Name: 体内神经元钙处理的亚细胞成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 学习利用Caenorhabditis elegans进行神经元亚细胞钙成像的高分辨率技术。该方法通过基因编码钙指示剂实现体内生理条件下的快速成像，为研究神经功能与钙信号调控机制提供重要工具。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）（授予F. Hoerndli的R01-NS115947项目）资助。我们还要感谢Attila Stetak博士提供pAS1质粒。

1. 创建转基因品系
<ol>
	<li>使用一种选定的克隆方法8,9，将克隆表达载体构建为包含 Pflp-18 或 Prig-3 启动子（用于腹神经索中 AVA 特异性信号），随后是 Ca2+ 指示剂（具体选择见讨论部分），然后是3'非翻译区（详见讨论部分）10质粒列表及其来源见于 补充表1.</li>
	<li>遵循既定的转基因品系构建方案 通过 DNA混合物的显微注射（&#60;100 ng/μL；参见 补充表1 （针对每种质粒的浓度）含有 Ca2+ 报告基因转染体（~20 ng/μL）和拯救DNA lin-15+ （筛选标记）导入1日龄成虫的生殖腺 秀丽隐杆线虫10 （基因型： lin-15(n765ts)；表型：多阴门10,11. 
	注意。保持 lin-15(n765ts) 在15°C下培养亲本以抑制温度敏感型突变。</li>
	<li>将注射后的亲本在20 °C条件下培养，直至F1子代成年，以便通过无多阴门表型进行转基因筛选。</li>
	<li>克隆传代13 不具有多阴门表型的成年F1子代，因为这表明含有Ca的染色体外阵列已表达2+ 指示剂11.</li>
	<li>评估 Ca 的表达2+ 通过在第3节后续部分所述的方法对没有多阴门表型的F2或F3子代中的一日龄成虫进行制片和成像，以检测指示表型。 
	注意：如需快速获取图像（详见讨论部分），需要指示剂具有相对较高的表达水平。</li>
	<li>在具有最佳Ca表达的转基因品系的后续世代中进行实验2+ 指示剂（详见讨论部分），在标准条件下（20 °C，NGM 平板）培养菌株12.</li>
</ol>
2. 光学装置
<ol>
	<li>使用能够进行长期延时成像的显微镜。 
	注：本研究中的代表性数据是使用配备488 nm和561 nm激发激光的倒置转盘共聚焦显微镜获得的。</li>
	<li>使用低倍物镜（例如10x/0.40）对线虫进行粗略定位。</li>
	<li>为实现亚细胞分辨率，切换至高倍物镜并利用其对神经元进行定位。 
	注：本研究中获取代表性数据时采用了100x/1.40 NA油镜。</li>
	<li>使用具备快速图像采集能力（&#62;50 fps）的超灵敏相机进行图像采集。</li>
	<li>针对所选用的Ca2+指示剂，使用标准发射滤光片（例如，GCaMP6f和mitoGCaMP使用525 nm ± 50 nm发射滤光片）。</li>
	<li>当图像采集时间超过10秒时，应添加Z轴漂移校正器（ZDC），因为在成像过程中琼脂垫脱水会导致神经突在数秒内偏离焦平面。 
	注：如果显微镜系统不支持ZDC，或需要进行长时间（&#62;20分钟）成像，则可在琼脂垫周围涂抹一圈硅脂或熔化的凡士林以减缓脱水。</li>
</ol>
3. 成像用线虫的制备
<ol>
	<li>制备琼脂垫
	<ol>
		<li>在13 mm × 100 mm玻璃培养管中，将分子级琼脂溶于M912中，配制3 mL的10%琼脂溶液，并微波加热数秒（参见材料表）。 
		注意：熔融琼脂可在加热块上保存最多1小时，或每次需要琼脂垫时新鲜配制。</li>
		<li>将一块显微镜载玻片置于另外两块载玻片之间，每块附加载玻片上均贴有两层实验室胶带（参见图1A-i）。</li>
		<li>剪去1,000 μL移液枪头的尖端（无滤芯），用其吸取少量琼脂液滴加至中心盖玻片的中央位置（图1A-i）。</li>
		<li>用另一块载玻片压在琼脂上，将其压平（图1A-ii）。</li>
		<li>冷却后，使用13 mm × 100 mm玻璃培养&#160;管的开口切割琼脂，形成一个小圆片（图1A-iii），然后去除周围的多余琼脂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备线虫滚动溶液
	<ol>
		<li>将蝇蕈醇（muscimol）粉末溶于M9缓冲液中，配制成30 mM的母液。分装为50 μL等份，于4 °C保存。</li>
		<li>每3–5天取一份新的30 mM蝇蕈醇溶液解冻（使用期间存放于20 °C）。</li>
