多孔设备固体培养基上分离秀 丽隐杆线虫 的长期培养和监测

这里介绍的是一种优化的方案，用于在微加工多孔设备中的固体培养基上培养分离的单个线虫。这种方法允许在个体动物的一生中监测与衰老和健康相关的各种表型，包括活动、体型和形状、运动几何形状和存活率。

当我们研究衰老和海秀丽隐杆线虫时，我们通常会随着时间的推移跟踪一群动物。这让我们瞥见了你正在研究的过程在每个时间点在种群中做了什么，但它并没有告诉你这个过程是如何随着时间的推移在个体动物中变化的。这些单一动物培养环境使我们能够并行跟踪数百只动物的个体动物分子过程和生理过程随时间变化的动态变化。

我们发现，有两件主要因素可以真正影响这些多孔培养系统的质量。一个是井干涸或干涸不足，二是污染。我们尝试在整个协议中注意您可以尝试缓解这些问题的特定步骤。

今天展示协议的将是艾米丽·加迪亚。她是我实验室的技术人员，为优化这个协议做了很多工作。准备好所有试剂后，使用一次性刮刀在大型一次性船上混合每个模具60克PDMS基料和6克固化剂。

将PDMS混合物置于真空室中，在零下0.08兆帕斯卡下放置30分钟以除去气泡。将PDMS混合物倒入并填充到每个3D打印模具中。将填充的模具和任何额外的PDMS混合物放入真空室中，以零下0.08兆帕斯卡的温度放置25分钟。

从真空室中取出填充的模具，并用一次性刮刀弹出任何剩余的气泡。从一个边缘开始，在PDMS填充模具的顶部慢慢降低平坦的亚克力板。如果形成气泡，请按照手稿中的说明进行操作。

将 2.5 磅重的重量放在丙烯酸上，然后将加重的模具放入烤箱中。让它们在 55 摄氏度下固化一夜。在孵育结束时，从烤箱中取出重物和模具。

接下来，在丙烯酸和固化的PDMS之间工作剃须刀片 打破密封 使用剃须刀或金属刮刀，小心地松开固化PDMS的侧面并将其从模具中取出。将 PDMS 设备包裹在铝箔中。用高压灭菌器胶带密封，并在 15 摄氏度和每平方英寸 15 磅的表压下通过干循环高压灭菌至少 121 分钟进行灭菌。

要制备多孔装置，请将干珠浴培养箱预热至90摄氏度。打开高压灭菌的多孔装置的包装，并在装置的右上角切一个小凹口。将最多三个未包装的设备放入等离子清洁器中，孔朝上，然后运行等离子清洁器。

通过用 70% 乙醇喷洒托盘内部并用任务擦拭将其擦干，对每个设备一个单孔聚苯乙烯托盘进行消毒。用戴手套的手从等离子清洁器中取出每个设备，并将其放入清洁的托盘中。然后将25毫升一次性移液器盆放入预热90摄氏度的珠浴培养箱中。

每个要填充的设备取一管固化的LMNGM预混合物，并将其放入200毫升玻璃烧杯中。取下盖子和石蜡膜，然后微波，直到介质充分融化以倒入。将熔融的LMNGM预混合物倒入另一个无菌的200毫升烧杯中。

如果一次填充多个设备，则可以在此烧杯中组合多个试管。将LMNGM预混合物再微波20秒。如果预混合物开始沸腾，请停止微波炉并让它沉降。

从微波炉中取出熔融的LMNGM预混合物，并将其冷却至60摄氏度。将剩余的LMNGM成分添加到预混合混合物中，并将熔融的LMNGM倒入珠浴中的25毫升盆中。使用 200 微升多通道中继器移液器填充设备孔。

将中继器设置为分配 14 微升的等分试样并安装五个移液器吸头。用熔融的LMNGM装载吸头，并将前14微升分配回装有LMNGM的盆中。快速但小心地将 14 微升分配到设备的内孔中，然后将剩余的 LMNGM 分配回盆中，因为最终等分试样通常小于 14 微升。

接下来，设置中继器分配 15 微升的等分试样并填充最外层的孔环。使用 200 微升移液器，将 200 微升硫酸铜溶液分配到每个角落的设备护城河中。避免护城河过满，并确保硫酸铜不接触井的顶面。

如果硫酸铜不容易流过整个护城河，请使用短铂丝镐来帮助打破张力并将硫酸铜拖过护城河。硫酸铜流过整个护城河后，使用200微升移液管或真空抽吸尽可能多地去除硫酸铜。使用挤压瓶，在设备和托盘壁之间的空间中添加水晶体。

合上托盘盖，用一块封口膜包裹所有四个面。添加两个额外的封口膜片以完全密封板。使用中继移液器，用五微升浓缩细菌点缀每个孔。

避免直接接触 LMNGM 表面。使用定制的干燥箱干燥设备，该干燥箱可以使用计算机机箱风扇和HEPA过滤器以最低的成本建造。在解剖范围内，检查孔以确保所有孔都已成功干燥。

使用铂镐，从准备好的蜗虫板中转移动物，每孔添加一个蠕虫。将一滴准备好的洗涤剂溶液添加到托盘盖内侧，并用任务擦拭擦拭，直到洗涤剂溶液干燥。按照手稿中的说明，用三片石蜡像包裹托盘。

daf-2（RNAi）的寿命延长被daf-16零突变阻断。在daf-2（RNAi）存在的情况下，健康寿命也减少了整个生命周期的三天滚动平均值，daf-16突变体和daf-2（RNAi）显示了个体动物的寿命和健康寿命的变化，以绝对值或总寿命的一小部分进行比较。个体动物在整个生命周期中的累积活动与寿命的相关性优于单个动物在整个生命周期中任何特定日期的活动。

重要的是尽快填满井并添加蠕虫。否则，井可能会干涸，蠕虫将无法生存。该系统与自动成像兼容，可用于收集高通量数据，例如寿命、活动和体型或形状。