Name: 体内研究成年果蝇味觉诱导神经反应的钙成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 了解利用钙成像技术在清醒果蝇中记录味觉诱导神经反应的方法。该技术可识别对氨基酸产生反应的味觉细胞，并研究内部状态如何调节味觉反应，为理解中枢神经系统中的味觉处理提供重要见解。

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我们感谢布卢明顿果蝇资源中心（Bloomington Drosophila Stock Center）提供的果蝇品系，以及佛蒙特大学IMF实验室在定制成像腔体制备过程中提供的帮助。同时感谢BioRender在图形插图制作方面的支持，以及Kayla Audette在这些图形设计中的贡献。本研究得到了佛蒙特大学新实验室启动资金和美国国家科学基金会资助项目（资助号：2332375）的支持。图1中的图形由&#160;www.BioRender.com生成。

本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 成虫血淋巴样（AHL）溶液的制备
<ol>
	<li>配制一种含有 108 mM NaCl、5 mM KCl、4 mM NaHCO3、1 mM NaH2PO4、5 mM HEPES 和 15 mM 核糖的储备液。 
	注意：核糖作为一种非能量性糖类，用于维持渗透压，同时不改变脑组织中的营养水平。</li>
	<li>在过滤前将该溶液的 pH 值调节至 7.5，并于 4 °C 下保存。调节 pH 后应检测 AHL 的渗透压，以确保不同批次之间的一致性。</li>
	<li>分别配制 1 M CaCl2 和 1 M MgCl2 的储备液，过滤后室温保存。</li>
	<li>为制备主 AHL 储备液的分装液，加入少量钙和镁溶液，使终浓度分别为 2 mM 钙和 8.2 mM 镁。该 AHL 溶液可在 4 °C 下保存，最多使用一个月；实验时取小份分装液恢复至室温后使用。</li>
</ol>
2. 将果蝇固定在成像室中
<ol>
	<li>在固定果蝇之前，使用磨刀石将牙科蜡笔的尖端磨成一个小的锥形杯状（图1D）。将磨好的尖端安装到蜡笔上并开启电源进行预热。加热温度需根据尖端的类型和长度调整：必须达到使蜡接触后保持熔化的最低温度（本示例中为50.5 °C）。 
	注意：也可用金属丝缠绕在牙科蜡笔末端，以固定一个磨尖的金属头作为替代方法。</li>
	<li>轻柔地麻醉1–5只果蝇（遵循机构批准的操作规程）。应尽量减少麻醉暴露时间，因为长时间暴露于CO2或低温会影响果蝇行为。使用CO2时，应在解剖显微镜下通过果蝇板提供持续且均匀的99.9% CO2气流，流速为5 L/min。</li>
	<li>使用解剖剪刀切除部分腿部，具体操作为在中足和后足的股节/胫节关节处剪断，前足则在转节处剪断。使用钝头镊子辅助操作以更好地操控果蝇。修剪跗节可防止跗节感知刺激而导致果蝇踢动盖玻片或味觉刺激器。</li>
	<li>用钝头镊子夹住果蝇翅膀将其提起，调整位置使果蝇头部位于成像室目标颈槽上方，而身体位于下方。开始时将果蝇完全置于右侧或左侧较为方便。使用剪刀的钝面和钝头镊子，同时轻推果蝇的头部和胸部，使其进入槽内。</li>
	<li>当果蝇已牢固进入槽内后，将其推至槽的后部，并轻轻调整位置，使果蝇面朝成像室前方。注意避免头部相对于胸部过度旋转而偏离正常对齐位置。</li>
	<li>根据需要重复上述步骤处理更多果蝇（该成像室最多可固定5只果蝇）。</li>
	<li>用牙签末端蘸取少量指甲油，形成一小滴后均匀涂抹一层，以固定果蝇头部于成像室上。 