		<li>将30 mM蝇蕈醇母液与聚苯乙烯微珠按1:1比例稀释，配制成滚动溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定位用于成像的线虫
	<ol>
		<li>在琼脂垫中央加入1.6 μL滚动溶液。 
		注意：液体用量应根据所成像线虫的年龄进行调整（幼龄虫用量较少，老龄虫用量较多）。</li>
		<li>使用常用的线虫挑取工具（即玻璃丝或铂金丝挑针）13，将一只无多阴门表型11、所需年龄的线虫转移至琼脂垫上的滚动溶液中（图1A-iv）。 
		注意：代表性数据来自1日龄雌雄同体线虫（GCaMP6f品系 = FJH185；mitoGCaMP品系 = FJH597；参见补充表1），可通过仅存在一排卵来识别。有关不同年龄线虫操作的更多细节，请参见讨论部分。</li>
		<li>等待约5分钟，待蝇蕈醇抑制线虫运动后，将一块22 mm × 22 mm的盖玻片轻轻盖在琼脂垫上，以物理方式限制线虫移动。</li>
		<li>为成像腹侧神经索中的神经突，可轻推盖玻片，使线虫旋转至如图1B、C所示的方向。 
		注意：为观察腹侧神经索，应将线虫头部朝上放置，并旋转线虫，使近端部分的肠道位于右侧，远端部分的肠道位于左侧（从观察者视角）。若要成像背侧神经索，则采用相反方向（图1C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将线虫固定于显微镜上
	<ol>
		<li>在将样品置于显微镜载物台前，先在盖玻片上滴加一滴浸油。</li>
		<li>在明场模式下使用低倍物镜（10×）找到线虫。</li>
		<li>切换至100×物镜，并调节焦距。</li>
		<li>使用488 nm成像激光激发GCaMP或mitoGCaMP荧光，定位AVA神经突。 
		注意：调节时应动作轻微，避免压碎线虫或移位盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 高分辨率图像流的获取
<ol>
	<li>体内 GCaMP 成像
	<ol>
		<li>将曝光时间设置为 20 ms。</li>
		<li>调整成像激光和采集参数，直至基础 GCaMP 荧光信号位于相机动态范围的中段14。有关使用其他显微镜系统优化成像参数的建议，请参见讨论部分。 
		&#8203;注意：对于本研究所使用的光学系统，将 488 nm 成像激光设置为以下输出参数：激光功率 = 50%，衰减 = 1。将其他采集参数调整如下：EM 增益 = 200，前置放大器增益 = 1。</li>
		<li>在 100 倍放大下利用 GCaMP 荧光定位 AVA 神经纤维后，将 ZDC（见材料表）设置为 ±30 μm 范围，并启动连续自动对焦。在成像前根据需要手动校正焦平面。</li>
		<li>在 100 倍放大下采集图像序列。本研究所用系统可实现长达 10 分钟的连续成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体内 mitoGCaMP 成像
	<ol>
		<li>根据需要执行步骤 4.1.1–4.1.2，以获得处于相机动态范围中段的基础 mitoGCaMP 荧光信号14。 
		注意：对于本研究所使用的光学系统，将 488 nm 成像激光设置为以下输出参数：激光功率 = 20%，衰减 = 10。将采集参数调整如下：EM 增益 = 100，前置放大器增益 = 2。</li>
		<li>在利用 mitoGCaMP 荧光定位 AVA 神经纤维中的线粒体后，按照步骤 3.3 中所述设置 ZDC。</li>
		<li>在 100 倍放大下采集图像序列。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 图像流分析
<ol>
	<li>在适当的图像分析软件中打开图像流，用于分析图像序列中的像素值（参见材料表）。</li>
	<li>使用多边形选区工具，定义包含GCaMP或mitoGCaMP的亚细胞感兴趣区域（ROI）。</li>
	<li>点击分析 &#62; 工具 &#62; ROI管理器。在ROI管理器中，点击添加 ，然后选择更多 &#62; 多重测量。在多重测量窗口中，点击确定 ，以自动采集上述定义的ROI在图像流每一帧中的平均、最小和最大像素强度，用于后续分析。 
	注意：建议将每个ROI的平均像素强度（Favg）归一化为其最小强度（Fmin），即采用比值Favg/Fmin，以校正由于在z平面中位置不同所导致的荧光差异。若成像过程中线虫发生移动，应舍弃该图像流，因为运动也会影响荧光测量结果。</li>
</ol>

