监测小鼠乳腺癌转移灶中纳米药物的积累

我们的研究重点是在氧化铁纳米颗粒平台上使用图像引导疗法治疗乳腺癌转移。目标是开发专门针对转移组织的有效疗法，转移组织是癌症相关死亡的主要原因。确定全身治疗是否在不牺牲动物的情况下到达所需的组织可能具有挑战性。

我们的纳米颗粒可以使用 MRI 和光学成像方式进行成像，使我们能够监测药物在活体动物中的递送和积累。目前针对转移性乳腺癌的疗法并非针对转移灶，疗效参差不齐，并会引起不良副作用。我们的纳米颗粒平台专门针对转移性生态位，并允许对其递送进行无创监测，没有不良反应的证据。

以前，我们使用我们的纳米颗粒平台靶向转移驱动因素 miR-10b，并能够阻止转移和转移的生长。着眼于临床转化，我们正在研究该制剂的药效学，以优化治疗方案并最大限度地提高疗效。首先，将冷冻的 Matrigel 在 4 摄氏度下放置 24 小时，让基质提取物液化。

确定研究所需的细胞总数后，用胰蛋白酶消化细胞并用 PBS 洗涤。将细胞以 200 G 离心 5 分钟。然后将沉淀重悬于 500 微升冷冻 PBS 中以制备细胞原液。

现在，将细胞总数稀释至 40 乘以 10 到 6 个细胞/毫升的幂。然后加入等体积的冷冻基质提取物，以达到每 50 微升 6 个细胞的 1 倍的最终浓度。将混合物放在冰上，以防止提取物在植入前凝固。

将麻醉的鼠标转移到加热垫上的鼻锥上。确认麻醉的手术平面后，涂抹眼药膏以保护眼睛免受角膜干燥。然后用酒精湿巾清洁注射部位附近的皮肤，并让它干燥几秒钟。

在第 4 个乳腺处诱导，以尽量减少原发肿瘤和常见转移部位之间的信号重叠。现在，上下移液细胞原液以重新悬浮细胞。用 50 号针头将 50 微升冰冷细胞悬液吸入胰岛素注射器中。

将针头斜面直接插入所需乳腺的下方，平行于小鼠的身体，并以稳定、缓慢的速度注射细胞。完成注射后，将针头留在皮肤中至少 5 秒钟，以使 Matrigel 凝固并防止泄漏。之后，将鼠标移动到加热垫上的干净笼子上进行恢复和监督，直到它完全可以走动并且可以保持胸骨卧位。

为了监测肿瘤生长和转移发展，将每公斤体重 150 毫克的荧光素腹膜内注射到麻醉的转移性乳腺癌小鼠模型中。将小鼠放回笼子里，放在加热垫上，让它们唤醒并代谢荧光素。然后，使用成像系统扫描仪对小鼠进行成像，从注射荧光素后约 10 分钟开始。

最多 5 只小鼠以仰卧位一起成像，确保它们的整个身体都包含在视野引导标记内并尽可能笔直。使用透明胶带固定他们的手臂，以更好地观察腋窝淋巴结。现在，在成像系统软件中，将 曝光 设置为 自动，将 Binning 设置为 Medium，将 FStop 设置为 1，将 Excitation 设置为 Block，将 Emission 设置为 Open，将 FOV 设置为 D，将 Height 设置为 1.50 以进行生物发光成像。

当对原发性肿瘤进行成像时（由于其表面位置，通常会产生强信号），请将 Exposure 设置为 Auto。如果监测转移，请用黑色电工胶带小心地覆盖原发肿瘤，并手动将 Exposure 设置为 300 秒以捕获任何微弱的信号。首先，称量转移性乳腺癌小鼠，因为纳米药物剂量基于体重。

准备一个胰岛素注射器，里面有一个 29 号针头，每公斤小鼠体重中装满 10 毫克纳米铁。然后将麻醉动物的尾巴浸入 30 至 35 摄氏度的温水中 30 秒，以扩张尾静脉。之后，擦去尾部多余的水，并用 70% 酒精湿巾清洁注射部位。

现在，将针头斜面向上插入尾部外侧静脉，大约在尾部的一半处。稍微向后拉柱塞以确认位置，血液回流到针头中。成功插入后，以大约 5 到 10 秒的缓慢速度稳定注射纳米药物，注射 40 微升。

通过注射部位附近尾部皮肤下没有积聚的溶液，以及深色纳米颗粒溶液使静脉变暗来确认注射成功。用纱布在注射部位保持压力并取下针头。保持压力约 30 秒，直到出血停止。

要收集转移样本，首先使用生物发光成像对小鼠进行成像。收集转移物后，将收集的组织放入培养皿中。在成像系统软件中，将 曝光 设置为 自动，像素合并 设置为 Medium，FStop 设置为 1，激发 设置为 Block，发射 设置为 Open，FOV 设置为 D，高度 设置为 1.50 以进行生物发光成像。

对于荧光成像，将 曝光 设置为 自动，将 Binning 设置为 Medium，将 FStop 设置为 1，激发设置为 675，将 Emission 设置为 720，将 Lamp Level 设置为 High，将 FOV 设置为 D，将 Height 设置为 1.50。然后用 BLI 对小鼠尸体进行成像，以确定是否有任何剩余的癌组织值得收集。接下来，在 PBS 中冲洗收集的癌组织。

为了收集组织进行显微镜检查或定量逆转录聚合酶链反应，请将它们包埋在最佳切割温度化合物中，并储存在零下 80 摄氏度，直到准备好进行处理。为了收集组织进行电感耦合等离子体发射光谱，请使用 1.7 毫升空管去皮。将组织放入试管中并记录其重量。

冷冻组织后，将其储存在零下 80 摄氏度，直到准备好进行加工。冷冻切片:最佳切割温度，将新鲜冷冻样品嵌入 10 微米厚的显微镜载玻片上。根据组织类型，在零下 20 摄氏度和零下 15 摄氏度之间调整腔室和样品架温度。

将组织切片浸入 4% 多聚甲醛溶液中 15 分钟，将其固定在载玻片上。用 PBS 小心冲洗载玻片。然后使用含有 DAPI 的培养基将盖玻片安装到载玻片上，以可视化组织结构。

使用荧光显微镜检查组织切片的 Cy5.5 荧光，这表明纳米药物递送。通过将荧光信号与来自未注射动物的阴性对照样品进行比较，确认荧光信号不是背景噪声。Nanodrug 处理的小鼠在给药后一周在肺转移中显示出显着的生物发光信号，证实了肺组织中存在转移。

荧光成像证实纳米药物的 Cy5.5 仅在治疗小鼠的转移性肺组织中积累。