不会引发此类腺泡的形态和生理变化13,14。另一方面，II 型和 III 型腺泡在吸血过程中被激活，而在附着前几乎无活性。因此，吸血是触发 II 型腺泡内分泌细胞增大以及生物活性物质生成的必要条件。III 型腺泡在吸血期间因分泌颗粒内的物质释放而体积缩小12。
唾液腺也是蜱体内病原体感染的部位以及传播途径。在吸血过程中，蜱会分泌多种具有药理作用的化合物，以确保成功完成吸血过程10,15,16。这些化合物具有抗炎、免疫抑制和血管舒张特性10,15,17。近期研究表明，来源于蜱唾液腺的细胞外囊泡（EVs）含有多种此类化合物，可诱导产生抗炎和免疫调节效应18,19,20。&#34;细胞外囊泡&#34;是一个统称术语，用于描述根据大小和生物发生方式被分类为外泌体和微囊泡的囊泡。总体而言，EVs 是具有双层膜结构的脂质小泡，大小约为 40 nm–1 µm21；通常，外泌体的大小为 40–150 nm，而微囊泡的大小介于 150 nm–1 µm 之间21,22,23。然而，大小并不能明确指示 EVs 的生物发生途径22。
外泌体的生物发生始于质膜的连续内陷。这种内陷导致多泡体的形成，最终通过ESCRT复合物或鞘磷脂酶（sMases）的作用引起囊泡膜的变形。24,25外泌体可被溶酶体降解以维持细胞稳态，或排出细胞外 通过 囊泡与质膜融合，将细胞组分递送至受体细胞21,24另一方面，微囊泡是由flippases和floppases作用形成的，这些酶会改变质膜中脂质的构象。26细胞外囊泡（EVs）在细胞间通讯中至关重要，可作为细胞内物质（如脂质、蛋白质、核酸和微小RNA（miRNAs））的运输系统。21,27,28这些囊泡被转运后，将其内含物递送至受体细胞的细胞质中，从而在受体细胞中引发表型改变22,29由于细胞外囊泡在蜱虫吸血以及调控宿主免疫和伤口愈合反应中的重要作用18,20细胞外囊泡内的 cargo 是开发抗蜱药物的潜在靶点，并提供了一种独特的机制来干扰蜱的取食过程。这包括蜱唾液腺及唾液腺来源的细胞外囊泡中的 miRNA。
miRNA 是一类短的非编码序列，长度约为 18–22 个核苷酸（nt），可在转录后水平调控、降解或沉默 mRNA 序列30,31。在转录过程中，pri-miRNA 被 Dicer（RNA 聚合酶 III）切割，形成特征性的发夹样结构，成为 pre-miRNA。pre-miRNA 再由 Drosha（RNA 聚合酶 III）再次切割，形成成熟的 miRNA 双链。成熟的 miRNA 序列会整合到 RNA 诱导的沉默复合体（RISC）中，并与靶 mRNA 序列互补配对，导致翻译抑制或 mRNA 降解28,30,32。在蜱摄食过程中，蜱唾液中的 miRNA 可调节宿主基因表达，以抑制免疫反应并促进病原体传播33,34,35,36,37。尽管目前关于细胞外囊泡（EVs）和 miRNA 的研究已十分广泛，但它们在蜱-宿主界面摄食过程中的具体作用仍不清楚。优化能够简便地分离和纯化高质量 miRNA 的实验方案，对于深入理解这些领域至关重要。
可采用多种方法分离细胞外囊泡（EVs），例如超速离心法、外泌体沉淀法、聚合物沉淀法、免疫亲和层析法以及基于尺寸排阻的技术38然而，这些技术无法区分外泌体与微囊泡。因此，如前所述，在从不同样本中分离细胞外囊泡时，通常使用EV作为统称。本文所述实验中分离得到的囊泡代表了来源于不同生物发生途径的囊泡混合物。通过使用包被有针对特定囊泡亚群特异性标志物（例如外泌体标志物、肿瘤标志物）抗体的磁珠进行免疫沉淀，可进一步纯化特定的细胞外囊泡亚群39,40miRNA 也可以被提取 通过 不同市售的分离试剂盒7,41,42.
本项目的目标是建立一种联合常用方法的实验方案，用于从细胞外囊泡（EVs）及摄食后蜱虫唾液腺中分离EVs并提取miRNA。由于生物活性物质的分泌在蜱虫摄食过程中被激活12，因此需允许蜱虫摄食，以鉴定可能在调控宿主免疫反应和伤口愈合过程中发挥重要作用的miRNA。本方案仅需少量蜱虫（20只）即可完成EVs及其相应miRNA的分离，相较之前报道的需要2000只蜱虫的研究具有显著优势43。此外，本方案避免了使用匹鲁卡品刺激引起的唾液分泌物污染44，从而防止其对研究EVs及其miRNA对宿主细胞作用的实验造成干扰。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>GenClone</td><td>25-240</td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;micro;m 尼龙注射器滤器</td><td>Tisch Scientific</td><td>283129028</td><td></td></tr><tr><td>1 英寸黑色粘合剂</td><td>Amazon</td><td>B00FQ937NM</td><td>胶囊</td></tr><tr><td>10 mL 无针注射器</td><td>Exelint</td><td>26265</td><td></td></tr><tr><td>3' 和 5' 接头</td><td>Illumina</td><td>20024906</td><td>NEXTFLEX 小RNA测序试剂盒</td></tr><tr><td>4 mm Vannas 剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.1523</td><td></td></tr><tr><td>70Ti 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>磁珠</td><td>Illumina</td><td>20024906</td><td>NEXTFLEX 小RNA测序试剂盒</td></tr><tr><td>生物分析仪</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>生物分析仪试剂盒</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5425 离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Macron</td><td>UN1888</td><td></td></tr><tr><td>Cyverse 发现环境</td><td></td><td></td><td>https://cyverse.org/discovery-environment</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>双面地毯胶带</td><td>amazon</td><td>&amp;lrm;286373</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon 管</td><td>VWR</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>FBS-02-0050</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Excelta</td><td>5-S-SE</td><td></td></tr><tr><td>2 mm 泡沫塞</td><td>Amazon</td><td>B004M5QGBQ</td><td>胶囊</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Phoenix Pharmaceuticals 生产</td><td>193.33165.3</td><td></td></tr><tr><td>Ixodes