Name: 肾脏健康和肿瘤上皮细胞的微流控共培养以模拟肾癌进展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 了解微流控芯片技术模拟肾癌进展的方法，该技术利用3D生物打印和高分辨率成像研究健康肾小管与肾癌细胞球之间的相互作用，为肿瘤驱动的基因表达和炎症反应提供重要见解。

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Maryna Somova 获得了梅克伦堡-前波美拉尼亚州研究生资助法（Landesgraduiertenförderungsgesetzes）资助的格赖夫斯瓦尔德大学博士奖学金支持。作者谨此感谢格赖夫斯瓦尔德大学医学中心骨科、创伤外科与康复医学中心的 Janosh Schoon 博士和 Dirk Stobe，感谢他们在三维细胞培养和样品制备方面提供的指导。

注意：这些方案概述了制备3D胶原-琼脂糖凝胶、注射细胞、灌注样品以及提取样品进行进一步分析的完整步骤。根据具体的实验需求调整孵育时间和条件。
1. 胶原蛋白和琼脂糖凝胶基质的制备
<ol>
	<li>3D 打印 
	注意：为了为凝胶基质创建合适的形状，我们开发了一种独特的腔室设计，可将凝胶塑造成具有生理相关性的类器官形态（见补充文件 1）。
	<ol>
		<li>使用计算机辅助设计软件设计腔室。该腔室包含四个平行的区域：两个细胞区、一个基质区和一个连接通道（图 1 和 图 2）。</li>
		<li>通过 3D 打印构建腔室；加热喷嘴熔化生物塑料丝材，并逐层沉积。为遵循本方案，请使用聚丙烯（PP）这种无毒的生物塑料丝材，以及一种名为笛卡尔型的 3D 打印机（以其 XYZ 坐标系命名）。</li>
		<li>在细胞区添加倒锥形结构，以引导细胞进入通道。</li>
		<li>将基质区设计为圆形，这对形成胶原凝胶至关重要。</li>
		<li>用通道（直径 0.04 mm，图 3B）连接细胞区与基质区，使细胞能够从细胞区流入基质区并附着于管状表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RPTEC-TERT1 细胞培养用胶原基质的制备 
	注意：本步骤确保胶原基质被正确制备并装入腔室，从而为后续 RPTEC/TERT1 细胞的注射与培养以及三维细胞结构的生长提供适宜环境。所有操作均需在无菌条件下进行，以避免污染。
	<ol>
		<li>将 50 µL 的京尼平（Genipin，30 mM）与 50 µL 的氢氧化钠（NaOH，1 M）混合，使用涡旋振荡器充分混匀，制备交联溶液。</li>
		<li>将 1,000 µL 的 I 型胶原加入已制备的京尼平和氢氧化钠混合液中，同时将混合物置于冰上，以防止提前凝胶化。再次使用涡旋振荡器混匀，获得均一溶液。 
		​注意：混合过程中应持续将溶液置于冰上，以防止提前凝胶化。</li>
		<li>使用 1,000 µL 移液枪头吸取全部制备好的溶液，并向 3D 打印腔室的基质区加入 150–200 µL 溶液。</li>
		<li>将腔室置于 37 ᵒC 的 CO2 培养箱中孵育 60–90 分钟，使基质聚合。在基质上方加入 150 µL 培养基，并在培养箱中过夜孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胶原-琼脂糖基质的制备及 Caki-1 细胞的包埋 
	注意：RPTEC/TERT1 和 Caki-1 细胞均使用相同的培养基进行培养，培养基成分为 DMEM F-12 高糖培养基，添加 ITS（10 µg/mL 胰岛素、5.5 µg/mL 转铁蛋白和 5 ng/mL 硒酸钠）、10 ng/mL 表皮生长因子（EGF）、36 ng/mL 氢化可的松、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素（5% v/v）以及 10%（v/v）胎牛血清（FCS）。
	<ol>
		<li>将琼脂糖粉末溶于无菌水或 DPBS 中，使其终浓度为 2%。将琼脂糖溶液置于 85 ᵒC 的加热块上，确保完全溶解。 
		注意：由于琼脂糖溶液对温度敏感，请小心操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Caki-1 细胞包埋
	<ol>
		<li>向培养瓶中的 Caki-1 细胞加入 1× 胰蛋白酶-EDTA，并在 37 °C 下孵育至细胞脱落。加入等体积的培养基以中和 1× 胰蛋白酶。</li>
		<li>收集细胞悬液，计数后在 2,500 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中，调整终浓度为 1 × 103 个细胞/mL（Caki-1）。 
		注意：在将细胞悬液装入腔室前，确保其充分混匀且无细胞团块。</li>
		<li>向 1.5 mL 微离心管中加入 25 µL 细胞悬液。 
		注意：确保所用注射器或移液枪已灭菌，并适用于细胞操作。</li>
		<li>向含有细胞悬液的管中加入 75 µL I 型胶原，涡旋混匀。 
		注意：混合过程中应持续将混合物置于冰上，以防止提前凝胶化。</li>
		<li>加入 100 µL 熔化的 2% 琼脂糖凝胶，轻轻涡旋混匀，直至凝胶呈均一状态。 
		注意：确保细胞在凝胶中均匀分布。注射过程中避免引入气泡，否则可能破坏细胞分布和凝胶完整性！</li>
		<li>1 小时后，在基质上方加入 150 µL 细胞培养基，然后用刮铲将其从腔室中取出。将含细胞的 3D 基质转移至 24 孔板中，每孔加入 1,000 µL 培养基，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="展示微加工过程中模具设计和尺寸的3D建模示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67456/67456fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：用于肾小管重建的3D打印腔室设计。（A,B）用于容纳交联胶原基质以重建肾小管的3D打印腔室示意图。每个腔室包含四个独立的区域，用于制备等量的凝胶。1—丝材插入点，2—仅填充琼脂以防止泄漏的预腔室，3—胶原腔室，4—细胞腔室。（C）交联胶原凝胶及嵌入其中的肾小管的尺寸。