Intrathorakale Injektion: Abgabe von Verbindungen an das Herz eines erwachsenen Zebrafisches

1. Vorbereitung des Fisches für die intrathorakale Injektion

1. Fangen Sie einen erwachsenen Zebrafisch (Danio rerio) mit einem Netz und geben Sie ihn in die Narkoselösung.
2. Nach 1-2 Minuten, wenn der Fisch aufhört zu schwimmen und die Bewegung des Operculums reduziert ist, berühren Sie den Fisch mit einem Plastiklöffel, um sicherzustellen, dass er nicht auf jeglichen Kontakt reagiert.
3. Schieben Sie den Fisch schnell und vorsichtig mit dem Löffel in die Rille des nassen Schwamms, mit der Bauchseite nach oben. Der Kopf des Fisches sollte von der dominanten Hand des Bedieners weg zeigen.

2. Mikroinjektion in das Perikard

1. Beobachten Sie unter dem Stereomikroskop genau die Bewegung des schlagenden Herzens unter der Haut des Fisches. Bestimmen Sie visuell den Injektionspunkt oberhalb des schlagenden Herzens und in der Mitte des Dreiecks, das durch die ventralen Knorpelplatten definiert ist (Abbildung 1D). Führen Sie die Spitze der Kapillare in einem Winkel von 30-45° Grad relativ zur Körperachse ein (Abbildung 1E). Dringen Sie mit der Spitze der Mikrokapillare sanft in die Haut in das Perikard ein (Abbildung 1C). Ein optimaler Eintrittspunkt liegt näher am Bauch als am Kopf.
   Anmerkung: Führen Sie die Kapillare nicht zu tief in den Körper und das Herz ein, da dies zu Verletzungen des Organs führen kann. Bei einer Herzpunktion füllt sich die Nadel in der Regel mit Blut. In diesem Fall entfernen Sie die Kapillare und schließen Sie den Fisch vom Versuch aus.
2. Sobald sich die Nadel im Perikard befindet, schließen Sie die Injektion ab, indem Sie das Pedal des Mikroinjektors drücken.
   Anmerkung: Achten Sie darauf, keine Luft in die Brusthöhle zu injizieren.
3. Ziehen Sie nach der Injektion die Kapillare vorsichtig aus dem Thorax zurück und setzen Sie den Fisch sofort zur Erholung in ein Aquarium mit Systemwasser um.
4. Überwachen Sie den Fisch, bis er sich vollständig von der Narkose erholt hat.
5. Entnehmen Sie das Herz zum gewünschten Zeitpunkt und bereiten Sie es für die weitere Analyse vor.
   Anmerkung: Falls der Fisch die Bewegung des Operculums innerhalb von 30 s nicht wieder aufnimmt, reanimieren Sie den Fisch, indem Sie mit einer Plastikpipette Wasser in die Kiemen drücken.

Abbildung 1: Intrathorakale (IT) Injektion bei adulten Zebrafischen. (A) Foto einer gezogenen Mikroinjektionskapillare mit Filament (6", 1,0 mm Durchmesser) und Werte des verwendeten Nadelzieherprogramms. (B) Foto einer gezogenen Mikroinjektionskapillare mit Filament (6", 1,0 mm Durchmesser), gefüllt mit 2,5 μl Lösung mit 10 % Phenolrot. Die gezogene Spitze der Nadel ist maximal 7 mm lang. (C) Schematische Darstellung des IT-Injektionsverfahrens. (D) Fotos des IT-Injektionsverfahrens. Diese Abbildung wurde von Bise et al. modifiziert. Die Zahlen in den Feldern C und D entsprechen den gleichen Schritten des Verfahrens: (1) Der Fisch wird mit der Bauchseite nach oben auf einen befeuchteten Schwamm gelegt. Die Einstichstelle (roter Punkt im Dreieck) befindet sich in der Mitte des Brustkorbs in der Nähe der Kiemen. (2) Eindringen der Nadel in das Perikard. Roter Punkt zeigt die Einstichstelle an. (3) Die Injektion wird überwacht, indem die Ausbreitung der roten Lösung in der Perikardhöhle beobachtet wird. (E) Schema der IT-Injektion. Der Winkel zwischen der Injektionskapillare und der Körperachse sollte zwischen 30° und 45° liegen, um eine Herzpunktion zu vermeiden. (F) Fotografien des Thorax von Fischen 1 Stunde nach der IT-Injektion der angegebenen Volumina. Weiße Pfeile zeigen auf das rötliche Gewebe, was auf innere Blutungen hinweisen könnte