scapularis</td><td>CDC, 俄克拉荷马州立大学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L15C300 培养基</td><td>实验室自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脂蛋白-胆固醇浓缩物</td><td>MPI</td><td>02191476-CF</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>10118-596</td><td></td></tr><tr><td>miRDeep2</td><td></td><td></td><td>https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2</td></tr><tr><td>M-MuLV 逆转录酶</td><td>Illumina</td><td>20024906</td><td>NEXTFLEX 小RNA测序试剂盒</td></tr><tr><td>分子级乙醇</td><td>Fischer Bioreagents</td><td>UN1170</td><td></td></tr><tr><td>24 孔细胞培养板（多孔板）</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>纳米颗粒追踪分析仪</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 带 300K Omega 滤膜</td><td>Pall Corporation</td><td>OD3003C33</td><td></td></tr><tr><td>NEXTFLEX 小RNA测序试剂盒 v3</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 高输出试剂盒（75 个循环）</td><td>Illumina</td><td>20024906</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN 90 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>ICN19453780</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Ependorff</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯离心瓶</td><td>Beckman Coulter</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen miRNeasy 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td></td></tr><tr><td>QIAzol 裂解试剂</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 荧光计</td><td>Thermofisher</td><td>Q32880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 试剂盒</td><td>Thermofisher</td><td>Q10212</td><td></td></tr><tr><td>家兔</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>通用逆转录引物</td><td>Illumina</td><td>20024906</td><td>NEXTFLEX 小RNA测序试剂盒</td></tr><tr><td>Rhipicephalus microplus</td><td>牛蜱热病研究实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>利福平</td><td>Fischer Bioreagents</td><td>215544</td><td></td></tr><tr><td>RNA later</td><td>Invitrogen</td><td>833280</td><td></td></tr><tr><td>无RNase管</td><td>VWR</td><td>87003294</td><td></td></tr><tr><td>RNase抑制剂</td><td>Thermo Fischer</td><td>11111729</td><td></td></tr><tr><td>无RNase/DNase水</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute 离心柱</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>Qiagen miRNeasy 试剂盒</td></tr><tr><td>RPE 缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>Qiagen miRNeasy 试剂盒</td></tr><tr><td>RT 缓冲液</td><td>Illumina</td><td>20024906</td><td>NEXTFLEX 小RNA测序试剂盒</td></tr><tr><td>RT 正向引物</td><td>Illumina</td><td>20024906</td><td>NEXTFLEX 小RNA测序试剂盒</td></tr><tr><td>RTE 缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>Qiagen miRNeasy 试剂盒</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST16 离心机</td><td>Thermo Fischer</td><td>75004380</td><td></td></tr><tr><td>灭菌纱布海绵</td><td>Covidien</td><td>2187</td><td></td></tr><tr><td>灭菌PBS</td><td>Sigma</td><td>RNBK0694</td><td></td></tr><tr><td>链霉素</td><td>thermofischer Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Aligent</td><td>G2991BA</td><td></td></tr><tr><td>Tear Mender 瞬干织物与皮革粘合剂</td><td>Amazon</td><td>7.42836E+11</td><td>胶囊</td></tr><tr><td>组织粘合剂</td><td>3M VetBond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三重抗生素</td><td>dechra</td><td>17033-122-75</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨磷酸盐肉汤</td><td>BD</td><td>BD 260300</td><td></td></tr></tbody></table>