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67456/67456fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养实验步骤；设备、在孔中移液、孵育、样品制备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67456/67456fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：胶原蛋白及琼脂-胶原蛋白凝胶的制备。（A） 已插入纤维丝的3D打印腔室。（B） 将交联的胶原蛋白溶液分配至腔室的孔中（C） 将装满胶原蛋白溶液的腔室放入孵育箱，以促进基质聚合（D） 在注射入胶原蛋白基质前收集RPTEC-TERT1细胞（E） 将细胞悬液加入腔室的细胞区室（F） 借助镊子移除纤维丝，使细胞能够进入基质内部的中空管状结构（G） 在1.5 mL离心管中将RCC细胞悬液与胶原蛋白混合（H） 向细胞中加入2%琼脂溶液以形成RCC凝胶（I） 将凝胶置于孵育箱中以促进基质凝胶化（J,K,L） 借助刮刀将含有肾小管的聚合胶原蛋白凝胶从3D打印腔室中取出，并转移至24孔板中，以进行后续处理（M,N,O） 借助刮刀将含有RCC细胞的聚合胶原蛋白-琼脂凝胶从腔室中取出，并转移至24孔板中，以进行后续处理 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67456/67456fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养实验；过程包括移液、密封、孵育；分析包含数据展示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67456/67456fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：微流控培养系统的组装。 (A,B) 使用专用工具打开Humimic芯片2的培养腔室 (C) 去除用于清洗芯片的培养基后，加入400 μL新鲜培养基。 (D,E) 从相应的24孔板中取出肾组织和RCC凝胶后，使用刮铲将每块凝胶转移至Humimic芯片单个灌注回路的培养腔室内。 (F,G) 将凝胶在芯片中定位后，密封培养腔室，并通过每个微流控回路中的三个微泵，使用专用管路将芯片连接至灌注单元。 (H) 芯片在培养期间置于孵育箱中 (I) 在控制单元中设置的灌注参数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67456/67456fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. RPTEC/TERT1 细胞的注射
<ol>
	<li>RPTEC/TERT1 细胞注射
	<ol>
		<li>通过加入 1× 胰蛋白酶-EDTA 并在 37 °C 下孵育，直至细胞脱落，从而从培养瓶中解离 RPTEC/TERT1 细胞。</li>
		<li>加入等体积含补充物的培养基以中和 1× 胰蛋白酶。收集细胞悬液，并在 2,500 × g 下离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中，调整终浓度为 1 × 106 个细胞/mL（RPTEC/TERT1）。在将细胞悬液加入腔室前，确保充分混匀且无团块。</li>
		<li>取 10 µL 制备好的细胞悬液，使用带 10 µL 吸头的微量移液器进行操作。确保移液器已灭菌并适用于细胞操作。通过腔室中的细胞区，将细胞悬液小心注入已固化的胶原蛋白（步骤 1.2.4）中。</li>
		<li>使用镊子轻轻取出细丝，使细胞进入基质内的中空管状结构 
		注：确保细胞在凝胶中均匀分布。注射过程中避免引入气泡，因为气泡可能干扰细胞分布并破坏凝胶完整性。</li>
		<li>将腔室置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中。60 分钟后，在基质顶部加入 150 µL 细胞培养基，防止干燥。继续孵育 24 小时，使细胞适应并整合入凝胶基质。</li>
		<li>次日，使用刮铲将基质从腔室中取出。将含细胞的 3D 基质转移至 24 孔板中，每孔加入 1,000 µL 培养基，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育。 
		注：无论是重建的肾小管还是包埋的 RCC 类球体所制备的凝胶，均将被接入微流控系统进行共培养</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 三维细胞样品的灌注
<ol>
	<li>多器官芯片系统中的三维细胞灌注
	<ol>
		<li>使用管路将含三维细胞的芯片连接至灌注系统。</li>
		<li>设置系统参数：频率：0.25 Hz，真空度：-220 mbar，压力：800 mbar，并将芯片2连接至该系统（图3）。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2的培养箱中，对三维动态细胞培养体系进行为期5天的培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 灌注采集后的三维细胞样本
<ol>
	<li>灌流后样品的收集与分析
	<ol>
		<li>从灌流系统中取出凝胶，并用 PBS 清洗。</li>
		<li>将样品置于 2% 多聚甲醛中，在室温下固定 2–3 小时。将固定后的样品储存在 4 ºC。</li>
		<li>使用染料（如 Hoechst33342、鬼笔环肽、ZO1、微管蛋白抗体）对凝胶进行染色。</li>
		<li>在使用多器官芯片系统进行 5 天灌流后，对 3D 细胞培养物及收集的培养基进行多种检测和方法分析，以评估细胞活力、形态、基因表达水平和功能变化。胶原凝胶基质中的 RPTEC/TERT1 细胞和胶原-琼脂糖基质中的 Caki-1 细胞均保持高活力；可通过活/死细胞染色等活力检测方法确认。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Renal Cancer and Healthy Tissue Co-Culture Using Microphysiological Systems

