Name: 小鼠嵌合抗原受体（CAR）-T细胞的高效生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: 学习利用逆转录病毒载体转导技术高效生成小鼠CAR-T细胞的方法。该标准化方案可提升转导效率至65-75%，为实体瘤免疫治疗研究提供可靠的同源模型实验基础。

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感谢 L. Brockmann 对手稿的审阅。本工作由 NIH 1R01EB030352 和 UL1 TR001873 资助。

所有动物实验均经机构动物护理和使用委员会（哥伦比亚大学，方案编号 AC-AABQ5551 和 AC-AAAZ4470）批准，使用6至8周龄、体重在20至25克之间的雌性BALB/c或C57BL/6小鼠。实验动物购自商业来源（见材料表）。本实验方案以小鼠T细胞激活后的“激活后天数”为时间基准，病毒生产始于第-2天。逆转录病毒在初次制备后可保存于-80 °C，若后续使用本方案，可从第0天的T细胞分离与激活步骤（即步骤2）开始操作。
1. 逆转录病毒载体的制备
注意：通过将包装基因分到两个独立的质粒中（见材料表），病毒产物已被改造为复制缺陷型，从而极大降低了发生重组事件及意外产生具有复制能力病毒的可能性。
<ol>
	<li>转染前一天准备 Phoenix Eco 细胞（第 -2 天操作）。
	<ol>
		<li>使用 30 mL 培养基（Phoenix Eco 培养基，详见 表 1），将约 1 × 107 个细胞接种至一个 15 cm 的组织培养处理培养皿或 T150 培养瓶中。</li>
		<li>在 37 °C 下过夜孵育。18–24 小时后，细胞应达到约 70% 汇合度，并均匀分布，以确保获得高病毒产量且避免过度生长。 
		注：为获得最佳结果，应使用低代次细胞，并在接种前一天传代用于病毒生产。常规培养过程中切勿让 Phoenix Eco 细胞过度生长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在低血清培养基中配制含有脂质转染试剂和增强剂试剂、pCL-Eco（Gag/Pol）以及 pMSCV 表达质粒（pMSCV_PGK_mGFP28z）的转染混合液（见 材料表）（第 -1 天操作）。 
	注：共转染时，pMSCV 与 pCL-Eco 的比例应为 1:1。
	<ol>
		<li>制备 A 管：每 15 cm 培养皿，将 105 µL 转染试剂加入 3.75 mL 低血清培养基中，通过涡旋或反复吹打充分混匀。</li>
		<li>制备 B 管：每 15 cm 培养皿，将 pMSCV 表达质粒（21 µg）和 pCL-Eco（21 µg）与 90 µL 增强剂试剂一同加入 3.75 mL 低血清培养基中，通过吹打充分混匀。 
		注：若需制备多种病毒产物，可预先配制包含 pCL-Eco 和增强剂试剂的主混合液。</li>
		<li>将 A 管加入 B 管中，通过吹打充分混匀。室温孵育 10–20 分钟，总体积约为 7.5 mL。</li>
		<li>小心从 Phoenix Eco 培养皿中移除 10 mL 培养液，倾斜培养皿，沿边缘逐滴加入全部转染混合液。将细胞放回 37 °C 培养箱中继续孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染后 16–20 小时更换转染后的 Phoenix Eco 细胞培养基（第 0 天操作）。
	<ol>
		<li>使用水浴或珠浴将不含血清和 β-巯基乙醇（2-ME，见 材料表）的小鼠 T 细胞培养基（mTCM-病毒收获，见 表 1）预热至 37 °C。</li>
		<li>倾斜培养皿，将移液枪头置于底部角落，小心吸除 Phoenix Eco 培养基，如有条件可使用真空装置。避免细胞过度干燥。</li>