	注意：涂抹指甲油的具体位置取决于所要成像的脑区。若成像咽下食道区（SEZ，如本例所示）或其他腹侧中线区域，可较多地涂抹于果蝇头部顶部；但若要成像背侧中线区域，则应仅在头部顶部少量涂抹，并在靠近眼睛的侧方补涂，以便为后续解剖留出清晰区域。本方案专为仅进行味觉刺激而不涉及嗅觉的设计优化；若担心指甲油挥发物的影响，可改用石蜡或紫外胶作为固定果蝇头部的替代方法。</li>
</ol>
3. 将喙保持在伸展位置进行封蜡
<ol>
	<li>用一只手拿起蜡笔，在笔尖处收集少量蜡滴。</li>
	<li>另一只手使用半锋利镊子夹住一个上颚须，轻轻拉出并完全伸展地固定住喙管。 
	注意：务必仅夹住上颚须，避免夹到喙管的表皮，否则可能造成损伤。若夹到喙管或刺破其表皮，则不得继续操作。可选用小型吸虫管替代镊子，通过负压吸出喙管的同时施加蜡。</li>
	<li>将蜡笔尖端触碰靠近喙管基部的小室，直至蜡开始流动，然后移动蜡笔与喙管基部接触。在喙管中段位置施加蜡，但应避免蜡或蜡笔触碰到唇瓣上的感觉毛。此侧的蜡将固定喙管位置。若在任何时刻蜡或蜡笔触碰到感觉毛，则不得继续操作。</li>
	<li>采用上述方法在另一侧施加蜡，使蜡在喙管上方形成连续的桥状结构。</li>
	<li>尽可能将喙管完全拉直并保持伸展状态。如有需要，可通过重新加热蜡并轻柔推动喙管，将其调整至理想位置。</li>
	<li>对同一小室中其他果蝇重复上述操作。</li>
	<li>关闭 CO2 气源，或移除冰上麻醉的果蝇。将固定好的果蝇放入湿度培养盒中恢复 60 分钟（可使用洁净的空移液枪头盒，内放湿润无绒擦拭布）。</li>
</ol>
4. 解剖以暴露目标脑区
<ol>
	<li>将果蝇从湿度培养箱中取出。果蝇必须明显存活，能够主动移动其腹部、腿部和触角。在解剖前，预先设置好共聚焦显微镜或双光子显微镜。</li>
	<li>打开蜡修补装置，以便在解剖过程中修复蜡层可能出现的破裂，并准备好室温的AHL溶液。</li>
	<li>使用非常锋利的镊子，先夹除两侧触角，然后夹破体壁，形成一个用于插入尖头镊子一端的小孔。将镊子沿体壁下方滑行，以去除覆盖目标脑区区域的体壁。图1F 中用“X”标记了应使用镊子去除的体壁区域。</li>
	<li>用AHL溶液清洗暴露的脑组织，向头部充分滴加AHL（约100 µL），然后除去多余的液体，仅保留一层薄液膜，以防止脑组织干燥。 
	注意：若蜡层在任何位置破裂需要修复时，应先短暂清除头部周围的全部AHL，再加热蜡层，以重新固定吻部于伸展位置。</li>
	<li>使用尖头镊子去除覆盖在脑组织上的气囊及任何大块碎屑。操作时应保持镊子尖端可见，避免刺入脑组织内部。</li>
	<li>用AHL溶液清洗约3次，以彻底清除所有细小碎屑。</li>
	<li>确保目标脑区清晰可见。若需特异性成像本示例中的咽下区（SEZ），可用非常锋利的镊子在吻部基部以及食管穿过脑部的位置夹断食管，并移除该段组织，以暴露SEZ。 
	注意：食管切除后，果蝇无法摄取溶液，咽部味觉受体神经元（GRN）的激活亦无法发生。</li>
	<li>在解剖显微镜下，将10 mm × 20 mm的盖玻片插入成像室的倾斜槽中。确保盖玻片位于吻部基部，且不破坏蜡封结构。唇瓣末端不得接触盖玻片。</li>
</ol>
5. 成像与味觉刺激
<ol>
	<li>打开共聚焦或双光子显微镜，准备进行图像采集。将装有毛细管的显微操作器设置好，使毛细管能够将味觉刺激物递送至位于显微镜载物台上的果蝇。 
	注意：双光子成像能够捕获位于脑组织较深层神经元的荧光信号。</li>
	<li>将约 2 µL 水（或另一种阴性对照）加入毛细管中 
	显微镜载物台上的刺激器</li>
	<li>找到解剖后的果蝇并聚焦于&#160;使用10倍空气浸没明场观察唇瓣。&#160;将毛细管与唇瓣在此处对齐&#160;视野。额外的摄像机对准果蝇的&#160;唇瓣可用于观察对齐情况&#160;毛细管与果蝇的多角度连接&#160;角度。 