<ol><li>Ainslie, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+lung+models+to+evaluate+the+safety+of+new+pharmaceutical+modalities%3A+A+biopharmaceutical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microphysiological lung models to evaluate the safety of new pharmaceutical modalities: A biopharmaceutical perspective.</a> Lab Chip. 19 (19), 3152-3161 (2019).</li>
<li>Van Ness, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+systems+to+assess+nonclinical+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Microphysiological systems to assess nonclinical toxicity.</a> Curr Protoc Toxicol. 73, 14.18.1-14.18.28 (2017).</li>
<li>Majo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+extracellular+matrix+components+to+renal+cell+carcinoma+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Impact of extracellular matrix components to renal cell carcinoma behavior.</a> Front Oncol. 10, 625(2020).</li>
<li>Caetano-Pinto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+mediates+the+basolateral+uptake+of+phosphorothioate-modified+antisense+oligonucleotides+in+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Organs-on-a-Chip%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor mediates the basolateral uptake of phosphorothioate-modified antisense oligonucleotides in the kidney.</a> Organs-on-a-Chip. 4, 100022(2022).</li>
<li>Manduca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cancer+models%3A+One+step+closer+to+in+vitro+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">3D cancer models: One step closer to in vitro human studies.</a> Front Immunol. 14, 1175503(2023).</li>
<li>Simon, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RPTEC%2FTERT1+cell+line+models+key+renal+cell+responses+to+the+environmental+toxicants%2C+benzo%5Ba%5Dpyrene+and+cadmium%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Rep%22%5BJournal%5D)">The RPTEC/TERT1 cell line models key renal cell responses to the environmental toxicants, benzo[a]pyrene and cadmium.</a> Toxicol Rep. 1, 231-242 (2014).</li>
<li>Ogura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+high+integrity+RNA+extraction+from+cell%2Fagarose+construct%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Methods of high integrity RNA extraction from cell/agarose construct.</a> BMC Res Notes. 8, 644(2015).</li>
<li>Glube, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caki-1+cells+represent+an+in+vitro+model+system+for+studying+the+human+proximal+tubule+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Exp+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Caki-1 cells represent an in vitro model system for studying the human proximal tubule epithelium.</a> Nephron Exp Nephrol. 107 (2), e47-e56 (2007).</li>
<li>Kühnl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+application+scenario-dependent+pharmacokinetics+and+pharmacodynamic+properties+of+permethrin+and+hyperforin+in+a+dynamic+skin+and+liver+multi-organ-chip+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of application scenario-dependent pharmacokinetics and pharmacodynamic properties of permethrin and hyperforin in a dynamic skin and liver multi-organ-chip model.</a> Toxicology. 448, 152637(2021).</li>
<li>Padmyastuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic-based+prostate+cancer+model+for+investigating+the+secretion+of+prostate-specific+antigen+and+microRNAs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Microfluidic-based prostate cancer model for investigating the secretion of prostate-specific antigen and microRNAs in vitro.</a> Sci Rep. 13 (1), 11623(2023).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-on-a-Chip%3A+Models+for+studying+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Cancer-on-a-Chip: Models for studying metastasis.</a> Cancers (Basel). 14 (3), 648(2022).</li>
<li>Sobczuk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+right+animal+model+for+renal+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Choosing the right animal model for renal cancer research.</a> Transl Oncol. 13 (3), 100745(2020).</li>
<li>Ewart, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+assessment+and+economic+analysis+of+a+human+Liver-Chip+for+predictive+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Med%22%5BJournal%5D)">Performance assessment and economic analysis of a human Liver-Chip for predictive toxicology.</a> Commun Med. 2 (1), 154(2022).</li>
<li>Caetano-Pinto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+cancer+and+chronic+kidney+disease%3A+Too+close+for+comfort%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Kidney cancer and chronic kidney disease: Too close for comfort.</a> Biomedicines. 9 (12), 1761(2021).</li>
<li>Del Piccolo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-on-chip+modeling+of+organ-specific+cancer+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Tumor-on-chip modeling of organ-specific cancer and metastasis.</a> Adv Drug Deliv Rev. 175, 113798(2021).</li>
<li>Soo, J. Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+predictive+in+vitro+models+of+drug-induced+nephrotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Advances in predictive in vitro models of drug-induced nephrotoxicity.</a> Nat Rev Nephrol. 14 (6), 378-393 (2018).</li>
<li>Chapron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+vascularized%2C+dual-channel+microphysiological+system+facilitates+modeling+of+proximal+tubular+solute+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Pharmacol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">An improved vascularized, dual-channel microphysiological system facilitates modeling of proximal tubular solute secretion.</a> ACS Pharmacol Transl Sci. 3 (3), 496-508 (2020).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究中描述的方案代表了一种复杂的肾癌模型的建立，该模型利用微流控系统，在特定的胶原蛋白和胶原-琼脂糖凝胶基质中整合两种不同的细胞类型——肾近端小管上皮细胞（RPTEC/TERT1）和肾细胞癌（Caki-1）细胞。胶原凝胶的制备对该模型的成功至关重要。必须精确控制胶原蛋白和琼脂糖的浓度，以在整个灌注过程中维持基质的结构完整性。在可长达2周的培养过程中，基质必须在微流控系统周期性灌注所产生的压力下保持柔韧性和一致性。基质的不均匀可能导致结构损伤，进而引起肾小管的解体；因此，实现凝胶内的均一性是另一个关键步骤（图6）。通过充分涡旋混合物以实现均匀分布，可确保这一均一性。
<img alt="显示真菌生长阶段的显微镜图像、培养皿实验、菌丝结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67456/67456fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" dat...