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<li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li>
<li>Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+acoustic+wave+microfluidics+for+repetitive+and+reversible+temporary+immobilization+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

实施本方法时，首要考虑的是为特定研究问题选择具有理想特性的 Ca2+ 指示剂。细胞质 Ca2+ 指示剂通常对 Ca2+ 具有高亲和力&#160;，而这些指示剂对 Ca2+ 的敏感性与其动力学（开启/关闭速率）呈反比关系16,17。这意味着需要根据所研究的现象，在 Ca2+ 敏感性或动力学特性之间进行权衡。对于基础 Ca2+ 水平相对较高的亚细胞区室（如内质网），应考虑使用低 Ca2+ 亲和力的 Ca2+ 指示剂18。为了构建可在特定细胞中表达 Ca2+ 指示剂的重组 DNA，应采用合适的克隆技术，插入细胞特异性启动子19,20，随后连接所选的 Ca2+<...

钙离子（Ca2+）在多种细胞类型中是高度多能的信息载体。在神经元中，Ca2+ 负责介导依赖于细胞活动的神经递质释放、调控细胞骨架运动、精细调节代谢过程，以及维持神经元正常功能和稳态所需的多种其他机制1,2。为了确保有效的细胞内信号传导，神经元必须维持细胞质中较低的基础 Ca2+ 水平3。这一目标通过多种协同作用的 Ca2+ 调控机制实现，包括将 Ca2+ 摄取至内质网（ER）和线粒体等细胞器中。此外，细胞膜上可通透 Ca2+ 的离子通道的空间分布也参与调控，共同导致神经元内细胞质 Ca2+ 水平呈现空间异质性。
静息状态和神经元激活期间的 Ca2+ 异质性使得 Ca2+ 依赖性机制能够实现多样化且具有位置特异性的调控1。Ca2+ 浓度特异性效应的一个实例是通过肌醇-1,4,5-三磷酸（InsP3）受体介导的内质网 Ca2+ 释放。受体的钙离子通透性孔道开放需要低水平的 Ca2+ 与 InsP3 共同作用。相反，高水平的 Ca2+ 则可通过直接或间接机制抑制该受体活性4。大量证据表明，细胞内 Ca2+ 处理和信号传导异常是神经退行性疾病及自然衰老早期的病理机制之一，这进一步凸显了 Ca2+ 稳态对正常神经元功能的重要性5,6。具体而言，内质网和线粒体对 Ca2+ 的异常摄取与释放与阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病中神经元功能障碍的发生密切相关6,7。
在自然衰老或神经退行性变过程中研究钙离子（Ca2+）稳态失衡，需要在活体、完整的生物体中以亚细胞分辨率对Ca2+水平进行纵向观察，且该生物体需保持原有的细胞结构（即突触排列和离子通道分布）。为此，本实验方案提供了两种 readily available（易于获取）的基因编码Ca2+传感器的使用指南，可用于在体内（in vivo）以高空间和时间分辨率记录Ca2+动态变化。在&#160;C. elegans中应用本方案所获得的代表性结果表明，在单个神经元的细胞质或线粒体基质中表达Ca2+指示剂，可快速获取荧光图像（最高达50 Hz），不仅能够呈现Ca2+动态变化，还可分辨单个类似树突棘结构及单个线粒体内部的Ca2+水平。

