Name: 莱因哈蒂衣原体中去膜化细胞模型的再激活 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 37 s
Description: 了解莱因哈蒂衣原体中去膜化细胞模型的再激活方法，用于研究运动纤毛机制。该技术可在体外持续观察钙离子浓度对纤毛运动的影响，超过50%的细胞恢复运动并维持约90分钟。

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本研究由日本促进科学振兴会KAKENHI（https://www.jsps.go.jp/english/index.html）向N.U.（19K23758，21K06295）和K.W.（19H03242，20K21420，21H00420）提供的资助，以及由大隅前沿科学财团（https://www.ofsf.or.jp/en/）向K.W.提供的资助，和由连接人类、环境与材料的动态开放创新联盟（http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/）向N.U.和K.W.提供的资助支持。谨致谢意于Ms.&#160;Miyuki Shinohara（Hosei Univ.）在图表准备过程中提供的帮助。

本研究使用了Chlamydomonas reinhardtii的野生型菌株CC-125。CC-125购自莱茵衣藻资源中心（见材料表），并在20–25 °C下培养于含1.5%琼脂糖的三羟甲基氨基甲烷-乙酸盐-磷酸盐（TAP）培养基中16。
1. 细胞培养
<ol>
	<li>培养 Chlamydomonas reinhardtii 在TAP培养基中的（CC-125）16 在12 h/12 h的光照-黑暗周期中（光照期的光照条件：~50 µmol 光子 m−2 s−1 白光）在 20-25 °C 2天（图1). 
	注意：细胞必须处于对数生长中期阶段（视频 1). 长期培养（&gt;4天（处于对数生长后期或稳定期）会降低去膜细胞模型的复活效率。</li>
</ol>
<img alt="用于光合作用实验的锥形瓶中的绿藻培养物，实验室设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63869/63869fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：培养2天后的液体培养物。 从TAP-1.5%琼脂平板上取野生型细胞，用铂金环挑取适量接种至约150 mL TAP液体培养基中。培养2天后的细胞密度为2.3 × 106 个细胞/mL。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63869/63869fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
视频 1：活细胞的游动。 使用 10 倍物镜和油浸暗场聚光镜在显微镜下观察细胞。比例尺 = 100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63869/newMovie1.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
2. 去膜细胞模型的制备
注意：实验开始前，将洗涤缓冲液置于室温，脱膜缓冲液、稀释缓冲液、复性缓冲液以及ATP溶液置于冰上。这些缓冲液的成分见补充表1。
<ol>
	<li>在 20 °C 条件下，以 1000 × g 离心约 10 mL 液体培养物 3 分钟。 
	注意：从本步骤开始的整个实验流程中，避免使用经高压灭菌的塑料器皿（如离心管、移液器吸头等），以免降低细胞模型的再激活效率。对于锥形管，建议重复使用。培养 2 天后的细胞密度通常为 1.0–5.0 × 106 个细胞/mL。若细胞密度低于此范围，应取足够体积的培养液，确保含有约 5 × 107 个细胞。</li>
	<li>先倾倒去除上清液，再用巴斯德移液管彻底移除，并将沉淀物重悬于约 5 mL 洗涤缓冲液中。</li>
	<li>在 20 °C 条件下，以 1000 × g 将细胞在洗涤缓冲液中离心 3 分钟。</li>
	<li>用移液器小心吸弃上清液（图 2）。 
	注意：建议使用巴斯德移液管。若使用微量移液器，应避免使用经高压灭菌的移液器吸头。</li>
	<li>在细胞沉淀上加入约 0.5 mL 去膜缓冲液，用手轻轻振荡试管使细胞粗略重悬于缓冲液中，然后将试管置于冰上（图 3A）。 
	注意：此时无需完全重悬细胞沉淀。当进行细胞模型再激活时，应将去膜缓冲液和再激活缓冲液中的 MgSO4 浓度提高至 15 mM，并使 ATP 的终浓度 >1 mM，以实现稳定的再激活17。</li>
	<li>用移液器轻轻重悬剩余的细胞沉淀，再次将试管置于冰上（图 3B）。</li>
	<li>取 5–10 µL 细胞模型，用稀释缓冲液稀释 10 倍后，在显微镜下观察（视频 2），确认所有细胞模型均已去膜且不运动（图 4）。 
	注意：若仍有部分细胞在运动（存活状态），可直接向细胞模型溶液中加入去膜缓冲液中所用的非离子型去垢剂，使其终浓度约为 0.15%。或者，使用含 0.15% 去垢剂的去膜溶液重复步骤 2.1–2.5。</li>
</ol>
