体内 小鼠视网膜血管损伤读数以促进可重复性

该协议允许用户定量测量小鼠视网膜成像中临床类似的损伤标志物，从而增强了后续发现的可翻译性。这些方法使我们能够简化分析，并使我们能够可靠地比较实验动物之间的成像。虽然开发这些方法是为了研究小鼠模型概述，但它们可以很容易地扩展到使用相同成像技术的任何视网膜疾病的研究。

打开视网膜成像显微镜灯箱、光学相干断层扫描机和加热鼠标平台。打开计算机并打开映像程序。每只眼睛加入一滴去氧肾上腺素和托品卡胺。

腹腔注射100微升1%荧光素。将鼠标放在平台上。调整平台的高度和角度，直到视网膜眼底的视图清晰且聚焦。

拍一张眼底的照片。打开成像和光学相干断层扫描软件。在光学相干断层扫描程序中，将轻移调整为 10。

拍摄光学相干断层扫描图像，在烧伤远端添加 75 微米。对视网膜的其他三个象限重复此操作。将相机切换到 488 纳米滤光片。

将相机增益增加到 5。在荧光素注射后正好5分钟拍摄眼底照片。在图像处理软件上打开荧光素图像。

复制图像。使用选择工具，仔细追踪主要船只。忽略从这些船只分支出来的任何船只。

在第一个图像中，删除所选内容，仅保留容器。保存此蒙版图像。将选区移动到第二张图像，反转选区并删除，隔离背景。

保存此蒙版图像。打开背景图像并测量积分密度。打开血管图像，选择血管的轮廓，然后测量平均强度。

将背景的积分密度除以血管的平均强度，生成眼睛的泄漏率。记录实验队列中每只眼睛的泄漏率。为了进一步控制背景，将实验眼睛归一化为未受伤对照眼睛的平均渗漏率。

在图像处理软件中打开光学相干断层扫描图像。追踪神经节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层、感光器层和 RPE 层的边界。将文件导出为 CSV。

测量每层的平均厚度，并对实验队列中的每只眼睛重复。打开图像J中的光学相干断层扫描图像，使用线工具测量外丛状层上边界不明显的距离。水平测量，保持混乱开始的纬度。

计算图像中杂乱无章的距离的总和。将紊乱的长度除以视网膜的总长度，得到紊乱的比率。对视网膜其他三个象限的光学相干断层扫描图像重复测量和计算。

取四个光学相干断层扫描图像的混乱比率的平均值。这个数字代表整个视网膜的平均混乱。对实验队列中的每只眼睛重复此操作。

用于计算每个视网膜图像泄漏比率的遮罩图像可以与其他图像进行比较并进行分析，将主要脉管系统与视网膜的其他区域分开。荧光素定量可以比较损伤严重程度和治疗效果，以及研究损伤时间过程中渗漏的变化。观察到OCT图像中视网膜层的描绘。

每个视网膜层厚度的量化表明，最初的水肿反应对视网膜内部层有更深远的影响。通过分析视网膜静脉阻塞损伤的时间过程，可以观察到视网膜层的初始炎症肿胀以及最终的退行性变薄。内核层对初始损伤的反应要大得多，但在初始水肿稳定并恢复到基线后，内层丛状层表现出更严重的变薄。

内视网膜层的紊乱表现为外层丛状层上边界的消失，将外层丛状和内核层混合在一起。比较两个实验组的视网膜紊乱，以研究抑制剂在减轻视网膜损伤方面的功效。图像质量对于分析质量至关重要。

获取视网膜图像时，请花时间确保眼底和视网膜层尽可能清晰和集中。这些非侵入性方法可以纵向使用，也可以与组织的生化和免疫组织化学研究结合使用，以创建更多方面和详细的疾病概况。该技术能够可靠地定量神经血管疾病模型中的体内视网膜成像数据，以便数据可以更容易地转化为人类疾病。