马铃薯根系植物寄生线虫的体内和体外感染用于评估诱导结构变化

该方案描述了在体内温室条件下用植物寄生线虫感染马铃薯根和马铃薯体外转基因根，用于通过光学显微镜对根结构进行组织化学分析。

农作物寄生线虫感染的研究受到环境条件变化的影响，这会显着影响实验结果和数据可重复性。

我们已经开发了马铃薯转基因根的体外培养物，以植物寄生线虫作为一种可靠的替代品，占用更少的空间，需要更少的时间来获得，并且没有污染或宿主遗传变异。

跟踪作物根部线虫感染的时间进展仍然具有挑战性。差异染色技术为识别感染部位和精确区分线虫生命阶段提供了一种可靠的方法。

与温室试验相比，马铃薯重根支持连续的控制系统，可提供线虫发育的所有阶段，不受季节或气候变化的影响。

因此，所描述的协议提供了几个有前途的未来应用。例如，它可以对分子和细胞机制进行详细研究，从而深入了解植物寄生线虫如何感染和纵宿主。

[旁白]首先，用流动的自来水清洗胡萝卜，然后用普通的洗涤剂溶液去除碎屑。用纸巾擦干后，将消毒过的金属串插入胡萝卜顶部，向内约一到两厘米。使用装有喷嘴的清洗瓶，用 96% 乙醇润湿胡萝卜。在消毒过的滤纸上吸干胡萝卜的底端。然后小心地将其通过火焰。用无菌削皮器，从上到下剥胡萝卜，重复燃烧。丢弃顶部和底部后，将中间部分放入无菌培养皿中。使用无菌刀片和镊子，切下一厘米厚的部分。将切片转移到无菌培养皿中。密封盘子后，每面在紫外线下放置60分钟，对胡萝卜盘进行消毒。将胡萝卜盘在25摄氏度的黑暗中孵育一到两周。接下来，用无菌刀片在胡萝卜盘的中心做一个 X 形切口，只切一半深。将含有至少 50 个混合生命阶段的 50 微升根病斑线虫悬浮液移入切口。密封培养皿后，在25摄氏度的黑暗中孵育长达三个月。要提取根病斑线虫，将可见坏死的胡萝卜盘转移到放置在无菌玻璃碗中的直径为8厘米的75微米网筛中。接下来，将抗生素溶液倒在筛子上，直到圆盘被覆盖。在黑暗中孵育过夜后，使用灭菌移液器将线虫从碗底转移到灭菌的玻璃染色块中。将一毫升抗生素溶液移液到染色块中，让线虫沉降30至40分钟。移出用过的抗生素溶液，重复洗涤过程四到五次。立即使用根病斑线虫混悬液，或储存在11摄氏度。选择相同大小的马铃薯块茎，丢弃任何有孔、瘀伤或柔软部分的马铃薯块茎。在五升的盆中装满高压灭菌器土壤和沙子的一对一混合物，并混合 22.5 克缓释 NPK 肥料。然后将土豆播种在土壤表面以下九厘米的深度。将花盆放在湿度为 50% 至 70% 的温室中。经常浇水，将土壤湿度保持在最大持水能力的 70%，避免极端温度。马铃薯植物出现后，在每株植物周围均匀分布的四到六个孔以查看深度。将含有 30,000 个活的混合生命阶段根病斑线虫的 8 毫升悬浮液移入孔中。然后，用土壤混合物盖住孔。对于对照盆和含有根病线虫的盆，接种当天不要浇水。培养两个月后，将马铃薯植株连根拔起，将芽和根分离称重。仔细清洗根系。使用适当的染色技术检查 RLN 攻击位点的根源。将洗净和消毒的马铃薯块茎放入容器中。用 25% 的商业漂白剂溶液覆盖块茎。关闭容器并混合 15 分钟。处理漂白剂后，用消毒过的自来水冲洗块茎三次。接下来，在流动罩中，将块茎浸入 80% 乙醇溶液中 15 分钟，剧烈搅拌。移出乙醇后，用消毒过的自来水冲洗三次。用无菌手术刀去除块茎的外围部分。将内部中心部分分成 0.5 厘米厚的段。要接种切片，首先将一毫升根瘤菌悬浮液与九毫升SH培养基混合。将无菌手术刀的尖端浸入稀释的悬浮液中，并在马铃薯段的表面缠绕五次。片段干燥后，将它们放在半固体SH培养基上，并在25摄氏度下在黑暗中孵育三天，以促进质粒转染。 在第三天结束时，将感染的片段转移到含有补充有抗生素的半固体SH培养基的板中。三个月后，使用无菌镊子收集一簇一克的转基因根。用新鲜的半固体无抗生素SH培养基将根转移到板的中心。要收集线虫卵块，请获得根虫瘿。使用一对无菌超细点镊子在设置为 20 倍放大倍率的双目体视显微镜下小心地提取卵块。将卵块放入装有 5 毫升无菌自来水的有盖培养皿中，让它们孵化 48 小时。接下来，在流动罩中，将每毫升含有 100 个线虫的 5 毫升 J2 悬浮液移液到 20 微米网筛上。用无菌自来水洗涤后，将含有J2线虫的筛子下半部分浸入20%的过氧化氢溶液中，打圈搅拌15分钟。将无菌自来水通过筛子分配在线虫上，并重复洗涤过程两次。倾斜筛子，使线虫在最后一次洗涤时聚集在边界处。然后，从筛子边界移液一毫升无菌超纯水以回收线虫。在流动罩中，将一克马铃薯转基因根丛与 100 个不育线虫一起传代培养到 SH 平板上。在倒置显微镜下以 100 倍放大倍率定期监测共培养。当卵块变得可见时，将根传代培养到新的SH培养基板上。使用胡萝卜盘导致线虫数量在三个月内平均增加 100 倍。马铃薯植株在低根病斑线虫种群数下没有表现出明显的症状。用酸性品红染色后，在根皮层观察到 Pratylenchus penetrans 的几个生命阶段，表明组织渗透，相关坏死病变在感染区域清晰可见。马铃薯转基因根的发育显示出马铃薯块茎切片中手术刀诱导的伤口的初始细胞质量生长，随后出现转基因根。在培养基中观察到根系的持续生长，根团成功转移到新鲜培养基中继续生长。马铃薯转基因根系培养物成功感染Meloidogyne chitwoodi二期幼鱼，建立植物线虫共培养物。在受感染的培养物中观察到含有成年雌性和卵团的根虫瘿。转基因马铃薯根系感染后，可以看到由 Meloidogyne chitwoodi 形成的胆组织，具有可识别的线虫发育和繁殖的不同阶段，包括卵团和卵的形成。