<img alt="戴手套的手持含有绿色溶液的离心管；准备进行色谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63869/63869fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：弃去上清液。 倾倒离心管去除大部分上清液后，使用巴斯德移液管小心移除残留的上清液。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63869/63869fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="植物色素提取、离心管、实验、叶绿素分离、实验室演示" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63869/63869fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：去膜过程。（A）将0.5 mL去膜溶液覆盖在细胞沉淀上后，用手轻轻混匀，使细胞大致悬浮。（B）混匀后，用巴斯德移液管将剩余的细胞沉淀完全悬浮于溶液中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63869/63869fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="游动藻类的显微镜图像，显示鞭毛运动，比较随时间变化的运动性效应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63869/63869fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：去膜处理的影响。（A）粘附在载玻片上的活细胞。（B）粘附在载玻片上的细胞模型。注意在细胞模型中，纤毛略微变细。图像通过20倍物镜和油浸暗场聚光镜在显微镜下观察获得。比例尺 = 10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63869/63869fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
视频 2：去膜化的确认。 在显微镜下使用 10 倍物镜和油浸暗场聚光镜观察细胞模型悬液。未见细胞游动。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63869/newMovie2.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
3. 去膜细胞模型的再激活
<ol>
	<li>混合 80 µL 再激活溶液的用量， 10 µL ATP 溶液，并 10 µL 通过轻敲0.5 mL离心管使细胞模型充分混匀（图5). 
	注意：最终 ATP 浓度必须为 &lt;3 mM，因为纤毛运动的一个参数——纤毛摆动频率——随ATP浓度增加而升高，并在ATP浓度达到2-3 mM时趋于饱和17. 
	注意：使用移液器吹打或涡旋混合会导致去鞭毛，并降低复活效率。
	<ol>
		<li>用于重新激活 &lt;0.2 mM ATP，添加ATP再生系统，例如70 U/mL肌酸激酶和5 mM肌酸磷酸（参见 材料清单). 
		注意：激活溶液以较高浓度配制（1.125x， 补充表1) 的浓度高于稀释液，以便在混合溶于水的ATP后，体系中各组分的终浓度达到：30 mM Hepes（pH 7.4）、5 mM MgSO₄4，1 mM 二硫苏糖醇（DTT）、1 mM EGTA 和 50 mM 醋酸钾（见 材料列表).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>放置 ~30 µL 将混合溶液滴加到载玻片上，并使用垫片轻轻盖上盖玻片，以避免对细胞模型造成机械损伤（图6). 
	注意：可使用白色石油胶带或双面胶带制作间隔物。</li>
	<li>在显微镜下观察复苏的细胞模型视频 3).</li>
</ol>
<img alt="显微镜实验；荧光显微镜装置；光学分析的样品制备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63869/63869fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：通过轻敲试管混合溶液。 （A）依次向 80 µL 复性溶液中加入 10 µL ATP 溶液和 10 µL 细胞模型。（B）通过手指轻敲试管使溶液混合。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63869/63869fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜载玻片制备系列；使用载玻片在显微镜下封片样本的步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63869/63869fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：在盖玻片边缘制作间隔物。 （A）将少量白色凡士林涂抹于手背。 （B）用盖玻片的一边刮取少量白色凡士林。 （C）在盖玻片边缘形成一个间隔物。 （D）在对侧边缘制作另一个间隔物。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63869/63869fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
视频3：重新激活的细胞模型的游动。 通过加入ATP至终浓度为1 mM，重新激活细胞模型的运动能力，并使用10倍物镜和油浸暗场聚光镜在显微镜下观察。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63869/newMovie3.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