三维细胞培养系统的进步通过提供比传统二维培养更接近生理条件的模型，彻底改变了组织工程和再生医学领域1,2。在本研究中，我们采用了胶原蛋白和胶原蛋白-琼脂糖凝胶基质，因其能够模拟细胞外基质（ECM）环境，促进更准确的细胞行为和功能，同时与所采用的动态培养条件相容。
胶原蛋白是细胞外基质（ECM）中最丰富的蛋白质，在维持组织的结构完整性和生物学活性方面发挥着关键作用3。I型胶原蛋白通常来源于大鼠尾部，因其具有良好的生物相容性，并可调节以满足不同基质刚度条件，同时为上皮细胞提供经过验证的生长基底，因而被广泛使用4。在三维胶原蛋白基质中，肾细胞获得支持其黏附、增殖和分化的支架结构。该环境使细胞能够表现出更接近自然的形态和行为，包括反映体内（in vivo）状态的基因表达模式和细胞间相互作用5。因此，由于胶原蛋白凝胶能够模拟细胞外基质的支持与调控功能，已被广泛应用于从癌症研究到组织工程等多个领域。
使用永生化的肾近端小管上皮细胞系 RPTEC/TERT1 来代表健康的肾上皮组织。该细胞系过表达人端粒酶逆转录酶，使其能够在培养中增殖，同时维持典型的 RPTEC 表型。采用大鼠尾部胶原蛋白 I 型凝胶基质以重建肾脏微环境。这种胶原蛋白凝胶基质有助于 RPTEC/TERT16 细胞保持其固有特性及生理功能。相比之下，肾细胞癌（Caki-1）细胞的培养则使用一种胶原蛋白-琼脂糖杂合凝胶基质。琼脂糖是一种源自海藻的多糖，为三维细胞培养系统提供了新的维度。它具有热可逆性，便于在制备过程中进行操作和处理7。琼脂糖凝胶提供了一种中性的支持性基质，可维持细胞活力，并促进癌细胞增殖形成复杂的结构。当与胶原蛋白结合时，所形成的杂合凝胶兼具胶原蛋白提供的生化信号和琼脂糖提供的结构支撑。这种组合为肾细胞癌（RCC）Caki-1 细胞的生长形成球状体创造了适宜的微环境8，并被用作肾癌模型。
在RPTEC/TERT1和Caki-1细胞中使用这些不同的3D基质，凸显了根据不同类型细胞的特定需求定制细胞外基质（ECM）环境的重要性。本研究将包含RPTEC（代表健康的肾上皮组织）或Caki-1细胞（代表肾细胞癌，RCC）的凝胶整合到一个微流控系统中，该系统在细胞之间循环培养基，从而在无直接接触的情况下，使健康肾细胞模型暴露于RCC细胞的分泌物中。本研究所采用的TissUse HUMUMIC平台9,10（下文简称多器官芯片平台）由一个具有两个独立流体回路的微生理芯片组成，流体由外部灌注单元驱动。