		<li>将预热的 mTCM-病毒收获培养基沿倾斜培养皿的侧壁缓慢加入，以最慢流速吹加 30 mL。将细胞放回 37 °C 培养箱中继续孵育。 
		注：此步骤可能导致 Phoenix Eco 细胞从培养皿脱落，从而降低病毒滴度。使用预热培养基并轻柔操作可最大限度减少干扰。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染后 48 小时收集病毒上清液（第 1 天操作）。
	<ol>
		<li>收集病毒上清液，并通过 0.45 µm PVDF 滤器（见 材料表）过滤以去除细胞和碎片。分装后于 -80 °C 冻存，或若使用新鲜病毒，则直接进入步骤 3 的第 1 天操作。</li>
		<li>通过流式细胞术测定病毒滴度（转导单位/mL），方法如前所述9。此步骤为可选。
		<ol>
			<li>在非组织培养处理的 96 孔板中，使用 1 × 105 活化的小鼠 T 细胞进行小规模转导，96 孔板预先包被连环素（retronectin，见 材料表），并加入三倍系列稀释的逆转录病毒上清液，最终体积为 100 µL 的 mTCM-病毒收获培养基。 
			注：T 细胞分离、活化及转导的详细操作见下文步骤 2 和步骤 3。</li>
			<li>转导后 4–5 天，通过流式细胞术检测 CAR 表面表达水平。</li>
			<li>根据公式10 计算病毒滴度：(N × F × D)/V，其中 N 为转导细胞数，F 为 CAR 阳性细胞频率，D 为稀释倍数，V 为转导体积（mL），结果单位为转导单位（TU）/mL。 
			注：病毒经冻融后滴度可能下降，因此建议使用冻存后再解冻的病毒测定滴度。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠T细胞分离
<ol>
	<li>分离并激活小鼠T细胞（第0天操作） 
	注意：这些步骤可在室温（RT）或 4 °C 下进行，且应在无菌环境中操作。
	<ol>
		<li>从目标小鼠品系（如 Balb/c、C57BL/6）中分离脾脏，操作步骤如前所述11 并通过机械解离获得单细胞悬液。</li>
		<li>使用无菌注射器的推杆末端，通过70-100 µm细胞筛网，将脾脏组织研磨破碎至50 mL锥形管中。</li>
		<li>将注射器放置一旁后，用5 mL T细胞分离缓冲液（含2%胎牛血清FBS的磷酸盐缓冲液PBS）冲洗滤网。</li>
		<li>重复研磨步骤，并用 5 mL T 细胞分离缓冲液再次冲洗滤网。用 T 细胞分离缓冲液将最终体积调至 50 mL。</li>
		<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数活细胞，将细胞以1:20比例稀释后，再与台盼蓝按1:1比例混合。</li>
		<li>通过离心在 450 x g 条件下离心 10 分钟，使细胞成团 g，在4°C（或室温）下重悬脾细胞，浓度为1 x 108/mL，如果使用推荐的T细胞分离试剂盒（参见 材料表). 
		注意：此阶段可将脾细胞再次通过40–70 µm细胞筛，以去除细胞团块。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离 CD3+ 根据制造商说明书，通过阴性选择法分离T细胞（参见 材料表磁分离后，将分离物转移至15 mL锥形管，并进行最终的活细胞计数。</li>
	<li>通过离心沉淀分离的T细胞，450 x g离心10分钟 g，在4 °C（或室温）下重悬至1 x 106/mL，加入mTCM活化培养基中（表1).</li>
	<li>通过加入包被有小鼠抗CD3/抗CD28单克隆抗体的磁珠激活T细胞（参见 材料表) 按照每1 × 10⁶细胞25 µL的比例6 T细胞和100 U/mL IL-2</li>
	<li>将细胞置于37 °C培养箱中过夜。 