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<li>Gorman, D. S., Levine, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+f+and+plastocyanin%3A+their+sequence+in+the+photosynthetic+electron+transport+chain+of+Chlamydomonas+reinhardi%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).</li>
<li>Takano, W., Hisabori, T., Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+estimation+of+cytosolic+ATP+concentration+from+the+ciliary+beating+frequency+in+the+green+alga+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid estimation of cytosolic ATP concentration from the ciliary beating frequency in the green alga Chlamydomonas reinhardtii.</a> Journal of Biological Chemistry. 296, 100156(2021).</li>
<li>bio.chuo-u. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bio.chuo-u.ac.jp/nano/calcon.html">http://www.bio.chuo-u.ac.jp/nano/calcon.html</a> (2022).</li>
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<li>Wakabayashi, K., Ide, T., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+flagellar+motility+activation+in+Chlamydomonas+reinhardtii+in+response+to+mechanical+agitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent flagellar motility activation in Chlamydomonas reinhardtii in response to mechanical agitation.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 66 (9), 736-742 (2009).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案中有两个关键步骤。第一步称为去膜处理，该过程需要轻柔但彻底地进行。通过剧烈吹打或涡旋可诱导去鞭毛（即鞭毛与细胞体分离），从而使细胞模型在加入ATP后仍保持不动。通常将5 × 107个细胞悬浮于约0.5 mL去膜缓冲液中（最终细胞密度为1 × 108个细胞/mL）。若细胞模型密度过显著低于此值（例如1 × 106个细胞/mL），则细胞模型的再激活率会下降。目前尚不清楚细胞模型密度对再激活的影响机制，但细胞提取物中可能含有有助于再激活的因子。当然，细胞密度越高，彻底去膜的难度也越大。去膜不充分可能导致活细胞污染细胞模型。在此情况下，可在步骤2.7中观察到可移动的细胞。活细胞的污染将导致对再激活缓冲液中添加的ATP或其他组分（如Ca2+）作用的误判。该步骤需要熟练的操作技巧。
第二个关键步骤是重新激活。与去膜步骤类似，用力吹打溶液以混匀也会导致纤毛脱落，因此建议通过轻敲离心管来混匀溶液。该步骤同样需要熟练的操作技巧。此外，当溶液体积为100 µL时（如本方案所述），建议在此步骤中使用0.5 mL...