	注意：在对齐过程中，确保溶液能够刺激到唇瓣上的所有感受器；如果刺激器或唇瓣的位置不够垂直而无法实现这一点，应相应调整。可用拉制的毛细管并在磨石上打磨，使其更贴合唇瓣周围。</li>
	<li>将毛细管置于唇瓣正前方，靠近但不接触。</li>
	<li>移动载物台，使目标脑区位于视野中央，然后切换至更高倍率的水浸物镜（本示例使用40倍）。</li>
	<li>在脑组织上方加入约 200 µL 的 AHL，使其与物镜接触以实现浸没。去除所有气泡。</li>
	<li>使用明场对焦，仔细调节z轴平面，找到被移除的角质层边缘，并将目标脑区置于视野中央。</li>
	<li>切换至488 nm激光功率，以寻找目标区域中GCaMP的表达。 
	注意：根据所使用的驱动品系和GCaMP版本，可能需要进行一些初步优化，以增强各个样本的信噪比。对于GCaMP基础荧光较低的神经元，共表达RFP可能有助于信号观察。</li>
	<li>准备一个延时成像序列。成像速度取决于具体的显微镜和GCaMP信号，但最佳条件为每约100毫秒至少采集一张图像。 
	注意：随时间采集单个Z平面的荧光图像可优化采集速度，从而提供详细的钙动力学数据。在每个时间点采集多个Z平面的图像堆栈可能会降低采集速度，但能够记录位于组织不同深度的神经突中的反应。</li>
	<li>在采集至少5秒的基线荧光后，手动移动刺激器，使毛细管覆盖唇瓣特定时间（本示例中为5秒），随后移除刺激，并按需持续采集信号。</li>
	<li>移除AHL，并返回10倍明场，以确认盖玻片、刺激器和唇瓣仍处于相同位置。 
	注意：如果刺激器与唇瓣对位不良或旋转过度，可能导致唇瓣移位，或毛细管触碰成像室，从而可能破坏石蜡并导致 AHL 发生泄漏。</li>
	<li>移除成像室。使用无绒布清除第一种溶液，并用水冲洗移液管。随后，将约 2 µL 的下一种味觉刺激物吸入毛细管中。</li>
	<li>将成像腔室移回载物台，并针对此溶液重复步骤 5.4–5.12。 
	注意：大多数味觉刺激物具有较高的表面张力，容易在果蝇唇瓣上残留化学物质。然而，如果味觉刺激物饱和度过高或具有较高黏性，可在施加下一个刺激前，多次将水移过唇瓣以清洗感觉器官。</li>
	<li>根据需要为该果蝇重复上述步骤以处理任意数量的溶液。</li>
	<li>返回步骤 3，准备下一只果蝇进行成像。</li>
</ol>
6. 图像分析
<ol>
	<li>在图像处理软件中打开待分析的图像序列。如有必要，使用GCaMP信号以外的区域进行背景扣除。</li>
	<li>使用自由手绘或形状工具，在待定量的投射区域周围选择一个紧凑的感兴趣区域（ROI），并确保该选择应用于序列中的所有图像。</li>
	<li>生成该ROI随时间变化的荧光强度数据列表，并将其导出至电子表格以进行后续处理。可使用ImageJ（FIJI）中的plot Z-axis profile功能，或所用图像处理软件中的类似功能。</li>
	<li>在电子表格中，从步骤5.10的基线记录期间选取10个连续时间点作为代表性基线，计算其平均值和标准差。</li>
	<li>为获得以百分比表示的ΔF/F，对每个时间点计算((F - 基线平均F)/基线平均F)×100；为获得以z分数表示的ΔF/F，对每个时间点计算((F - 基线平均F)/基线标准差)。</li>
	<li>为计算刺激期间荧光强度的峰值变化，选取荧光强度最高的3个连续时间点并计算其平均值。</li>
	<li>对不同刺激条件和果蝇的每个图像序列重复上述步骤。 
	注意：根据具体的显微镜设备、信号质量及所选图像分析软件，可对这些步骤进行相应调整。</li>
</ol>

