Ultraschallgesteuerte Implantation: Eine Technik zur Implantation von duktalen Adenokarzinomzellen der Bauchspeicheldrüse in eine erwachsene Maus

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegekomitee und dem Jove Veterinary Review Board überprüft.

>1. Präoperative Vorbereitung von Mäusen

HINWEIS: Es wird empfohlen, diesen Schritt 24 Stunden vor dem Eingriff durchzuführen.

1. Käfige mit Versuchsmäusen auf einen auf 37 °C eingestellten Wärmer stellen.
2. Besorgen Sie sich neue, saubere Käfige und stellen Sie sie auf eine zweite Warmhalteplattform, die auf 37 °C eingestellt ist.
3. Reinigen Sie die biologische Sicherheitswerkbank, die Induktionskammer und den Ultraschalltisch (US) gründlich mit Sterilisationsmittel (siehe Materialtabelle).
4. Drehen Sie die Wärmefunktion der US-Stufe auf 37°C.
5. Schalten Sie das Anästhesiegerät ein: Stellen Sie die Drehregler am Schlauchsplitter so ein, dass der Luftstrom nur in die Induktionskammer beschränkt ist. Schalten Sie den Sauerstofftank ein und stellen Sie die Durchflussmenge auf 1 l/min ein. Schalten Sie den Isofluran-Verdampfer auf 2-3% ein.
6. Setzen Sie eine einzelne Maus in die Induktionskammer ein. Überwachen Sie die Maus, bis sie nicht mehr mobil ist und sich die Atmung verlangsamt hat.
7. Stellen Sie die Drehregler am Splitter so ein, dass sowohl die Induktionskammer als auch der Nasenkonus mit Luft strömen können. Schnell die Maus aus der Induktionskammer nehmen und mit der Schnauze im Nasenkonus ventral liegend auf die warme US-Bühne legen.
8. Testen Sie den Grad der Induktion, indem Sie eine reflexartige Reaktion auf das Einklemmen der Zehen beobachten. Ist keine vorhanden, ist die Maus bereit für die Haarentfernung.
9. Tragen Sie eine kleine Menge Augengleitmittel (siehe Materialtabelle) auf beide Augen auf, um eine Austrocknung des Gewebes zu verhindern. Drehen Sie die Maus so, dass sie in Rückenlage auf der Bühne liegt. Kleben Sie die oberen und unteren Extremitäten vorsichtig mit Papierklebeband auf den Tisch, um die Freilegung des Bauches zu maximieren und die Maus auf dem Tisch zu befestigen.
10. Tragen Sie mit einem sterilen Applikator mit Wattespitze eine großzügige Schicht Enthaarungscreme auf den oberen linken Quadranten des Bauches auf. Das Enthaarungsmittel sollte im allgemeinen Bereich der Milz angewendet werden und sich zur Mittellinie hin erstrecken. Etwa eine Minute ziehen lassen.
11. Testen Sie den Grad der Haarentfernung, indem Sie die Enthaarungscreme vorsichtig mit dem gegenüberliegenden Ende des Wattestiftapplikators abwischen, sobald sie sich leicht entfernen lässt, wischen Sie den Bauch mit einem trockenen Mullkissen sauber. Befeuchten Sie dann eine saubere Schicht Gaze mit etwas warmer Kochsalzlösung und wischen Sie die Stelle noch einmal ab, um das Enthaarungsmittel vollständig zu entfernen. Überschreiten Sie nicht 2 volle Minuten direkten Kontakts mit der Maushaut, um das Risiko von Verätzungen zu verringern.
12. Sobald die Haare ausreichend vom Bauch entfernt wurden, setzen Sie die Maus wieder in einen neuen, sauberen Käfig auf Wärmer.
13. Während sich auf der US-Bühne das erste Tier der Haarentfernung unterzieht, kann das nächste Tier in die Induktionskammer kommen.
14. Bevor Sie den nächsten Mäusekäfig betäuben, schalten Sie das Isofluran aus und spülen Sie die Induktionskammer mit Sauerstoff. Reinigen Sie die Induktionskammer und den US-Tisch/Nasenkonus mit Sterilisationsmittel. Wiederholen Sie die Schritte 1.5-1.14, bis alle Käfige und Mäuse entfernt wurden.
    Anmerkung: Es kann in Betracht gezogen werden, dass nüchterne Tiere durch vorübergehenden Entzug der Nahrung für einen Zeitraum vor der Implantation die visuelle Obstruktion der Bauchorgane aufgrund unverdauter Nahrung in Magen und Darm (12-24 Stunden) minimieren. Eine Wasserbeschränkung wird nicht empfohlen. Wenn Tiere nüchtern sind, wird empfohlen, sie nach der Tumorinjektion mit einer Injektion von 1 ml warmer (37 °C) steriler Kochsalzlösung zu behandeln, um eine Dehydrierung zu verhindern.

>2. Ultraschallgesteuerte Implantation von PDA-Zellen

HINWEIS: Alle Ultraschallverfahren werden mit einem Ultraschallbildgebungsgerät und einer Software durchgeführt (siehe Materialtabelle). Der Wandler hat eine Mittenfrequenz von 40 MHz und eine Bandbreite von 22-55 MHz.

