体内神经元钙处理的亚细胞成像

该技术可用于促进我们对神经元中钙处理的理解，以及区室钙如何调节对体内神经元功能重要的不同机制。该技术的主要优点是，它可以在秀丽隐杆线虫的生理条件下进行更高分辨率的快速体内成像，可以与其他荧光工具结合使用。这种技术可以在许多不同的背景下提供调节神经元钙信号传导的机制。

例如，在衰老、神经元损伤和神经变性期间。演示该程序的将是研究技术员Ennis Deihl。Kaz Knight，博士候选人，Rachel Doser，我实验室的博士后研究员。

首先克隆含有启动子的表达载体，然后是钙指示剂和三种选择的素数UTR。通过将含有钙指示剂转基因中的救援 DNA Lin-15 plus 的 DNA 混合物显微注射到一天大的成年秀丽隐杆线虫的性腺中，创建转基因秀丽隐杆线虫菌株。将注射的亲本蠕虫保持在20摄氏度，直到F1后代成年。

通过筛查多外阴表型缺失来选择转基因成虫。这表明含有钙指示剂的额外染色体阵列的表达。克隆传代没有多外阴表型的成年F1后代。

对具有钙指示剂最佳表达的后续几代转基因菌株进行实验。使用能够进行长期延时成像的显微镜。在低放大倍率物镜下定位蠕虫，然后切换到高放大倍率物镜以定位神经元。

使用能够以超过 50 FPS 的速度快速采集图像的超灵敏相机获取图像。接下来，对钙指示剂使用标准排放过滤器。添加 Z 漂移校正器，用于采集超过 10 秒的图像流。

在13×100毫米的玻璃培养管中，通过将分子级琼脂溶解在M9中并微波几秒钟来制备三毫升10%琼脂。要制作琼脂垫，首先，通过添加两层实验室胶带来准备两张载玻片。然后将显微镜载玻片放在两个载玻片之间。

切下 1000 微升移液器吸头的尖端，并用它来将一小滴琼脂移液到盖玻片的中心。通过在琼脂顶部按下另一张幻灯片来压平琼脂。冷却后，使用10毫升管的开口将琼脂切成小圆盘，然后去除周围的琼脂。

接下来，通过将麝香酚粉末溶解在M9中来制备蠕虫滚动溶液，以产生30毫摩尔的原液。用聚苯乙烯珠以一比一的比例稀释原液，制成滚动溶液。为了定位蠕虫进行成像，首先，将1.6微升的滚动溶液放在琼脂垫的中心。

然后使用首选的蠕虫镐，将所需年龄的蠕虫转移到琼脂垫上的滚动溶液中。等待大约五分钟，让麝香酚减少蠕虫运动，然后将 22 x 22 毫米的盖玻片放在琼脂垫的顶部。对于腹侧神经索中的神经突成像，通过轻轻滑动盖玻片来滚动蠕虫。

要将蠕虫安装在显微镜上，请将一滴浸油滴在盖玻片上。使用明场中的低放大倍率物镜找到蠕虫。然后切换到100倍物镜，并使用GCaMP或mito GCaMP的488纳米成像激光器的照明来定位AVA神经突。

对于体内GCaMP成像，在采集设置中调整成像激光，直到罗勒GCaMP荧光处于相机动态范围的中间范围内，并将曝光时间设置为20毫秒。使用 GCaMP 荧光以 100 倍放大倍率定位 AVA 神经突后，设置 Z 漂移校正器，并启动连续自动对焦。成像前根据需要手动校正焦平面。

以 100 倍放大倍率获取图像流。使用该协议，以高时间和空间分辨率测量细胞质钙。GCaMP6F在谷氨酸能AVA命令中间神经元中的细胞特异性表达揭示了钙内流的定向增殖。

GCaMP6F荧光的亚细胞定量显示，钙内流的开始在仅10微米外的神经突的一部分中延迟。此外，沿着AVA神经突发现的树突状脊柱状结构在GCaMP6F荧光中显示出闪光，该闪光与神经突活化无关，并且不会导致钙流入的传播。此外，使用具有AVA特异性表达线粒体基质局部钙指示剂mito GCaMP的蠕虫菌株测量单个神经突中单个线粒体中的相对钙水平。

结果显示，相对大量的钙同步摄取到线粒体的一个子集中。具体来说，钙对一些线粒体的摄取是同步的，而邻近的线粒体似乎没有吸收钙。同样，线粒体亚群显示出少量钙的快速摄取和释放。

这似乎也是同步的，但仅适用于线粒体的一个子集。速度和精细操作对于定位动物和保持神经元功能至关重要。动物健康也至关重要。

即使是一点点饥饿也是有问题的。最难学习的部分是动物的快速定向，用于共聚焦显微镜而不会损坏。我的建议是大量的练习和良好的控制。

该协议可以应用于从神经元，其他神经元或秀丽隐杆线虫中神经元以外的细胞中的其他亚细胞位置释放钙的实验。由于秀丽隐杆线虫中的这种方法使动物完好无损，因此可以解决有关完整神经系统的单个神经元体内亚细胞钙处理调节的问题。