作者无利益冲突，无可披露内容。

该实验方案最具挑战性的方面之一是需要熟练的显微操作技巧，以完成对唇瓣的封蜡及靶向解剖。必须增加一个固定唇瓣的步骤，以确保该感觉器官上的每个感受器均能受到均匀刺激，并能够观察目标脑区。此处使用的定制成像室已针对 D. melanogaster，但该装置的规格和封蜡方法可能需要根据其他昆虫进行调整。本方案可应用于其他 果蝇科 稍作修改即可适用于短角亚目（Brachycera）的其他成员，但对蜜蜂和蚊子等物种，可能需要调整固定和解剖步骤，以适应其下唇须和头部形态的差异。味觉刺激递送所用的显微操作器的对位也可能具有挑战性，需针对特定显微镜载物台进行初步测试以优化设置。若在刺激过程中蜡封破裂，可能导致液体泄漏，使毛细管中的AHL与味觉刺激物发生接触。通过拉制毛细管并使用磨刀石将其末端修整，使其更贴合唇瓣，有助于防止味觉刺激物与AHL接触。凡出现泄漏或脑部过度移动的果蝇均须剔除。在可能的情况下，应对每只动物设置阳性对照，以确保唇瓣及唇瓣神经未因封蜡或解剖操作而受损。 &#34;甜味&#34; 和 &#34;苦味&#34; 此处展示的示例被推荐作为可靠的对照实验。
本文所述的体内钙成像方法已被用于量化D. melanogaster初级味觉神经元、高级神经元以及整个咽下食道区（SEZ）中由味觉诱导的神经反应，以鉴定味觉受体及神经回路8,14,17,18,19,20,27,28,30,31,34,35,36,37,38,39,40,41, 
42,43,44,45,46,47,48。该模式生物中广泛应用此方法的原因在于Gal4和split-Gal4驱动系统易于获得；因此，需要通过基因改造昆虫以在特定目标神经元中表达GCaMP，是该方法的一个限制因素。幸运的是，随着基因编辑技术的进步，这一方法正逐渐适用于非模式生物的昆虫，最近已有报道利用钙成像检测害虫Drosophila suzukii49以及传播疾病的蚊子50中的味觉诱导反应。与所有钙成像实验一样，针对特定目标神经元可能需要进行初步的信噪比优化。可通过使用荧光更强的GCaMP版本或表达两个拷贝的GCaMP来增强信号。在目标神经元中共同表达RFP有助于在基线水平可视化目标神经元，并可作为脑区运动的对照，尤其适用于易发生脉动的区域。
本方案专门设计用于通过去除跗节和触角、用石蜡覆盖下颚须，并限制摄入以避免刺激咽部味觉受体神经元（GRNs），从而分离唇瓣的化学感受功能。然而，可根据需要对该方案进行调整，以包含来自跗节或咽部GRNs的化学感受信号。如果保留跗节完整，可通过在毛细管末端形成较大的味觉刺激液气泡，单独或同时刺激腿部和唇瓣。若保留跗节完整，果蝇可能会踢动并&#160;移动盖玻片；&#160;因此，可考虑在跗节基部附近涂蜡，以&#160;防止&#160;不必要的移动。当前示例包括切断食道的步骤，以避免刺激咽部GRNs，并更清晰地观察腹侧食道神经节（SEZ）中的唇瓣投射。但此前已有研究对该制备方法进行改进，通过保留食道完整并成像侧咽部投射，用于量化咽部GRNs的反应36。该先前应用采用具有吸引力的糖类刺激物，果蝇会自由摄取此类刺激物以激活咽部GRNs；但果蝇通常不会主动摄入厌恶性刺激物来激活苦味咽部GRNs，这是该方法的一个局限性。另一个局限性在于，无法轻易利用该方法研究位于黑腹果蝇（Drosophila）翅膀中的GRNs的反应11。
尽管 体内 此处描述的钙成像已成为研究高阶味觉诱导反应的标准方法8,18,19,20,28目前已有多种其他方法可用于量化果蝇唇瓣主要味觉受体神经元（GRN）对味觉刺激物的响应。 体内 此处描述的钙成像方法可记录脑内轴突末梢中GCaMP的变化，但 离体 该方法还被用于定量分析唇瓣味觉受体神经元中的细胞体 GCaMP 信号33类似地，另一种固定方法已被用于对完整果蝇的唇瓣或跗节味觉受体神经元的细胞体进行成像51电生理学仍然是研究昆虫初级味觉神经元反应的一种流行且有效的方法13,16,32,52,53,54,55,56,57,58,59,60,64,62,63,64,65。该方法无需使用基因编码的钙离子传感器，能够更直接地量化神经元活动。然而，每次只能记录一个感器的反应，而钙成像则可同时记录整个感觉神经元群体的活动。钙成像方法已被用于发现感觉神经元独特的时序动态特性 &#34;开启&#34; 和 &#34;关闭&#34; 特定刺激下基因调控网络中的响应27,28，但最近在味觉感受器基部的电生理记录技术上取得了新进展 D. melanogaster 现在允许 &#34;关闭&#34; 在动作电位水平上对反应进行量化53有趣的是，通过钙成像检测到了饥饿对初级味觉反应神经元（GRN）敏感性的调节作用，但在电生理记录的动作电位水平上未检测到该效应。29然而，电生理尖端记录和钙成像均可捕捉到味觉受体神经元对食物敏感性的变化30,66因此，电生理学仍然是钙成像技术的重要补充手段，可用于鉴定味觉配体与受体，并揭示各类因素如何调控初级味觉感受神经元的敏感性。