1. Stellen Sie die Ultraschallplattform so ein, dass die Oberfläche der Plattform parallel zum Boden ist und der Untersucher zur linken Seite des Tieres und der Kopf des Tieres nach rechts zeigt. Passen Sie die Position des Schallkopfs so an, dass ein transversales Bauchbild erhalten wird (Abbildung 1A).
2. Betäuben Sie die zu injizierende Maus wie in den Schritten 1.1-1.8 beschrieben. Stabilisieren Sie die Maus auf der US-Plattform, wie in Schritt 1.9 beschrieben.
3. Tragen Sie eine großzügige Menge warmes (37 °C) Ultraschallgel auf den haarlosen Teil des Bauches auf.
4. Senken Sie den Schallkopf vorsichtig ab, um den Bauch der Maus zu berühren. Stellen Sie den Schallkopf nach Bedarf ein, bis die Bauchspeicheldrüse deutlich sichtbar ist. Lokalisieren Sie die linke Niere und Milz, um eine genaue Ausrichtung der Bauchhöhle zu gewährleisten.
   Anmerkung: Da die Position des Schallkopfs geändert wurde, um den Zugang zur linken Seite des Bauches zu ermöglichen, sind die X- und Y-Achse an den Bedienelementen des Tisches jetzt umgekehrt.
5. Laden Sie eine 29 G x 1/2" Insulinspritze (siehe Materialtabelle) mit 25 μl Tumorzellsuspension. Wischen Sie die Nadelspitze vor der Injektion mit einem sterilen Alkoholvorbereitungspad ab, um die Aussaat von Tumorzellen in der Bauchdecke zu minimieren.
6. Fassen Sie mit einer stumpfen Pinzette die Haut und die Bauchfellwand, um die Spannung an der gewünschten Injektionsstelle zu erhöhen. Halten Sie die Spritze in einem Winkel von etwa 25°-45° zur Oberfläche der Ultraschallplattform und schieben Sie die Nadel langsam durch die Haut und die Peritonealwand. Vergewissern Sie sich, dass die Nadel die Peritonealwand durchstochen hat, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Ein leises Knacken sollte zu spüren sein, wenn die Nadel die Peritonealwand durchbohrt.
7. Führen Sie die Nadel unter Ultraschallvisualisierung direkt in die Bauchspeicheldrüse (Abbildung 1B-C). Vergewissern Sie sich, dass sich die Nadel im Bauchspeicheldrüsengewebe befindet, indem Sie den Spritzenzylinder vorsichtig auf und ab bewegen. Wenn die Platzierung korrekt ist, verbleibt die Nadelspitze im Bauchspeicheldrüsengewebe, während sich der Spritzenzylinder bewegt.
8. Injizieren Sie die Tumorzellen langsam und bestätigen Sie, dass die Zellen an der gewünschten Stelle implantiert werden, indem Sie einen Flüssigkeitsbolus in der Bauchspeicheldrüse bilden (sichtbar auf dem Ultraschallschirm, Abbildung 1D).
   Anmerkung: Beim Drücken des Kolbens sollte ein gewisser Widerstand zu spüren sein. Achte darauf, die Bauchspeicheldrüse nicht mehrmals zu durchstechen, da dies die Wahrscheinlichkeit eines Lecks in die Bauchhöhle erhöht.
9. Sobald das gesamte Volumen der Suspension injiziert wurde und ein flüssiger Bolus in der Bauchspeicheldrüse zu sehen ist, halten Sie die Nadel einige Sekunden lang sehr ruhig. Ziehen Sie die Nadel langsam aus dem Bauch der Maus zurück und achten Sie darauf, die injizierten Zellen nicht zu stören.
10. Legen Sie die Maus in einen sauberen, warmen Käfig und stellen Sie sicher, dass sich die Maus vollständig von der Narkose erholt. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Tiere.
11. Reinigen Sie vor der Betäubung der nächsten Maus die Induktionskammer und den US-Tisch/Nasenkonus mit Sterilisationsmittel.
12. Wiederholen Sie die Schritte 2.2 bis 2.11, bis alle Mäuse injiziert wurden.

Abbildung 1: Ultraschallgesteuerte Implantation von PDA-Zellen in die murine Bauchspeicheldrüse. (A) Ausrichtung der Maus, des Ultraschalltisches und der Ultraschallsonde, die verwendet werden, um ein hochauflösendes Bild der Bauchorgane zu erhalten. Beachten Sie, dass der Tisch und die Plattform um 90° von der Standardausrichtung gedreht wurden, um einen einfachen Zugang zum oberen linken Quadranten des Mausabdomens zu ermöglichen. (B) Ultraschallbild, das die Identifizierung von Niere, Milz und Bauchspeicheldrüse darstellt. Dabei wird die Injektionsnadel gegen den Bauch der Maus positioniert. (C) Ultraschallbild, das die Nadel in der Bauchspeicheldrüse der Maus zeigt. (D) Ultraschallbild, das die Blase an der Injektionsstelle (blau umrandet) nach kontrollierter Injektion von Tumorzellen in die Bauchspeicheldrüse zeigt. (E) Laparotomie, bei der der Flüssigkeitsbolus mit PDA-Zellen in der Bauchspeicheldrüse nach ultraschallgeführter Injektion sichtbar wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.