蜱虫中微小rna的分离

关键词：微小rna，蜱虫，rna提取，分子生物学，非编码rna 离体 唾液腺培养与细胞外囊泡

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

蜱虫是重要的体外寄生虫，可传播多种病原体。蜱虫的唾液腺对其取食过程至关重要，因为其唾液中含有多种具有药物特性的效应分子，能够抑制宿主免疫反应并促进病原体传播。其中一类效应分子为微小RNA（miRNAs）。miRNAs是一类短的非编码RNA序列，可在蜱-宿主相互作用界面及蜱虫体内器官中调控宿主基因表达。这些小分子RNA通过蜱虫唾液被输送至宿主体内 通过 细胞外囊泡（EVs），在细胞间和细胞内通讯中发挥重要作用。含有miRNA的囊泡已在蜱虫唾液中被发现。然而，关于蜱虫唾液囊泡及唾液腺中miRNA的谱型及其功能，目前所知甚少。此外，对蜱虫唾液中囊泡和miRNA的研究需要繁琐的步骤来收集蜱虫唾液。本方案旨在建立并验证一种从纯化的蜱虫细胞外囊泡中分离miRNA的方法 离体 器官培养。本文描述了从细胞外囊泡和蜱唾液腺中提取miRNA所需的材料与方法。

本方案提供了从唾液腺和细胞外囊泡（EVs）中提取miRNA的详细方法。根据实验结果，该方法适用于从两种不同蜱类成虫中分离miRNA。 I. scapularis 和 R. microplus，也可能适用于其他蜱类物种。EVs 的浓度（颗粒数/mL）进行了测定 通过 NTA。对于 R. microplus，每种性别和发育阶段均包含三个生物学重复，每个生物学重复进行三次技术重复测定。样品按性别和发育阶段分别处理图8以显示各样本内的变异情况。随后，合并样本以展示变异情况并利用双因素方差分析（two-way ANOVA）和Tukey多重比较检验进行统计学差异分析。20 (p-值 = &#60; 0.05) (图9每个样本包含约40对从20只雌性、雄性及若虫中解剖获得的唾液腺。在分离并定量细胞外囊泡（EVs）后，样本用于小RNA的纯化。
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本方案描述了从蜱虫唾液腺及纯化的细胞外囊泡中分离microRNA的方法。该方法是一种通用流程，结合了常用的试剂和耗材。该方法还可使用少量蜱虫样本，获得高质量的microRNA，可直接用于测序。

蜱虫中微小RNA的分离

关键词：微小RNA，蜱虫，RNA提取，分子生物学，非编码RNA 离体 唾液腺培养与细胞外囊泡

蜱虫是重要的体外寄生虫，可传播多种病原体。蜱虫的唾液腺对其取食过程至关重要，因为其唾液中含有多种...