<table><tbody><tr><td>100x/1.40 油镜&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td></td><td>&amp;nbsp;UPlanSApo</td></tr><tr><td>10x/0.40 物镜&amp;nbsp;</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td></td><td>&amp;nbsp;UPlanSApo</td></tr><tr><td>22 mm × 22 mm 盖玻片&amp;nbsp;</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>48366-227&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agarose SFR&amp;nbsp;</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>J234-100G&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>光束匀化器</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>Borealis 升级至 CSU-X1</td></tr><tr><td>CleanBench 实验台&amp;nbsp;</td><td>TMC&amp;nbsp;</td><td></td><td>带振动控制</td></tr><tr><td>一次性培养管</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>47729-572</td><td>&amp;nbsp;13 mm × 100 mm</td></tr><tr><td>环境培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>3940</td><td>设定为 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>滤光轮或滑块</td><td>ASI</td><td></td><td>适用于直径 25 mm 的滤光片</td></tr><tr><td>FJH 185</td><td>Caenorhabditis Genetics Center&amp;nbsp;</td><td>FJH 185</td><td>线虫品系</td></tr><tr><td>FJH 597</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>FJH 597</td><td>线虫品系</td></tr><tr><td>GFP 带通发射滤光片&amp;nbsp;</td><td>Chroma&amp;nbsp;</td><td></td><td>525 &amp;plusmn; 50 nm&amp;nbsp;(直径 25 mm)</td></tr><tr><td>ILE 激光合束器&amp;nbsp;</td><td>Andor Technologies&amp;nbsp;</td><td></td><td>4 条激光线&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ILE 固态 488 nm 激光器</td><td>Andor Technologies&amp;nbsp;</td><td></td><td>50 mW</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>版本 1.52a</td></tr><tr><td>IX83 转盘共聚焦显微镜&amp;nbsp;</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td></td><td>配备 Yokogawa CSU-X1 转盘</td></tr><tr><td>iXon Ultra EMCCD 相机&amp;nbsp;</td><td>Andor Technologies&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低自发荧光浸油&amp;nbsp;</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>Z-81226</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices&amp;nbsp;</td><td></td><td>版本 7.10.1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>显微镜控制盒</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX3-CBH</td></tr><tr><td>蝇蕈醇&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedical&amp;nbsp;/ Sigma</td><td>02195336-CF&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pAS1</td><td>AddGene</td><td>194970</td><td>质粒</td></tr><tr><td>pBSKS</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCT61</td><td></td><td></td><td>质粒可应要求从 Hoerndli/Maricq 实验室获取</td></tr><tr><td>pJM23</td><td></td><td></td><td>质粒可应要求从 Hoerndli/Maricq 实验室获取</td></tr><tr><td>pKK1&amp;nbsp;</td><td>AddGene&amp;nbsp;</td><td>194969</td><td>质粒</td></tr><tr><td>Polybead 微球&amp;nbsp;</td><td>Polysciences Inc.&amp;nbsp;</td><td>00876-15</td><td>&amp;nbsp;0.094 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>稳定性培养箱</td><td>Norlake Scientific</td><td>NSRI241WSW/8H</td><td>设定为 15 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>载物台控制器</td><td>ASI</td><td></td><td>带滤光轮控制功能</td></tr><tr><td>标准显微镜载玻片</td><td>Premiere</td><td>9108W-E</td><td>75 mm × 25 mm × 1 mm</td></tr><tr><td>触摸面板控制器</td><td>Olympus</td><td></td><td>I3-TPC</td></tr><tr><td>Z 轴漂移校正器&amp;nbsp;</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td></td><td>IX3-ZDC2</td></tr></tbody></table>