	注意：由于T细胞体积较小，使用血细胞计数板进行手动计数时，将细胞以1:10至1:20比例稀释，并与台盼蓝按1:1混合，可获得更准确的活T细胞计数。可通过流式细胞术对细胞进行荧光标记的抗CD3抗体（αCD3抗体）染色，以测定细胞纯度。每只小鼠脾脏可获得7–10 × 10⁶个T细胞。6 T细胞因小鼠的品系和年龄而异。</li>
</ol>
3. 小鼠T细胞转导
<ol>
	<li>准备用于转导的培养板（第0天操作）。
	<ol>
		<li>预先用0.5 mL人纤维连接蛋白转导增强试剂包被未经处理的无菌24孔板（参见 材料表在无菌 PBS 中稀释至终浓度为 20–40 µg/mL，并于 4 °C 下保存过夜。 
		注意：此步骤也可在第1天进行，即用转导试剂包被未经处理的24孔板，并在室温下孵育2小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行T细胞转导（第1天操作）。
	<ol>
		<li>准备用于转导的预包被板。从预包被的24孔板的每孔中移除转导试剂，加入等体积的经无菌滤膜过滤的含2%牛血清白蛋白（BSA）的PBS（0.5 mL），于室温孵育30分钟进行封闭。</li>
		<li>用 0.5–1 mL PBS 洗涤一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从步骤1中取0.5–1 mL原液或根据病毒滴度稀释后的逆转录病毒，加入每个预先包被的孔中，于2,000 × g离心90分钟 g 和 32 °C。</li>
	<li>将1 mL活化的T细胞加入每个病毒负载的孔中，450 x g离心10分钟 g 以及32°C。将细胞放回37°C培养箱中过夜。</li>
	<li>转导后24小时，移除1-1.5 mL细胞培养基，替换为1-1.5 mL mTCM-完全培养基以及10 ng/mL重组人IL-7和IL-15（参见 材料表)。将细胞放回37 °C培养箱（第2天操作）。 
	注意：在 离体 培养过程中，每48小时需向培养体系中添加10 ng/mL的细胞因子，且T细胞浓度不应稀释至1 × 10以下6/mL</li>
	<li>转导后48小时，将细胞从转导板转移至新的24孔板或6孔板中，并将细胞放回37 °C培养箱继续培养（第3天操作步骤）。 
	注意：根据初始T细胞活力和病毒滴度，转导后24小时至2天内转移细胞可能提高T细胞存活率。</li>
	<li>去除T细胞中的磁珠，并确认CAR表达（第5-6天操作步骤）。
	<ol>
		<li>彻底重悬细胞，以使活化的T细胞从包被有αCD3/CD28的磁珠上解离（参见 材料清单）并将细胞悬液置于磁铁上静置30秒。将细胞悬液转移至目标容器中 离体 培养容器并放回37 °C培养箱中。 
		注意：T细胞可在培养瓶或深孔培养板中进行培养。建议接种的细胞密度不少于5 x 106 每孔加入30 mL mTCM-完全培养基中的T细胞，置于6孔深孔板中（参见 材料表).</li>
		<li>通过流式细胞术检测CAR表达8. 
		注意：GFP-CAR 的表达通过与 100 ng/mL 纯化的 GFP 孵育来确定。在 N 末端引入表位标签将有助于检测其他形式的 CAR 结构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>执行 离体 CAR-T细胞培养（第7-10天操作步骤）
	<ol>
		<li>在……期间 离体 培养时，每48小时更换50%的培养基，补充新鲜的mTCM完全培养基，并添加2×10 ng/mL的IL-7和IL-15。 
		注意：小鼠CAR-T细胞在激活后7天即可用于后续实验，由于解冻后存活率较低，不应进行冷冻保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Streamlined Protocol for Mouse CAR-T Cell Generation in Syngeneic Models