<table><tbody><tr><td>1.5-2.0 mL&amp;nbsp;离心管&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>003012/10237-20205</td><td></td></tr><tr><td>24孔板&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922.500</td><td></td></tr><tr><td>3D打印机&amp;nbsp;</td><td>Prusa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>3810.3</td><td></td></tr><tr><td>AutoDesk Tinker CAD软件</td><td></td><td></td><td>计算机辅助设计软件</td></tr><tr><td>Caki-1细胞&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-46</td><td></td></tr><tr><td>半胱天冬酶活性</td><td>Promega</td><td>G8090</td><td>半胱天冬酶3/7检测</td></tr><tr><td>细胞活力</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td>Cell Titer Glo检测</td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白 &amp;ndash; 大鼠尾部来源，3.0 mg/mL</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/12F培养基&amp;nbsp;</td><td>PAN Biotech</td><td>PO4-41650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS溶液&amp;nbsp;</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-53500</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>E4127</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3033</td><td></td></tr><tr><td>京尼平（30 mM）&amp;nbsp;</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>G4796</td><td></td></tr><tr><td>HUMIMIC芯片2&amp;nbsp;</td><td>TissUse</td><td></td><td>多器官芯片</td></tr><tr><td>HUMIMIC控制单元&amp;nbsp;</td><td>TissUse</td><td></td><td>多器官芯片控制单元&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氢化可的松&amp;nbsp;</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>H6909</td><td></td></tr><tr><td>培养箱（37 &amp;deg;C，5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）&amp;nbsp;</td><td>nd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰岛素、亚硒酸钠、转铁蛋白（IST）</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>乳酸脱氢酶释放</td><td>Promega</td><td>J2380</td><td></td></tr><tr><td>金属刮刀&amp;nbsp;</td><td>nd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH（1 M）&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>P031.2</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯（PP）耗材丝&amp;nbsp;</td><td>Verbatin</td><td>55952</td><td></td></tr><tr><td>RNA-easy提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RPTEC/TERT细胞&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL - 4031</td><td></td></tr><tr><td>TNF-α ELISA</td><td>R&amp;D Systems</td><td>DY210-05</td><td></td></tr><tr><td>三碘甲腺原氨酸（T3）</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>709611</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-021100</td><td></td></tr></tbody></table>