神经元钙处理的亚细胞成像 在体

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

钙（Ca2+)成像已广泛用于检测神经元活动，但越来越明确的是，亚细胞Ca2+ 处理是细胞内信号传导的关键组分。亚细胞钙的可视化2+ 动力学 体内,&#160;在复杂的神经系统中，对神经元在其原生且完整的神经环路中进行研究已被证明在技术上具有挑战性。由于线虫具有透明的身体和相对简单的神经系统， 秀丽隐杆线虫 实现细胞特异性表达以及 体内 荧光标签和指示剂的可视化。其中包括已针对细胞质以及线粒体等不同亚细胞区室优化的荧光指示剂。本方案适用于非比率型 Ca2+ 成像 体内 具有亚细胞分辨率，可实现对 Ca 的分析2+ 可动态观察至单个树突棘和线粒体水平。此处，两种可用的遗传编码指示剂具有不同的 Ca2+ 亲和力用于演示本方案在测量相对Ca2+ 细胞质或线粒体基质中单对兴奋性中间神经元（AVA）内的水平。结合可在其中进行的遗传操作与纵向观察 秀丽隐杆线虫，该成像方案可能有助于回答有关Ca如何调控的问题2+ 调控神经元功能与可塑性

这两种方案可实现快速获取差异性钙信号2+ 单个神经突的亚细胞区域及细胞器内的水平 体内 具有高空间分辨率。第一个方案可用于测量细胞质 Ca2+ 具有高时间分辨率和空间分辨率。此处通过谷氨酸能 AVA 指令中间神经元中细胞特异性表达 GCaMP6f 来展示该方法15，其神经突沿腹神经索全长延伸。GCaMP6f荧光信号的快速采集（50 Hz）使得能够检测到钙信号的定向传播2+ 内流图2A 和 补充视频 1). GCaMP6f 荧光的亚细胞定量分析表明，Ca²⁺信号的起始发生在特定亚细胞区域2+ 神经突起某一部分的流入被延迟 10 μm 远离图 2B）。此外，本方案还实现了对区室化 Ca2+ 以及阈下 Ca2+ 事件。例如，在 AVA 神经突上发现的树突棘样结构表现出 GCaMP6f 荧光的瞬时闪...

当前方法描述了一种用于高分辨率、亚区室钙成像的非比率测量法 体内 在 秀丽隐杆线虫 使用 readily available 遗传编码钙离子指示剂.

钙离子（Ca2+）成像已被广泛用于检测神经元活动，但越来越多的研究表明，细胞内钙离子的亚细胞水平调控是一个……

该技术可用于增进我们对神经元中钙离子调控机制的理解，以及区室化的钙信号如何调节对神经元体内功能至关重要的多种机制。该技术的主要优势在于，它能够在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中实现生理条件下高分辨率的快速活体成像，并可与其他荧光工具联合使用。该技术有望在多种不同背景下揭示神经元钙信号调控的机制。例如，在衰老、神经元损伤和神经退行性变过程中。本实验操作将由本实验室的研究技术员 Ennis Deihl、博士研究生 Kaz Knight 和博士后研究员 Rachel Doser 演示。首先，克隆包含启动子、钙指示剂以及选定的3'非翻译区（3' UTR）的表达载体。通过显微注射将含有救援DNA Lin-15和钙指示剂转基因的DNA混合物注入一日龄成年秀丽隐杆线虫（C.elegans）的性腺，从而构建转基因C.elegans品系。将注射后的亲代线虫在20摄氏度条件下培养，直至F1代子代发育至成虫阶段。通过筛选无多阴门表型的转基因成虫进行选择，该表型的缺失表明含有钙离子指示剂的染色体外阵列已表达。对不具有多阴门表型的F1代成虫后代进行克隆传代。对钙指示剂表达水平最佳的转基因品系的后续世代进行实验。使用能够进行长期延时成像的显微镜。先在低倍物镜下定位线虫，然后切换至高倍物镜以定位神经元。使用能够以超过 50 FPS 速度快速采集图像的超灵敏相机获取图像。接下来，使用钙离子指示剂的标准发射滤光片。对于持续时间超过 10 秒的图像序列采集，需添加 Z 轴漂移校正器。在一支13 mm × 100 mm的玻璃培养管中，通过将分子级琼脂溶解于M9培养基中配制3毫升10%琼脂溶液，并微波加热数秒。制备琼脂垫时，首先在两张载玻片上各贴两层实验室胶带作为垫层，然后将另一张显微载玻片置于这两张载玻片之间。剪去一个1000微升枪头的尖端，用它吸取少量琼脂滴加到盖玻片中央。将另一张载玻片压在琼脂上将其压平。冷却后，用10毫升试管的开口将琼脂切割成小圆片，然后去除周围的多余琼脂。接下来，通过将蝇蕈醇粉末溶解于M9溶液中，配制30毫摩尔的储备液。将该储备液与聚苯乙烯微珠按1:1比例稀释，制成滚动溶液。为定位线虫以进行成像，首先将1.6微升滚动溶液置于琼脂垫中央。然后使用合适的线虫挑取工具，将一条所需年龄的线虫转移至琼脂垫上的滚动溶液中。等待约五分钟，使蝇蕈醇降低线虫的活动能力，随后将一块22 mm × 22 mm的盖玻片轻轻盖在琼脂垫上。若需成像腹神经索中的神经突，可通过轻微滑动盖玻片来滚动线虫。将线虫装片置于显微镜上时，先在盖玻片上滴加一滴浸油。使用低倍物镜在明场下找到线虫，然后切换至100倍物镜，利用488纳米成像激光激发GCaMP或mito-GCaMP的荧光，定位AVA神经突。进行活体GCaMP成像时，在采集设置中调节成像激光，直至基础GCaMP荧光信号处于相机动态范围的中值，并将曝光时