<ol><li>June, C. H., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy.</a> N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).</li>
<li>Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+a+clinical+lens+to+animal+models+of+car-t+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).</li>
<li>Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+CAR-T+cells+through+the+solid-tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).</li>
<li>Campesato, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+the+ahr+restricts+a+treg-macrophage+suppressive+axis+induced+by+l-kynurenine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine.</a> Nat Commun. 11 (1), 4011(2020).</li>
<li>Kaneda, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pi3kgamma+is+a+molecular+switch+that+controls+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression.</a> Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).</li>
<li>Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paving+new+roads+for+cars%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paving new roads for cars.</a> Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).</li>
<li>Giavridis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cell-induced+cytokine+release+syndrome+is+mediated+by+macrophages+and+abated+by+il-1+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade.</a> Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).</li>
<li>Lanitis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+gene+engineering+of+murine+CAR-T+cells+reveals+the+beneficial+effects+of+il-15+coexpression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression.</a> J Exp Med. 218 (2), e20192203(2021).</li>
<li>Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry-based+assay+for+titrating+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus.</a> J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).</li>
<li>Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+human+crispr-engineered+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of human crispr-engineered CAR-T cells.</a> J Vis Exp. 169, e62299(2021).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Sterile+Tissue+Harvest%22">Sterile Tissue Harvest</a>. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).</li>
<li>Giordano-Attianese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computationally+designed+chimeric+antigen+receptor+provides+a+small-molecule+safety+switch+for+t-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy.</a> Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).</li>
<li>Kuhn, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cd40+ligand-modified+chimeric+antigen+receptor+T+cells+enhance+antitumor+function+by+eliciting+an+endogenous+antitumor+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response.</a> Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).</li>
<li>Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cells+expressing+a+bacterial+virulence+factor+trigger+potent+bystander+antitumour+responses+in+solid+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers.</a> Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).</li>
<li>Kurachi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+retroviral+transduction+of+mouse+T+cells+for+in+vivo+assessment+of+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function.</a> Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).</li>
<li>Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+persistence+of+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+in+adoptive+cancer+immunotherapy%3A+Challenges+and+ways+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward.</a> Front Immunol. 11, 702(2020).</li>
<li>Elkassar, N., Gress, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+IL-7+biology+and+its+use+in+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunotoxicol%22%5BJournal%5D)">An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy.</a> J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).</li>
<li>Osinalde, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+dissection+and+comparison+of+IL-2+and+IL-15+signaling+pathways+by+global+quantitative+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics.</a> Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).</li>
<li>Eremenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+the+retroviral+transduction+of+mouse+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100719(2021).</li>
<li>Lewis, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+method+for+the+expansion+of+mouse+CD8%2B+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes.</a> J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本方案描述了逆转录病毒转导小鼠T细胞以生成用于体内研究的CAR-T细胞所需的步骤和试剂。in vivo 研究中，优化逆转录病毒转导条件可实现稳定的CAR表达，无需通过超速离心或添加其他试剂对病毒进行浓缩。然而，该方法还可进行多种改进。
尽管本方案描述了生成靶向GFP的CAR的示例，但这些方法可进行调整，以生成靶向任何感兴趣细胞外抗原的小鼠CAR-T细胞。本研究中使用的pMSCV_PGK逆转录病毒载体可通过NotI和BamHI酶切高效释放GFP特异性纳米抗体序列，也可替换为用户自定义的抗原识别结构域，例如scFv、纳米抗体或配体结合结构域（补充文件1）。为了便于评估不同CAR的表达情况，建议设计带有N端表位标签的CAR，如Myc（EQKLISEEDL）或Flag（DYKDDDDK）标签，这些标签可利用荧光标记的抗体进行检测12。此外，本研究展示了单个转基因的生产；然而，通过引入自剪切肽（2A序列）或内部核糖体进入位点（IRES），可实现多个转基因的共表达，包括用于增强T细胞在体内的功能的其他技术in vivo8,13,14。
尽管本方案通过省略超速离心（24,000 × g，2 小时，4 °C）步骤以消除对专用设备的需求，但值得注意的是，浓缩病毒上清液可获得更高的病毒滴度，并减少实现高CAR表达所需的病毒体积8。本方案还通过实现可重复的高病毒滴度（约 2 × 107 TU/mL）和稳定的CAR表达，简化了逆转录病毒载体的制备流程，且在使用前无需测定病毒滴度。然而，除了有助于标准化之外，在T细胞转导前测定病毒滴度还可能通过降低因病毒浓度过高而引起的潜在毒性，从而提高T细胞的存活率10,15。
建议补充 IL-7 和 IL-15 以促进 T 细胞扩增并维持 T 细胞记忆群体；然而，重组人 IL-2 可作为替代方案，以减少所需试剂的种类 离体 培养16,17,18,19然而，本文所述的CAR-T细胞制备方法仍受限于小鼠T细胞相对较低的扩增能力。不过，在整个转导过程中，通过在mTCM培养基中添加额外的补充成分和2-ME，可进一步改善上述提高T细胞存活率的措施。20尽管这些修饰可能使T细胞扩增倍数从15倍提高至最高20倍20可能导致转导效率降低和CAR表达减少。
最终，小鼠CAR-T细胞的制备使得能够建立同源模型，以在完整的免疫系统中评估CAR-T细胞的功能——从而对这些细胞的效力、持久性和安全性进行特定环境下的评估。而免疫缺陷小鼠模型则可用于针对人肿瘤抗原的人源T细胞产品的关键性临床前研究。这些互补模型系统的结合，对于理解CAR-T细胞生物学的复杂性、优化新型CAR结构设计，以及最终将临床前研究成果转化为有效的临床治疗手段，将是不可或缺的。