果蝇Drosophila melanogaster因其拥有一系列强大的遗传学研究工具而备受推崇。这些工具能够方便地在特定细胞中对目标基因进行精确操控，使其成为研究视觉和化学感受等基本神经回路的理想模式生物1,2,3。味觉作为一种接触性化学感受方式，是调控摄食、交配、繁殖等行为的关键神经通路，最终影响动物的生存与适应性4,5,6,7,8,9。要理解这一重要化学感受信息是如何被编码和传递的，就需要描述由味觉刺激所激活的神经回路中神经元的活动情况。
D. melanogaster 的外部味觉感受神经元（GRNs）位于前足、喙和翅膀上10,11。位于喙末端的唇瓣包含毛发状结构，称为感觉毛，可根据其大小形态分为长型（L型）、中间型（I型）和短型（S型）10。大多数GRNs集中于这一感觉器官，每根感觉毛含有2-4种不同类型的GRNs，从而使每种味觉模态分布在唇瓣的不同区域12,13,14,15。虽然可通过电生理尖端记录来量化单根感觉毛中GRNs产生的动作电位16，但在体钙成像技术可用于在整个唇瓣范围内特异性地分离特定类型GRNs的活动14,17。相同的钙成像技术也可用于研究下游味觉回路中的神经反应18,19,20。钙成像需要使用双元表达系统，例如Gal4-UAS21,22,23，通过将含有细胞特异性转录激活因子的驱动品系与效应品系杂交，实现在目标神经元中表达GCaMP。当细胞内钙离子水平升高时，这些基因编码的钙指示剂荧光强度随之增强，因此荧光水平的变化与神经元活动的变化相关联24,25。
此处介绍一种利用钙成像技术观察神经元对味觉刺激反应的方法 体内 进行了描述。本方法的总体目标是仅刺激唇瓣味觉受体神经元（GRNs），以量化清醒果蝇大脑中由味觉诱导的神经反应。文中提供了利用该方法记录唇瓣初级GRNs反应的示例。 D. melanogaster，并讨论了采用该方法的优势与挑战。该制备方法的设计旨在使实验者能够在共聚焦显微镜下，将味觉刺激溶液施加于固定果蝇的唇瓣，同时记录当整个感觉器官浸入溶液中时的神经反应，这种情况在自然环境中普遍存在。 体内 此处描述的钙成像方法可用于揭示新的呈味物质-受体相互作用8,14,26,27，基因调控网络响应的时间细节27,28，GRN调控的分子机制29,30以及下游神经环路中的味觉信息处理8,18,19,20,28,31.

<table><tbody><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>对于AHL</td></tr><tr><td>咖啡因</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0750</td><td>对于一个 &quot;苦味&quot; 味觉刺激</td></tr><tr><td>快干型透明指甲油</td><td>许多供应商</td><td></td><td>示例：Sally Hansen Xtreme Wear（透明）</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 果蝇培养板站</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122BC</td><td>包括导管、用于初步麻醉果蝇的麻醉枪以及用于持续麻醉的麻醉垫</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 供气（气瓶）</td><td>Airgas</td><td>USP50</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>共聚焦或双光子显微镜</td><td>许多供应商</td><td></td><td>直立显微镜，高信噪比，快速成像能力，10倍干镜物镜，25-40倍水浸物镜，配套硬件与软件</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-15</td><td>22 × 22 mm，No 1.5：针对此特定成像腔室，划痕并切割成两半，得到 11 × 22 mm 的盖玻片</td></tr><tr><td>D. melanogaster：Gr64f-Gal4</td><td>布卢明顿果蝇资源中心</td><td>57669</td><td>用于在唇瓣的“甜味”味觉感受神经元中驱动 GCaMP 表达</td></tr><tr><td>D. melanogaster：Gr66a-Gal4</td><td>布卢明顿果蝇品系中心</td><td>57670</td><td>用于在唇瓣的“苦味”味觉受体神经元中驱动 GCaMP 表达</td></tr><tr><td>黑腹果蝇：UAS-GCaMP6f</td><td>布卢明顿果蝇品系中心</td><td>42747</td><td>与Gal4驱动品系杂交后获得GCaMP表达的方法</td></tr><tr><td>牙科蜡化仪</td><td>Pearson Dental</td><td>49-00-54</td><td>数字蜡雕笔，配有可调节和修整的精细笔尖，能够沿果蝇喙部精确施加蜡质</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>许多供应商</td><td></td><td>0.63–6.3倍，可实现最佳观察效果，同时具备足够的工作距离，便于在显微镜下进行解剖操作</td></tr><tr><td>解剖剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td>这把剪刀或任何类似的解剖剪均可使用</td></tr><tr><td>空移液器吸头盒</td><td>免费——多家供应商</td><td></td><td>用于湿度培养箱：需具备足够空间，以容纳成像腔室并确保盖子关闭时不会触碰到腔室</td></tr><tr><td>抽滤瓶</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CLS431097</td><td>用于过滤AHL储备液</td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>世界精密仪器公司</td><td>TW100-4</td><td>该尺寸可很好地覆盖黑腹果蝇（D. melanogaster）喙端，无需进一步修整，但也可将其他毛细管拉制并打磨至合适尺寸</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BP310</td><td>对于AHL</td></tr><tr><td>ImageJ（FIJI）</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>https://imagej.nih.gov/ij</td><td>图像分析软件</td></tr><tr><td>成像室</td><td>IMF 实验室</td><td>自定义项目</td><td>本示例中的定制腔室可通过 https://www.uvm.edu/research/imf/forms/contact-us 订购。基座：6061 铝合金，固定夹具：黑色聚甲醛（Delrin），插入件：防潮聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）。制造使用手动和数控铣床。</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>对于AHL</td></tr><tr><td>Kim擦拭巾</td><td>Millipore-Sigma</td><td>Z188956</td><td>用于湿度培养箱、擦拭镊子、从毛细管中移除溶液等操作。</td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>对于AHL</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Tritech Research</td><td>U-31CF, USM-6, MINJ-4</td><td>此示例使用磁铁将显微操作器固定在载物台上，也可采用其他配置方式</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>对于AHL</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567545</td><td>对于AHL</td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td>对于AHL</td></tr><tr><td>p10 移液器及吸头</td><td>许多供应商</td><td></td><td>用于将味觉刺激物填充至毛细管中</td></tr><tr><td>p200 移液器及吸头</td><td>许多供应商</td><td></td><td>对于AHL</td></tr><tr><td>石蜡</td><td>许多供应商</td><td></td><td>&amp;nbsp;在工艺品商店常发现的白色/透明蜡块</td></tr><tr><td>核糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W379301</td><td>对于AHL</td></tr><tr><td>半钝头镊子&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>钝化至尖端尺寸约为 C</td></tr><tr><td>尖头镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>尖端尺寸修整至A</td></tr><tr><td>磨刀石</td><td>Fine Science Tools</td><td>29000-00</td><td>用于修整牙科蜡雕笔尖和镊子</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>对于一个 &quot;甜味刺激</td></tr><tr><td>牙签</td><td>许多供应商</td><td></td><td>指甲油涂抹的小技巧</td></tr></tbody></table>