利用微流控共培养健康与肿瘤肾上皮细胞模拟肾癌进展

Microfluidic Co-culture of Renal Healthy and Tumor Epithelium to Model Kidney Cancer Progression

微生理系统（MPS）已实现将更复杂且更具生理相关性的要素引入 体外 模型，在三维环境中重现了复杂形态特征，并实现了传统模型所缺乏的动态相互作用。我们建立了一种肾细胞癌（RCC）共培养模型，以模拟健康与恶性肾组织之间的相互作用。 
该模型基于所引用的多器官平台，通过将重建的肾近端小管与肾细胞癌（RCC）类球体共培养构建而成。采用定制设计的3D打印培养室，用于培养人肾上皮近端小管细胞（RPTEC），并促进其在I型胶原基质中自组装形成肾小管结构。Caki-1 RCC细胞被包埋于琼脂-胶原基质中，随后形成癌性类球体。胶原基质以及琼脂/胶原凝胶均经过优化，以确保在至少7天的培养期内，能够维持结构完整性，并耐受周期性灌注过程中的剪切应力。
凝胶还能提供充足的营养供应并支持细胞分泌。此外，琼脂/胶原蛋白凝胶可限制肾细胞癌（RCC）细胞的过度增殖，从而确保类球体尺寸相对均一。MPS芯片的微流控回路由两个独立的培养腔室组成，其尺寸与标准96孔微孔板的孔相同。肾小管和RCC凝胶分别占据不同的腔室，并共享相同的培养基，培养基每分钟循环约两次。在这些条件下，我们观察到肾小管中免疫因子的表达和分泌上调（白细胞介素-8和肿瘤坏死因子-α）。在RCC的影响下，肾小管的代谢活性也向糖酵解方向转变。这一新方法表明，基于共培养的MPS可增强RCC研究的复杂性 体外 并可用于研究癌症对非肿瘤细胞的影响。

HUMIMIC 系统提供了一个动态环境，可在长时间内持续供应营养物质和氧气并清除代谢废物，从而维持细胞的存活率和功能。这类系统在构建复杂的器官芯片模型以模拟特定组织的微环境方面具有显著优势。该系统专为器官芯片应用而设计，可精确控制流体流动和剪切应力，而这些正是模拟组织和器官生理条件的关键因素。
本研究中，我们利用HUMIMIC灌注系统在三维（3D）环境中培养肾近端小管上皮细胞（RPTEC/TERT1）和肾癌细胞（Caki-1）。HUMIMIC芯片包含两个回路，每个回路有两个用于放置3D细胞培养物的腔室。这些腔室通过一个通道相连，可在灌注单元产生的压力下实现培养基、营养物质和氧气的灌注。灌注单元为手动控制，压力设置为0.25 Hz。在37 °C的CO2培养箱中灌注5天后，分别收集样品和培养基用于分析（图3）。
可通过多种方法从模型中提取全面的定量数据，这些方法包括在实验过程中于不同时间点收集灌注液，或在实验终点通过处理收集的灌注液和凝胶来获取数据。...