subcellular-imaging-of-neuronal-calcium-handling-in-vivo

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

体内神经元钙处理的亚细胞成像

为了理解新皮层中微环路的网络动态，必须同时记录大量神经元的活动。在体双光子钙成像技术是目前唯一能够以单细胞分辨率记录密集神经元群体活动的方法。...

活体小鼠第2/3层双光子钙成像

利用钙离子敏感型指示剂染料的AM酯形式，可检测发育中神经元网络的自发活动。通过单光子或双光子成像技术，可观察到指示剂荧光的瞬时变化，从而反映细胞内钙离子浓度的改变，指示神经元的激活状态。该方案可适用于多种依赖发育阶段的神经元网络研究。 体外.

发育中皮层网络的功能性钙成像

来源：Doser, R., 等. 体内神经元钙处理的亚细胞成像. J. Vis. Exp. (2023)本视频展示了对转基因秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

成像秀丽隐杆线虫神经元中的亚细胞钙动力学

凭借其微小透明的身体、详尽记录的神经解剖结构，以及一系列适用的遗传学技术和试剂， 秀丽隐杆线虫 是理想的模式生物 体内...

体内 神经元钙成像在 C. elegans 中的应用

肠神经系统（ENS）是位于肠壁内、控制肠道反射的一组神经元和胶质细胞网络。本方案描述了利用钙离子（Ca2+）成像技术在活体 ENS...

原位 Ca2+ 成像技术用于肠神经系统研究

本文介绍了利用荧光显微镜对加载了Ca2+指示剂的完整哺乳动物细胞中由IP3介导的局部Ca2+事件进行成像的技术，并提供了一种可自动识别和分析这些事件的算法。...

培养的哺乳动物细胞中局部 Ca2+ 信号的成像

我们介绍一种结合全细胞膜片钳记录与双光子成像的方法，用于在急性脑片中的神经元树突内记录 Ca2+...

脑片中神经元树突的双光子钙成像

本文介绍了一种在小鼠神经肌肉接头处对单个细胞类型的细胞群体进行钙信号成像的实验方案。...

离体成像小鼠膈肌三联突触中细胞特异性钙信号

细胞钙成像是一种多功能方法，可用于研究培养物中混合细胞群体甚至清醒动物个体细胞的动态信号传导，该方法基于钙通透性通道/受体的表达，从而产生独特的功能特征。...

利用钙成像技术可视化神经元-胶质细胞环路中的动态变化

基因编码的钙离子指示剂（GECI）可实现对感觉神经元信号传导的稳健且群体水平的分析。本文中，我们开发了一种新方法，可实现 体内 大鼠三叉神经节神经元活动的GECI可视化...

体内大鼠三叉神经节感觉神经元的钙成像

学习利用Caenorhabditis elegans进行神经元亚细胞钙成像的高分辨率技术。该方法通过基因编码钙指示剂实现体内生理条件下的快速成像，为研究神经功能与钙信号调控机制提供重要工具。

神经元钙处理的亚细胞成像在体

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