表达嵌合抗原受体（CAR）的过继性T细胞疗法通过利用适应性免疫系统的功能，特异性地靶向并清除抗原阳性癌细胞，从而彻底改变了癌症免疫治疗领域1。尽管靶向B细胞恶性肿瘤的CAR-T细胞疗法已在临床上得到验证，但在动物模型中开展的临床前研究对于开发靶向实体瘤的新一代CAR仍至关重要。然而，迄今为止，在实体瘤适应症中该疗法的临床疗效仍有限，且日益明确的是，单一的临床前模型无法准确预测这种活体药物的药效动力学和临床疗效2,3。因此，研究人员已开始扩展CAR-T细胞产品的临床前研究，同时在人源肿瘤的异种移植模型和小鼠肿瘤的同源移植模型中进行平行评估。
与将人类肿瘤和T细胞移植到免疫缺陷小鼠体内的异种移植模型不同，同源模型能够在具有完整功能的免疫系统背景下研究CAR-T细胞的应答。具体而言，携带同源肿瘤的免疫健全小鼠为研究过继转移的T细胞与特定微环境之间的相互作用提供了体系——包括肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和调节性T细胞（Tregs），这些细胞已知可在肿瘤微环境（TME）中抑制T细胞功能4,5,6。此外，同源模型还提供了一个额外的平台，用于评估靶向肿瘤但脱靶正常组织的毒性，以及CAR-T细胞与宿主因素之间的相互作用可能引发的其他毒性，包括细胞因子释放综合征7。
尽管具有这些优势，同基因型CAR-T细胞的研究数量仍然有限。值得注意的是，同基因型模型需要从相同品系的小鼠中进行自体CAR-T细胞的基因工程改造，因此由于缺乏高效的小鼠T细胞转导和体外扩增的方法，带来了额外的挑战2,8。本方案概述了通过逆转录病毒载体的制备和优化的T细胞转导实现稳定CAR表达的方法。整个流程的示意图见图1。该方法的应用证明了小鼠CAR-T细胞中高效的逆转录病毒转导，并实现了高水平的CAR表达，且无需通过超速离心浓缩病毒。此外，还讨论了改变CAR结构抗原特异性的策略以及共表达其他转基因的方法。

