实验室工程胶质母细胞瘤类器官培养和药物筛选

在这里，我们概述了一个全面的方案，用于生成和利用实验室工程的胶质母细胞瘤类器官 （LEGO） 来研究基因型-表型依赖性并筛选用于胶质母细胞瘤治疗的潜在药物。

该方法为使用类器官模拟人胶质母细胞瘤提供了一种新模型。通过生成这个类器官模型，我们可以用它来定义人类GBM中基因型和表型之间的关系，也可以将其用于药物筛选应用的个性化治疗。

我们目前面临的挑战是，目前现有的胶质母细胞瘤模型，如转基因小鼠或患者来源的异种移植物，它们无法准确复制肿瘤基因型如何影响分子表型。例如，这些模型尚未显示大象突变与胶质母细胞瘤特征之间的联系。

我们已经使用了这个非常新的模型。通过模型组学方法进行分析，我们可以建立基因型和甲基化组蛋白质组之间的联系，以及代谢组学异质性。此外，我们已经使用 FDA 批准的药物进行了单一药物筛选。我们可以确定对人类 GBM 的特定基因型有效的药物，这为未来的个性化 GBM 治疗铺平了道路。

[导师]首先，用两种传代试剂分别消化培养的iPS细胞四分钟。将细胞以 120 x g 离心五分钟，然后轻轻移液以将细胞重悬于单细胞悬液中。计数细胞后，将 1 x 10 的 4 个单细胞 iPSC 接种到骨髓基质胶包被的 48 孔板的每个孔中。在含有 10 微摩尔岩石抑制剂的人胚胎细胞合格培养基中培养 24 小时。接下来，用含有表达荧光素酶的质粒和每毫升聚苯八微克的慢病毒感染细胞。六小时后，用新鲜的人胚胎细胞合格培养基替换培养基。24小时后，向细胞培养基中加入每毫升荧光素酶底物150微克。然后使用生物发光成像设备曝光五秒，检查生物发光成像信号。接下来，将每毫升 2 微克嘌呤霉素添加到培养基中。孵育两天，每隔一天更换一次培养基，持续一周以扩增细胞。当细胞达到70%汇合度时，分别用两种传代试剂消化iPS细胞四分钟。以 120 x g 离心 5 分钟，然后轻轻移液以将细胞重悬于单细胞悬液中。计数细胞后，以每 10 厘米培养皿 50 个细胞的密度接种单个细胞，用于两个培养皿。检查生物发光成像信号。在显微镜下，使用灭菌的10微升移液器吸头挑选具有强烈生物发光成像信号的克隆。在跪下引导RNA寡核苷酸后，将质粒线性化PX330A1X2并用BbsI酶PX330S2。在室温下使用 T4 连接酶将其中一个引导 RNA 与 PX330A1X2 或 PX330S2 质粒连接 4 小时。然后用 BsaI 酶消化产生的两个质粒，然后使用凝胶提取纯化产物。在室温下使用 T4 连接酶将引导 RNA 支架从 PPX330S2 gRNA 质粒连接到线性化的 PX330A1X2 gRNA 质粒 4 小时。通过用 EcoRI 消化，然后在室温下连接 T4 四小时，将 PX459 质粒中的嘌呤霉素抗性基因克隆到所得质粒中。将消化的iPS细胞以120×g 离心5分钟，然后将它们重悬于人胚胎细胞合格培养基中。计数细胞并将它们分成几个管后，以 120 x g 离心五分钟。将 15 微克质粒混合在 135 微升重悬缓冲液中。然后使用 120 微升混合物重悬细胞沉淀。在1,200伏电压下用两个脉冲电穿孔细胞20毫秒，并将所得细胞接种在含有人胚胎细胞合格培养基的六孔板的一个孔中，以促进单细胞存活。每12小时向培养基中加入每毫升2微克嘌呤霉素，持续两天，然后在收获前扩增细胞一周。现在用两种传代试剂分别消化具有最高敲除效率的iPSCs四分钟。以 120 x g 旋转细胞 5 分钟后，将它们重悬于人胚胎细胞合格培养基中。在两个 10 厘米的培养皿中接种大约 100 个细胞，培养皿中装有预热的人胚胎细胞合格培养基，并补充有试剂以促进单细胞存活。当单细胞菌落的直径在三到五毫米之间时，在显微镜下使用10微升移液器吸头挑选它们，并在两个孔的48孔板中扩增。从48孔板的一个孔中提取DNA后，进行聚合酶链反应。对iPSC进行CRISPR-Cas9敲低后，分别用两种传代试剂消化iPS细胞4分钟。将细胞以 120 x g 离心 5 分钟，然后使用低 bFGF hES 培养基重悬于单细胞悬液中。 细胞计数后，将适当数量的细胞添加到指定的培养环境中。向低 bFGF hES 中加入 50 微摩尔岩石抑制剂和每毫升 6 纳克 bFGF。将含有 9,000 个细胞的 150 微升细胞悬液接种到 96 孔超低附着板的每个孔中。在第三天，从每个孔中取出 80 微升旧培养基，并加入 150 微升新鲜的低 bFGF hES 培养基。当胚样体开始变亮并形成光滑边缘时，用150至200微升新鲜神经诱导培养基替换旧培养基。在组织培养显微镜下观察胚样体，选择边缘周围较亮的胚体。使用切割的 200 微升宽移液器吸头，将选定的类胚胎体转移到类器官包埋片上。去除多余的培养基后，将 30 微升骨髓基质滴到类器官上。使用10微升移液器吸头，将胚样体放置在液滴的中心。将骨髓基质液滴洗掉到含有三毫升 NeuroDMEM-A 培养基和三微摩尔CHIR99021的六孔板中。将六孔板放在培养箱中以 75 RPM 旋转的摇床上。将所需发育年龄的类器官转移到含有一毫升NeuroDMEM + A培养基的24孔板中，每孔放置一个类器官。在摇床上孵育 15 至 30 分钟之前，向每个孔中加入每毫升 150 微克 D-荧光素。在第零天，将类器官与荧光素孵育并检查生物发光后，将二甲基亚砜或感兴趣的药物应用于类器官培养基中。一旦类器官连续处理6至10天，向培养基中加入100微摩尔溴脱氧尿苷，并将类器官在二氧化碳培养箱中孵育两小时。与野生型同基因对照相比，源自突变 iPSC 的乐高积木在三个月内表现出增加的扩增。乐高在培养一个月后表现出非典型核特征，表明潜在的恶性转化。乐高积木的有效药物治疗导致生物发光成像信号显着降低，而无效治疗则没有明显的信号变化。