这 体外 去膜运动细胞的再激活是研究细胞运动调控机制分子基础的重要工具。Szent-Györgyi 首次证明了这一点。 体外 加入三磷酸腺苷（ATP）引起经50%甘油抽提的兔骨骼肌纤维收缩1该实验首次证明了ATP为肌肉收缩提供能量。该方法随后被迅速应用于研究由ATP驱动的纤毛/鞭毛运动，例如精子鞭毛的运动。2, 草履虫 纤毛3，以及 莱茵衣藻 纤毛（也称为鞭毛）4 使用非离子型去垢剂进行去膜处理。
单细胞绿藻C. reinhardtii是研究纤毛的模式生物：它通过像人进行蛙泳一样摆动两条纤毛来游动5。纤毛运动由驱动蛋白动力蛋白（dynein）驱动，这是一种朝向微管负端的基于微管的马达蛋白6,7。纤毛动力蛋白可分为外臂动力蛋白和内臂动力蛋白。缺失各类动力蛋白的突变体已被分离出来，表现为游泳速度减慢，并具有不同的运动异常。对这些突变体进行的详细体外（in vitro）运动分析极大地推动了动力蛋白的研究8。
自采用该方法及其衍生技术以来，已取得许多重要发现 体外 去膜后重新激活实验 C. reinhardtii 细胞（细胞模型）已建立。在一系列 Ca 条件下对细胞模型进行再激活2+ 缓冲液，例如，显示出9 两个纤毛由亚微摩尔浓度的Ca不同地调控2+，这种不对称的纤毛控制能够实现趋光性定向 C. reinhardtii10此外，两种纤毛均表现出波形转换，即从正向游动模式（称为不对称波形）转变为反向游动模式（称为对称波形，当细胞受到光刺激或机械刺激时，该波形短暂出现）11,12。这种波形转换受亚毫摩尔浓度的Ca2+，这通过所谓的核鞭毛器（一种包含两条纤毛、基体、连接基体与细胞核的结构以及细胞核残余物的复合体）的重新激活得以证实11 或分离纤毛的去膜轴丝13。除了Ca2+，氧化还原电位是一种调控纤毛摆动频率的信号，这一点已在含有不同比例还原型谷胱甘肽的氧化还原缓冲液中通过细胞模型的重新激活实验得到证实 与 氧化型谷胱甘肽14此外，环磷酸腺苷（cAMP）对两条纤毛具有不对称调控作用，这一点通过使用光解性笼锁cAMP重新激活轴丝的实验得以证实。15。这些 体外 研究结果，结合遗传学发现，已促进对纤毛调控分子机制的深入理解 C. reinhardtii.
本文描述了一种用于激活细胞模型的方案。该方法简单，允许进行多种修改，并可应用于以纤毛运动的多种生物体。然而，由于去膜细胞较为脆弱，因此需要一些技巧，以在防止脱纤毛的同时高效地恢复细胞模型的运动能力。

<table><tbody><tr><td>0.5 mL 塑料管</td><td>QSP</td><td>502-PLN-Q</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆底离心管</td><td>SARSTEDT</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物（ATP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>KUBOTA</td><td>2800</td><td></td></tr><tr><td>衣藻菌株 CC-125</td><td>衣藻资源中心</td><td></td><td>https://www.chlamycollection.org/</td></tr><tr><td>肌酸激酶</td><td>Merck</td><td>CK-RO</td><td></td></tr><tr><td>磷酸肌酸</td><td>Merck</td><td>CRPHO-RO</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Nakalai Tesque</td><td>14128-46</td><td></td></tr><tr><td>GEDTA（EGTA）</td><td>Dojindo</td><td>G002</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Dojindo</td><td>GB70</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td>IUPAC 名称为辛基苯氧基聚乙氧基乙醇：IGEPAL CA-630 是 Nonidet P-40（NP-40）的替代品；NP-40 目前在 Sigma-Aldrich 已不再供应。</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Nakalai Tesque</td><td>21002-85</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX-53</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>fisher scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇，分子量 20,000</td><td>Merck</td><td>8.18897.1000</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钾</td><td>Nakalai Tesque</td><td>28434-25</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Nacalai</td><td>31511-05</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>196-00015</td><td></td></tr></tbody></table>

chlamydomonas reinhardtii 去膜细胞模型的再激活

Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

自从20世纪中叶Szent-Györgyi通过向去膜肌肉中添加ATP并观察其收缩而进行的历史性实验以来，体外（in vitro）去膜细胞的再激活已成为研究细胞运动性的传统且有效的方法。该实验方法的根本优势在于，再激活溶液的成分可以轻松改变。例如，体内（in vivo）因膜兴奋而仅短暂出现的高Ca2+浓度环境，可在实验室中被成功模拟。真核生物的纤毛（又称鞭毛）是结构复杂的运动装置，其调控机制至今尚未完全阐明。单细胞绿藻Chlamydomonas reinhardtii是纤毛研究领域的理想模式生物。C. reinhardtii去膜细胞模型及其衍生结构（如分离纤毛的去膜轴丝）的再激活实验，对揭示纤毛运动的分子机制作出了重要贡献。这些实验明确了ATP为纤毛运动提供能量，并发现包括Ca2+、cAMP和活性氧物种在内的多种细胞信号可调节纤毛运动。本文详细描述了C. reinhardtii细胞去膜及细胞模型再激活的精确方法。