<table><tbody><tr><td>0.45 &amp;mu;m 滤膜</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLHVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>05-408-135</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Corning</td><td>07-201-432</td><td></td></tr><tr><td>15 cm 组织培养处理细胞培养皿</td><td>ThermoFisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>130183</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形管&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 细胞筛&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>07-201-430</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Corning</td><td>07-201-431</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT 流式细胞仪&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/C，6-8 周龄&amp;nbsp;</td><td>Jackson Laboratory</td><td>651</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白&amp;nbsp;</td><td>GOLDBIO</td><td>A-420-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液 (PBS)&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12-321-D</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 磁力架&amp;nbsp;</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 小鼠 T 细胞分离试剂盒</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19851</td><td></td></tr><tr><td>FACS 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>BDB554657</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>MT35011CV</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>G-Rex6</td><td>Wilson Wolf</td><td>80240M&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>人重组 IL-15&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-765</td><td></td></tr><tr><td>人重组 IL-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-748</td><td></td></tr><tr><td>人重组 IL-7</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-363</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 CD3 BV421</td><td>Biolegend</td><td>100228</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 CD3/CD28 Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11-453-D</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 CD4 BV605</td><td>BD</td><td>563151</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 CD44 APC&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>103011</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 CD62L PE-Cy7</td><td>Tonbo</td><td>SKU 60-0621-U025</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 CD8 APC-Cy7</td><td>Tonbo</td><td>SKU 25-0081-U025</td><td></td></tr><tr><td>配备 Prime 95B 相机的 Nikon Ti2 显微镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>未经处理的 24 孔板&amp;nbsp;</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-7524</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31-985-062</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco</td><td>Addgene</td><td>#12371</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液</td><td>Gibco</td><td>15-070-063</td><td></td></tr><tr><td>Phoenix Eco 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3214</td><td></td></tr><tr><td>pMDG.2</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>pMSCV_PGK_GFP28z</td><td>N/A</td><td>由 R.LV. 制备</td><td></td></tr><tr><td>纯化的 sfGFP</td><td>N/A</td><td>由 R.LV. 制备</td><td></td></tr><tr><td>RetroNectin（“转导试剂”）</td><td>Takara Bio</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 血清移液管</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血清移液管</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>11-360-070</td><td></td></tr><tr><td>组织培养处理的 24 孔板&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15-250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