在此，我们介绍了利用胶原蛋白及胶原蛋白-琼脂糖基质在微生理系统中建立三维细胞培养的具体操作方案。这些方案支持肾近端小管细胞与肾细胞癌球状体的共培养，以模拟 体内 条件，并实现对肾癌细胞相互作用的深入研究。

微生理系统（MPS）已实现在体外模型中引入更复杂且更具生理相关性的元素，重现……

我们的研究采用一种基于器官芯片的肾癌模型，用于探究健康肾细胞与癌变肾细胞之间的相互作用。该系统有助于模拟体内环境，使我们能够研究肿瘤驱动的基因表达变化、炎症反应以及代谢改变。同时，该模型也为肾癌的进展过程及其对周围健康组织的影响提供了清晰深入的见解。先进的肾癌芯片系统采用了多种技术，如微流控、三维生物打印、高分辨率成像、实时生物传感器、RNA测序和CRISPR筛选。这些技术使我们能够精确模拟体内肾脏环境，从而研究细胞反应和基因表达变化。在微流控实验中实现可重复性具有很大挑战性。精确的液体操作等技术问题可能导致结果出现变异。此外，复杂的实验流程中流速和环境条件的波动也会进一步影响结果的一致性。我们即将开展的研究将聚焦于鉴定与肾癌进展相关的微小 RNA 特征，并评估其作为疾病生物标志物的潜力。首先，使用计算机辅助设计软件设计包含四个平行腔室的所需装置。该装置必须包含两个细胞腔室、一个基质腔室以及一个连接通道。为进行3D打印，需通过加热喷嘴熔化生物塑料丝材（特指聚丙烯），并逐层沉积成型。打印后，将1,000微升I型胶原蛋白与京尼平和氢氧化钠溶液混合，并始终保持混合物处于冰上。小心地将琼脂和胶原蛋白溶液分别加入3D打印腔室的相应基质隔室中。将腔室置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中60至90分钟，使基质聚合。然后在基质上加入150微升培养基，并过夜培养。对于caki-1细胞包埋，取25微升细胞悬液，加入75微升I型胶原蛋白至1.5毫升微量离心管中。充分涡旋混匀混合物。现在，小心地向管中加入 100 微升熔化的 2% 琼脂糖凝胶，并继续涡旋振荡，直至凝胶变得均匀。将培养室放入培养箱中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养。一小时后，在基质上方加入 150 微升细胞培养基，以防止干燥。次日，使用刮铲将基质从培养室中取出。将含有细胞的三维基质放入含有 1,000 微升培养基的 24 孔板中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。注射 RPTEC/TERT1 细胞时，将 10 微升细胞悬液吸入带有 10 微升吸头的微量移液器中。通过腔室中的细胞仓，将细胞悬液小心地注入先前制备好的已凝固胶原基质中。将腔室置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。60分钟后，在基质上方加入150微升细胞培养基，以防止干燥，并继续培养细胞24小时。接下来，使用刮铲将基质从培养室中取出，放入含有 1,000 µL 培养基的 24 孔板中，在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。现在将凝胶加入芯片中。使用管路将含有 3D 细胞基质的芯片连接至灌注系统。设置系统参数并将芯片放入培养箱中。灌注完成后，从灌注系统中取出凝胶，并用 PBS 清洗。免疫荧光染色证实了肾小管的典型形态，表现为连续的、位于凝胶中央的紧密单层结构。肾细胞癌球体呈圆形且大小均匀。在未进行处理的培养期间，细胞活力保持

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