高效生成小鼠嵌合抗原受体（CAR）-T细胞

我们的研究探索了工程菌与CAR-T细胞在实体瘤治疗中的有效联合应用。使用小鼠癌症同源模型来研究这两种细胞疗法在完整免疫系统环境下的功能，对我们而言至关重要。由于缺乏标准化的小鼠CAR-T细胞制备方案，目前在同源肿瘤模型中研究CAR-T细胞功能受到了限制。

小鼠T细胞使用传统方法进行转导和体外培养尤为困难。我们开发了此方案以简化小鼠CAR-T细胞的制备，从而能够在同源模型中开展研究，为评估新型CAR技术的活性提供重要背景。首先，将3.75毫升低血清培养基移液至标记为A的试管中，并加入105微升转染试剂以稀释培养基。

涡旋混匀管内溶液。接着，将3.75毫升的低血清培养基加入标记为B的管中。用90微升增强剂试剂稀释表达质粒。然后将A管中的内容物加入B管中，并用移液器吹打混匀，再进行孵育。

从已准备好的 Phoenix-ECO 培养板中小心移除 10 毫升细胞培养基，然后将转染混合物全部体积逐滴加入培养板中。将细胞置于 37°C 培养箱中孵育。

将MTCM病毒收获液置于37摄氏度水浴中预热。然后倾斜Phoenix-ECO培养板，用移液器吸出培养基。接着，将30毫升预热的病毒收获液缓慢加入倾斜的培养板中。

将细胞放回培养箱中。转染48小时后，收集病毒上清液，并通过0.45微米的PVDF滤器过滤。

用无菌注射器的推杆将分离的小鼠脾脏通过70至100微米的细胞筛滤入50毫升锥形管中。然后用5毫升T细胞分离缓冲液冲洗滤网。将细胞终体积调至50毫升后，用血细胞计数板计数细胞。

在4°C或室温下，以450 × g离心10分钟，使细胞沉淀。使用推荐的T细胞分离试剂盒重悬含有脾细胞的细胞沉淀。随后，通过阴性选择法分离CD3阳性T细胞。

将磁分离得到的细胞悬液转移至15毫升锥形管中。再次检测细胞数量。在4摄氏度条件下，以450 ×g离心10分钟，分离T细胞。

然后，将细胞悬液重悬于MTCM激活培养基中。向细胞悬液中加入抗体包被的磁珠和白细胞介素-2，以激活T细胞。将细胞在37°C条件下孵育过夜。

在第0天，用0.5毫升人纤维连接蛋白转导增强试剂预先包被未经处理的无菌24孔板。将培养板在4摄氏度下保存过夜。次日，从孔中移除转导试剂。

用等体积的无菌滤过、含BSA的PBS在室温下封闭孔板30分钟。孵育后，吸除BSA PBS溶液，用0.5至1毫升PBS洗涤孔板。随后，向每个预先编码的孔中加入1毫升未稀释的逆转录病毒液。

在32摄氏度下，以2000 G离心板90分钟。然后，向每个病毒负载的孔中加入1毫升活化的T细胞。再次在32摄氏度下，以450 G离心板10分钟。

将培养板在37摄氏度下孵育过夜。第5天时，重悬细胞以使活化的T细胞从抗体包被的磁珠上解离。将细胞悬液置于磁铁上30秒，然后将上清液转移至体外培养容器中。

在流式细胞术分析前，将容器置于37摄氏度的培养箱中。使用T细胞分离试剂盒获得的T细胞纯度在转导前低于98%。CAR表达率可稳定达到65%至75%。

在体外培养中加入白细胞介素7和白细胞介素15，自单个脾脏活化后第10天细胞数量扩增了15倍。T细胞在白细胞介素存在下培养后，CD8阳性与CD4阳性T细胞的比例相当。经过10天的体外培养后，观察到干细胞记忆样细胞群得以保留。