高效生成小鼠嵌合抗原受体（car）-t细胞

Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells

利用嵌合抗原受体（CAR）-T细胞的工程化细胞疗法在血液系统恶性肿瘤患者中已展现出显著疗效，目前正被开发用于多种实体瘤的治疗。迄今为止，新型CAR-T细胞产品的初步评估主要在免疫缺陷小鼠的异种移植肿瘤模型中进行。选择该方法是为了在实验条件下促进人源CAR-T细胞的成功植入。然而，在同源小鼠模型中，肿瘤和CAR-T细胞均来源于同一种小鼠品系，可在具有完整功能的免疫系统和全面的肿瘤微环境（TME）背景下评估新的CAR技术。本文所述方案旨在通过提供逆转录病毒转导和体外 T细胞培养的标准化方法，简化小鼠CAR-T细胞的制备流程。本方案中描述的方法可应用于本研究以外的其他CAR结构，从而实现在免疫健全系统中对新型CAR技术进行常规评估。

本方案旨在标准化小鼠T细胞转导以生成小鼠CAR-T细胞的流程。 图1 详细描述了所涉及步骤。该过程始于逆转录病毒载体的制备 通过 将病毒组分共转染至Phoenix Eco细胞中。 图2 提供了转染当天Phoenix Eco细胞最佳密度的图像。随后，在转染后24小时（即本方案的“第0天”）激活分离的T细胞，为第1天的转导做准备。转导后，CAR-T细胞在重组人IL-7和IL-15存在条件下培养，以实现足够的扩增倍数，同时维持干细胞记忆样细胞群。
推荐使用小鼠T细胞分离试剂盒（参见 材料表) 采用本方案可获得T细胞纯度达 &lt;转导前经流式细胞术测定，纯度达98%图 3A此外，使用本方案及经改造后由PGK启动子驱动CAR结构表达的pMSCV逆转录病毒载体，可实现65%–75%的可重复CAR表达率。图3B, C）。逆转录病毒滴度的测定结果显示，滴度可达约 2 x 10²⁰7 TU/mL，CAR 表达率为 74%，比例为 1/3rd pMSCV 与 pCL-Eco 共转染后收集的病毒上清补充图1).
最后，在激活后第10天，使用10 ng/mL IL-7和IL-15进行ex vivo培养可实现约15倍的扩增，从单个脾脏获得约150 × 106个T细胞（图3D）。使用IL-7和IL-15培养后，CD8+和CD4+ T细胞频率相当（图3E），并且在ex vivo培养10天后，通过CD62L+CD44-表达鉴定的干细胞记忆样细胞群得以维持（图3F）。
<img alt="小鼠T细胞转导流程图、逆转录病毒制备、T细胞分离与活化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65887/65887fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：实验方案概览。 上图：方案时间线的示意图。下图：逆转录病毒载体生产及小鼠T细胞转导的逐步操作说明。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="培养细胞的显微镜图像，用于生物学研究中的细胞形态学观察。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65887/65887fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：转染的最佳细胞密度。 转染pMSCV和pCL-Eco前，Phoenix Eco细胞在最佳密度下的明场显微镜图像。使用10倍物镜拍摄。比例尺 = 200 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析；CD3+细胞，载体图谱，mGFP28z表达，CD4:CD8比例图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65887/65887fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：小鼠CAR-T细胞制备与 离体 培养。 (A流式细胞术图显示 BALB/c CD3 细胞的频率+ 小鼠T细胞分离后的细胞。B) 用于小鼠T细胞中GFP-CAR表达的pMSCV逆转录病毒载体的示意图。C流式细胞术直方图显示小鼠T细胞在与纯化的sfGFP孵育后CAR的表面表达。UT，未转导。D) CAR-T细胞在激活后第10天，经重组人IL-17和IL-15培养条件下的扩增倍数。约8 x 106 小鼠T细胞在转导前被激活，数量达到约1.28 x 108 激活后第10天。 (E流式细胞术图显示 CD8 阳性细胞的频率+ 和 CD4+ 激活后第10天的CAR-T细胞。F流式细胞术图显示 CD8 阳性细胞的频率+ 根据CD62L和CD44表面表达确定的T细胞记忆亚群。干细胞样记忆T细胞（TSCM）的特征为CD62L+CD44-，中央记忆性（TCM）通过CD62L+CD44+，以及通过CD62L鉴定效应记忆细胞（TEM）-CD44+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
表1：细胞培养基配方。 本方案中所用细胞培养基的配方详情。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887_Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充图1：CAR表面表达及逆转录病毒滴度。（A）流式细胞术直方图显示BALB/c T细胞在与纯化的sfGFP孵育后CAR的表面表达情况。逆转录病毒通过将pMSCV_PGK_mGFP28z质粒与pCL-Eco和pMD2.G（I）、仅pCL-Eco（II）或单独pMSCV_PGK_mGFP28z（III）共转染Phoenix Eco细胞而产生。T细胞按所示稀释度的逆转录病毒感染。（B）通过检测转导T细胞表面CAR表达水平测定逆转录病毒滴度。转导单位（TU）/mL按公式（N∙F∙D）/V计算，其中N为转导细胞数（1 × 105），F为CAR+细胞频率，D为稀释倍数，V为转导体积（mL）（0.2 mL）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件1：pMSCV表达载体序列。 pMSCV表达载体中GFP28z CAR及其侧翼序列（斜体）的序列，其中NotI和BamHI酶切位点以蓝色标出。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