本方案使我们能够减少蜱虫的使用数量，从而降低种群维持成本，并减少用于蜱虫饲喂的脊椎动物数量。本方案大约需要20只蜱虫。然而，除使用少量样本外，该方案的主要优势在于可应用于多种蜱虫物种及不同的生活阶段。除了蜱虫解剖或其在宿主-寄生虫相互作用中的应用外，病原体感染对微小RNA（microRNA）分泌的影响，以及生理变化对蜱虫分泌的microRNA的影响也值得关注。首先，通过将胎牛血清、胰蛋白胨磷酸盐肉汤、10%脂蛋白胆固醇浓缩液、5%碳酸氢钠、HEPES和L15C300培养基加入一个26.3毫升的聚碳酸酯离心管中来制备无囊泡培养基，并根据需要调整体积。随后，在4°C条件下，以100,000 × g离心18小时。小心移除上清液，避免扰动沉淀，将上清液转移至新的离心管中。再次进行超速离心。取上清液并通过0.22微米滤膜过滤，以去除污染物。将上清液用移液器转移至50毫升离心管中，于-20摄氏度保存，直至后续使用或最长可保存三年。在24孔细胞培养板的每孔500微升无囊泡培养基中加入适量抗生素。现在，向不含无囊泡培养基的孔中加入含利福平的PBS，以防止细菌生长。将蜱虫用双面地毯胶带固定在玻璃载片上，并置于解剖显微镜下。在解剖前，向蜱虫加入含有利福平的 PBS 溶液，使用 4 毫米 Vannas 剪刀，在每只雌蜱的一侧做约 1 毫米的切口。随后，移除蜱虫的背侧部分和唾液腺，将 20 至 40 对蜱虫唾液腺放入已添加至 24 孔组织培养板单孔中的 500 微升无囊泡培养基中。将唾液腺样本在32摄氏度下孵育24小时，以促进细胞外囊泡的分泌。孵育结束后，用移液器将含有唾液腺的全部培养基转移至一个1.5毫升的微量离心管中，在4摄氏度下以300 × g离心10分钟。将上清液转移至一个新的1.5毫升微量离心管中。将含有唾液腺的沉淀重悬于RNA later中，于-80摄氏度保存，直至使用或长期保存。接下来，将上清液在4摄氏度下以2,000 × g离心10分钟，以去除细胞碎片，并用移液器将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。随后，在4摄氏度下以10,000 × g离心30分钟，以去除凋亡小体和较大的细胞外囊泡，并将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。然后将一个1 µm的尼龙注射器滤器安装到10 mL注射器上，并将其置于超速离心管上方。随后加入样品，并用10 mL PBS填充注射器。将上清液通过滤器注入管中。过滤并平衡试管后，将它们放入70 Ti转子中，在4°C条件下以100,000 ×g超速离心18小时。浓缩的细胞外囊泡在超速离心后形成沉淀。去除上清液时注意不要扰动沉淀，然后将沉淀重悬于PBS中。用移液器将500微升细胞外囊泡加入300 K离心过滤柱中，在室温下以8,000 × g离心10分钟，重复此步骤直至所有细胞外囊泡完成过滤。最后，向过滤柱中加入400微升灭菌PBS，充分混匀

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

从蜱 离体 唾液腺培养物和细胞外囊泡中分离microRNA

本文展示了外泌体的分离、纯化与检测方法，以及对其分子成分进行分析的技术。这些方法适用于从细胞培养上清和生物体液中分离外泌体，不仅可用于分子成分分析，也可用于功能研究。...

含RNA外泌体的分离与表征

吸血鬼式分离细胞外液 秀丽隐杆线虫

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基于SEC的分离小胶质细胞来源细胞外囊泡技术：从小胶质细胞条件培养基中分离细胞外囊泡的方法

关键词：SEC，小胶质细胞，细胞外囊泡，条件培养基，分离方法

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从单个蜱虫（蜱螨目：硬蜱科）中提取唾液、血淋巴、唾腺及中肠

学习从蜱唾液腺培养物及细胞外囊泡中分离microRNA的实验方法。该方案仅需约20只蜱，适用于多种蜱种及不同发育阶段，可获得高质量microRNA用于测序分析。

蜱虫中微小RNA的分离关键词：微小RNA，蜱虫，RNA提取，分子生物学，非编码RNA 离体唾液腺培养与细胞外囊泡

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