体内 钙成像技术用于研究成年 drosophila 味觉诱导的神经反应

In Vivo Calcium Imaging of Taste-Induced Neural Responses in Adult Drosophila

近二十年来，体内钙成像一直是利用果蝇模式生物黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）测量细胞对味觉刺激反应的有效方法。该方法的一个关键优势在于，它能够在无需麻醉的清醒动物中记录味觉诱导的神经反应。该技术利用二元表达系统（例如 Gal4-UAS）在特定目标神经元中表达钙指示剂 GCaMP。本方案描述了一种实验流程：将表达 GCaMP 的果蝇固定，使其喙器（labellum）稳定定位，随后在共聚焦显微镜下以毫秒级分辨率记录脑部荧光信号，同时将溶液施加于喙器，以刺激其上全部的喙器味觉感受器。所提供的示例主要聚焦于黑腹果蝇（D. melanogaster）初级味觉感受神经元中的钙反应。然而，该方法也可调整用于记录果蝇科（Drosophilids）或其他昆虫物种脑内其他目标神经元的活动。这种成像方法使研究人员能够同时记录来自喙器上多组味觉神经元的集体钙反应，从而与仅能定量单个神经元动作电位的电生理尖端记录技术形成互补。本文所述的体内钙成像技术在揭示化学感受的分子与细胞机制、鉴定初级味觉神经元中独特的时间反应模式、研究味觉调控机制以及探索下游神经回路中的味觉信息处理等方面发挥了重要作用。