去膜与再激活过程 C. reinhardtii 野生型菌株（CC-125）如图所示。接种后第2天，培养物呈现浅绿色（步骤1.1）图1细胞被收集（步骤2.1）、洗涤（步骤2.2）并去膜（步骤2.5）。&#160;去膜后，所有细胞模型均失去运动能力（步骤 2.7）。去膜后的纤毛（称为轴丝）仍附着在细胞体上，表明细胞模型的运动能力丧失并非由去纤毛引起图4）。加入重激活缓冲液和ATP混合后（步骤3.1）， &#62;50%的细胞模型变为可运动状态（步骤3.2）。在步骤3.1中通过轻柔而充分的混匀可提高细胞的再激活率（可运动细胞百分比）。即使不添加ATP再生系统（步骤3.1.1），再激活的细胞在最终ATP浓度为1 mM的条件下仍可持续运动约90分钟，之后运动逐渐停止。
补充表1：本研究中使用的溶液和缓冲液的组成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63869/638...

的 体外 运动细胞的重新激活是理解细胞运动机制的关键实验。该方案描述了去膜细胞模型的重新激活方法。 莱茵衣藻一种用于研究纤毛/鞭毛的模式生物。

Chlamydomonas reinhardtii 去膜细胞模型的再激活

自20世纪中叶Szent-Györgyi通过向甘油化肌肉中添加ATP并观察其收缩而进行的历史性实验以来，……

该方法有助于理解影响纤毛运动能力的因素。此技术的主要优势在于，可在体外持续观察仅在体内短暂发生的现象，例如纤毛内钙离子浓度的反转。该方法特别有助于运动纤毛研究领域的发展。初学者进行去膜步骤可能会有困难，因此强烈建议轻柔而精确地操作。首先将约10毫升的莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）培养物在20摄氏度下以1,000 RCF离心3分钟。将上清液倾出，并用巴斯德吸管吸除残留液体。将沉淀物重悬于约五毫升洗涤缓冲液中。在20摄氏度下，以1,000 RCF离心洗涤缓冲液中的细胞3分钟。用移液器小心弃去上清液。向细胞沉淀中加入约 0.5 毫升去膜缓冲液。轻轻振荡离心管，使细胞在缓冲液中大致悬浮，然后将离心管置于冰上。用移液器轻轻重悬剩余的细胞沉淀，并再次将离心管置于冰上。取5至10微升细胞模型，用稀释缓冲液稀释十倍后，在显微镜下观察，确认所有细胞模型均已去膜且不具游动能力。在0.5毫升离心管中，加入80微升复活液、10微升ATP溶液和10微升细胞模型，通过轻弹管壁混匀。取约30微升混合溶液滴加到玻璃载玻片上，使用垫片轻轻盖上盖玻片，以避免对细胞模型造成机械冲击。在显微镜下观察复苏的细胞模型。在C.reinhardtii培养物去膜后，所有细胞模型均失去运动能力，且去膜后的纤毛仍附着在细胞体上，表明细胞模型的不动性并非由去纤毛引起。将细胞模型与含有ATP的再激活缓冲液混合后，超过50%的细胞模型开始运动。即使没有ATP再生系统，再激活的细胞仍可持续运动约90分钟，直至ATP最终浓度达到1毫摩尔后才逐渐停止。去膜步骤至关重要。所有细胞都应停止游动，但不应过度混合导致去鞭毛现象的发生。研究人员可以修改本方案，加入钙离子或环磷酸腺苷等试剂，或利用缺乏特定蛋白质的突变体进行实验，以鉴定这些成分的生物学功能。

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Chlamydomonas reinhardtii 去膜细胞模型的再激活

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