该方案简化了逆转录病毒载体的制备及小鼠T细胞的转导过程，有助于高效生成小鼠CAR-T细胞。

高效生成小鼠嵌合抗原受体（CAR）-T细胞

利用嵌合抗原受体（CAR）-T细胞的工程化细胞疗法在血液学疾病患者中已取得显著疗效……

我们的研究探索了工程菌与CAR-T细胞在实体瘤治疗中的有效联合应用。使用小鼠癌症同源模型来研究这两种细胞疗法在完整免疫系统环境下的功能，对我们而言至关重要。由于缺乏标准化的小鼠CAR-T细胞制备方案，目前在同源肿瘤模型中研究CAR-T细胞功能受到了限制。小鼠T细胞使用传统方法进行转导和体外培养尤为困难。我们开发了此方案以简化小鼠CAR-T细胞的制备，从而能够在同源模型中开展研究，为评估新型CAR技术的活性提供重要背景。首先，将3.75毫升低血清培养基移液至标记为A的试管中，并加入105微升转染试剂以稀释培养基。涡旋混匀管内溶液。接着，将3.75毫升的低血清培养基加入标记为B的管中。用90微升增强剂试剂稀释表达质粒。然后将A管中的内容物加入B管中，并用移液器吹打混匀，再进行孵育。从已准备好的 Phoenix-ECO 培养板中小心移除 10 毫升细胞培养基，然后将转染混合物全部体积逐滴加入培养板中。将细胞置于 37°C 培养箱中孵育。将MTCM病毒收获液置于37摄氏度水浴中预热。然后倾斜Phoenix-ECO培养板，用移液器吸出培养基。接着，将30毫升预热的病毒收获液缓慢加入倾斜的培养板中。将细胞放回培养箱中。转染48小时后，收集病毒上清液，并通过0.45微米的PVDF滤器过滤。用无菌注射器的推杆将分离的小鼠脾脏通过70至100微米的细胞筛滤入50毫升锥形管中。然后用5毫升T细胞分离缓冲液冲洗滤网。将细胞终体积调至50毫升后，用血细胞计数板计数细胞。在4°C或室温下，以450 × g离心10分钟，使细胞沉淀。使用推荐的T细胞分离试剂盒重悬含有脾细胞的细胞沉淀。随后，通过阴性选择法分离CD3阳性T细胞。将磁分离得到的细胞悬液转移至15毫升锥形管中。再次检测细胞数量。在4摄氏度条件下，以450 ×g离心10分钟，分离T细胞。然后，将细胞悬液重悬于MTCM激活培养基中。向细胞悬液中加入抗体包被的磁珠和白细胞介素-2，以激活T细胞。将细胞在37°C条件下孵育过夜。在第0天，用0.5毫升人纤维连接蛋白转导增强试剂预先包被未经处理的无菌24孔板。将培养板在4摄氏度下保存过夜。次日，从孔中移除转导试剂。用等体积的无菌滤过、含BSA的PBS在室温下封闭孔板30分钟。孵育后，吸除BSA PBS溶液，用0.5至1毫升PBS洗涤孔板。随后，向每个预先编码的孔中加入1毫升未稀释的逆转录病毒液。在32摄氏度下，以2000 G离心板90分钟。然后，向每个病毒负载的孔中加入1毫升活化的T细胞。再次在32摄氏度下，以450 G离心板10分钟。将培养板在37摄氏度下孵育过夜。第5天时，重悬细胞以使活化的T细胞从抗体包被的磁珠上解离。将细胞悬液置于磁铁上30秒，然后将上清液转移至体外培养容器中。在流式细胞术分析前，将容器置于37摄氏度的培养箱中。使用T细胞分离试剂盒获得的T细胞纯度在转导前低于98%。CAR表达率可稳定达到65%至75%。在体外培养中加入白细胞介素7和白细胞介素15，自单个脾脏活化后第10天细胞数量扩增了15倍。T细胞在白细胞介素存在下培养后，CD8阳性与CD4阳性T细胞的比例相当。经过10天的体外培养后，观察到干细胞记忆样细胞群得以保留。

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高效生成小鼠嵌合抗原受体（CAR）-T细胞

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