图1 展示了本实验所用成像室（图1A、B）和封蜡针头（图1D）的详细结构。图1 还说明了将果蝇固定（图1C）、用蜡将喙器固定到位（图1E）、暴露目标脑区进行解剖（图1F），以及在记录脑内荧光信号的同时用味觉刺激物刺激唇瓣（图1G）等主要操作步骤。为了定量分析味觉诱导的初级味觉感受神经元（GRNs）反应，本研究使用 Gr64f-Gal4 驱动 UAS-GCaMP6f 表达的 Drosophila melanogaster 果蝇，使钙指示剂在唇瓣所有感知糖类的“甜味”GRNs中实现遗传性表达14,27,30,32,33,34,35。在这些实验中，使用的共聚焦显微镜包含以下组件：直立式荧光显微镜、40 fps sCMOS相机、10x 和 40x 物镜、转盘共聚焦系统、488 nm 二向色镜发射器以及 488 nm 固态激光器。将 40x 物镜浸入 AHL 中，并对准 SEZ 脑区，以定位这些唇瓣 GRNs 轴突末梢的基础 GCaMP 信号（图2A）。在基线期（无刺激）、5 秒味觉刺激期（刺激器移动经过唇瓣）以及刺激后直至荧光恢复至基线水平期间，每 100 ms 采集一次荧光图像（图2A、B）。以水作为阴性对照，1 M 蔗糖作为阳性对照。计算13只果蝇的相对荧光变化 ΔF/F（z-score），并随时间作图，以显示味觉刺激期间钙信号反应的动力学特征（图2B）。将峰值 ΔF/F（z-score）进行绘图并用于统计比较，结果表明这些细胞对蔗糖的反应显著高于对水的反应（图2C）。该技术揭示，“甜味”GRNs 在蔗糖刺激开始时出现强烈峰值，并在刺激期间维持较高水平，伴随一定程度的衰减。
作为对比，本方案在使用另一种驱动子 Gr66a-Gal4 的果蝇中重复进行，该驱动子在唇瓣上所有“苦味”味觉感受神经元（GRNs）中特异性表达 UAS-GCaMP6f14,17,28,34,36。类似地，这些GRN的轴突末梢位于咽下食道区（SEZ）：注意其投射模式与感知糖类的GRNs明显不同（图2D）。荧光信号的采集和分析方法与之前相同，唯一区别是使用100 mM咖啡因作为阳性对照。来自11只果蝇的平均曲线显示，在咖啡因刺激开始时出现明显的峰值，而在刺激移除后也存在一个小的“关闭”反应，该现象已知会在某些苦味刺激下发生28（图2E）。该方法能够对“开启”和“关闭”反应进行定量，以表征味觉诱导反应的时间动态特征27,28。在此，仅对“开启”峰值进行了量化，以表明对咖啡因的反应显著强于水（图2F）。图2中的实验具有高度可重复性，可用于验证本方案是否正常运行。
<img alt="果蝇成像室示意图；解剖、封蜡及共聚焦成像流程的装置细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67917/67917fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1用于成像味觉诱导反应的实验方案示意图 果蝇 脑 (A) 用于同时固定最多五只果蝇的定制成像室的顶视图。 (B) 果蝇固定用成像室的结构细节，其尺寸设计可舒适地适配宫颈 D. melanogaster. (C) 示意图显示修剪跗节的位置（左上）以及如何使用镊子将果蝇固定在成像室的宫颈槽中（左下）。成像室内果蝇正确放置位置的照片（右）。D）脱毛笔尖的照片（左），笔尖放大照片以显示使用磨石修整标准笔尖时应达到的大致形状和尺寸（右）。E) 使用镊子将喙器固定到位的示意图（左），蜡封吻部后正确安装的果蝇照片（右）。F) 图示说明对目标脑区进行解剖及 AHL 应用（左）；针对 SEZ 或 SMP 脑区时，需移除体壁的果蝇照片，图中以虚线圆圈标示（左）；X 表示解剖时需捏住的体壁区域（右）。G) 图形和照片展示了固定/解剖果蝇的位置、浸入AHL中的水浸物镜、位于喙上方带有味觉刺激物的刺激器，以及分隔这些溶液的盖玻片。左侧为侧面整体视图，右侧为10倍物镜下的俯视图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67917/67917fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经元活动中的荧光变化；显微图像与图表显示蔗糖和咖啡因刺激效应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67917/67917fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：唇瓣味觉感受神经元对味觉刺激的钙反应示例。 （A）图像序列中的静态图像，显示携带 Gr64f&gt;GCaMP6f 的果蝇在基础状态及对 1 M 蔗糖刺激峰值反应时 GCaMP 荧光强度，比例尺 = 20 µm。虚线标示用于分析的感兴趣区域（ROI）。（B）以 ΔF/F（z 值）计算并合并 n = 14 只果蝇对水（阴性对照）和 1 M 蔗糖（阳性对照）的钙反应曲线，以展示反应动力学；曲线下方的黑线表示刺激施加于唇瓣的时间段。（C）每只果蝇的峰值 ΔF/F（z 值）绘图用于统计比较。配对 t 检验，****p &lt; 0.0001。（D）视频中的静态图像，显示携带 Gr66a&gt;GCaMP6f 的果蝇在基础状态及对 100 mM 咖啡因刺激峰值反应时 GCaMP 荧光强度，比例尺 = 20 µm。虚线标示用于分析的感兴趣区域（ROI）。（E）以 ΔF/F（z 值）计算并合并 n = 11 只果蝇对水（阴性对照）和 100 mM 咖啡因（阳性对照）的钙反应曲线，以展示反应动力学：注意微弱的“关闭”反应，曲线下方的黑线表示刺激施加于唇瓣的时间段。（F）每只果蝇的峰值 ΔF/F（z 值）绘图用于统计比较。配对 t 检验，****p &lt; 0.0001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67917/67917fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

钙成像方法能够记录在向喙器施加溶液时清醒果蝇大脑中由味觉诱导的反应。以黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的初级味觉反应为例进行说明，但本方案可经调整用于研究下游神经元或其他物种。

体内 钙成像技术用于研究成年 Drosophila 味觉诱导的神经反应

近二十年来，活体钙成像一直是利用果蝇模型测量细胞对味觉刺激反应的有效方法……

我们的实验室以果蝇作为模式生物，研究味觉信息如何通过神经环路从化学物质的感知传递到对行为的影响。我们正在利用该成像方案鉴定响应氨基酸的味觉细胞，并确定不同的内部状态是否会调节味觉细胞对这些必需营养物质的反应。这种钙成像方法的一个优势在于，它能够在保持内部状态完整的清醒动物中，记录特定细胞的味觉诱导神经反应。现在，我们可以利用这种钙成像方法，在新的黑腹果蝇全脑连接组中识别出潜在的味觉神经环路，并在活体中验证其功能性神经动态。首先，将麻醉后的果蝇置于解剖显微镜下。使用解剖剪，在股-胫关节处切除中足和后足，并在转节处切除四条腿。使用钝头镊子夹住果蝇的翅膀，将其定位，使头部位于成像室的目标颈槽上方，同时身体保持在下方。用剪刀的钝端和钝头镊子轻轻同时推动头部和胸部，使其进入槽内。一旦果蝇牢固地进入槽中，将其推至后方并轻柔调整位置，使其面向成像室的前方。用牙签末端蘸取少量指甲油，在成像室中轻轻涂抹一层，以固定果蝇的头部。用一只手拿起蜡笔，在笔尖蘸取少量蜡滴。另一只手使用半尖头镊子夹住一个上颚须，轻轻拉出并保持喙完全伸展状态。将蜡笔尖端接触喙基部附近的腔室，直至蜡开始流动。移动蜡笔使其与喙基部接触，并沿喙杆向下蜡至中点位置，避免接触唇瓣上的感觉毛。然后尽可能完全伸直并伸展喙。现在将固定好的果蝇放入湿度培养箱中恢复60分钟。从湿度培养箱中取出果蝇。使用非常锋利的镊子，剪下两只触角，夹破体壁以制造一个小孔，并将镊子的一侧插入其中。将镊子伸入表皮下方，以去除覆盖目标脑区区域的表皮。为清洗暴露的脑组织，向头部加入约 100 微升人工血淋巴液（AHL）。清洗后，吸除 AHL，仅保留一层薄液以防止脑组织干燥。使用锋利的镊子，去除覆盖在脑部的气囊和任何较大的碎屑。为了特异性地观察食管下区（SEZ），用非常锋利的镊子在喙基部附近以及食管穿过脑部的位置切断食管。移除该部分组织以暴露 SEZ。在解剖显微镜下，将10 mm × 20 mm的盖玻片放入成角的成像室插槽中。向毛细管中加入约2 µL水或其他阴性对照样品。找到已解剖的果蝇，使用10倍空气浸没明场物镜对准唇瓣并调焦。在10倍镜下将毛细管与唇瓣对齐。保持毛细管位于唇瓣正前方，确保其靠近但不接触。移动载物台，使目标脑区居中。切换至更高倍率的水浸物镜，例如 40 倍物镜。在脑组织上方加入约 200 微升 AHL，以确保与浸液物镜充分接触。切换至 488 纳米激光功率，以定位目标区域中 GCaMP 的表达。在采集至少五秒的基线荧光后，手动移动刺激器，使毛细管覆盖唇瓣持续五秒。移除刺激物，并根据需要继续采集图像。随后，移除 AHL，并返回 10x 明场模式，以确认盖玻片、刺激器和唇瓣仍处于正确位置。然后移除成像室，使用无绒布擦拭毛细管以去除第一种溶液。用水冲洗移液管，并向毛细管中加入约两微升的下一种呈味物质。Gr64f GCaMP果蝇在蔗糖刺激下的相对荧光变化显著高于水刺激，表明甜味味觉受体神经元具有强烈且持续的反应。蔗糖刺激的相对峰值荧光显著高于水刺激。Gr66a GCaMP果蝇在咖啡因刺激下的荧光变化显著高于水刺激，显示出对咖啡因施加和去除的响应。Gr66a果蝇轴突末梢的投射模式与Gr64f果蝇明显不同，表明苦味和甜味感知的味觉受体神经元在解剖结构上存在分离。

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