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Abstract

Quelle: Merenda, A. et al., Ein Protokoll für den multiplen Gen-Knockout in Dünndarm-Organoiden der Maus unter Verwendung eines CRISPR-Verkettungsgeräts. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video beschreibt eine Gen-Knockout-Technik, bei der ein CRISPR-Verkettungsgerät verwendet wird, um mehrere Gene in kultivierten Darmorganoidzellen von Mäusen gleichzeitig auszuschalten. Diese Methode wird verwendet, um ein erkranktes Gen auszuschalten und die Funktion eines Gens und seiner Parameter aufzuklären.

Protocol

<p class="jove_title">1. gRNA-Design für den CRISPR-Verkettungsvektor

HINWEIS: Das Ziel dieses Abschnitts ist es, zu erklären, wie man sich für die beste Targeting-Strategie entscheidet und wie man gRNAs mit spezifischen Überhängen für den CRISPR-Verkettungsvektor entwirft.

1. Entwerfen Sie gRNAs für die interessierenden Gene mit einem CRISPR-gRNA-Designwerkzeug Ihrer Wahl. Ein Beispiel finden Sie in der Materialtabelle.
   Anmerkung: Wenn es auf ein Paar paraloger Gene abzielt, ist es zwar möglich, eine gRNA pro Gen zu designen, aber es ist ratsam, zwei gRNAs pro Gen zu entwerfen, um die Chancen auf einen doppelten Knockout zu erhöhen (Abbildung 1).
2. Stellen Sie sicher, dass die gRNAs nicht die BbsI-Erkennungsstelle enthalten, indem Sie ein Restriktions-Mapping-Tool verwenden (ein Beispiel finden Sie in der Materialtabelle).
3. Fügen Sie jedem Oligo spezifische CRISPR-Verkettungsvektor-Überhänge hinzu, wie in Tabelle 1 gezeigt.

<p class="jove_title">2. Klonierung von gRNAs in den CRISPR-Verkettungsvektor

1. Phosphorylierung und Annealing von Oligos
   Anmerkung: Dieser Schritt zeigt, wie obere und untere Stränge für jedes gRNA-Oligo geglüht und ihre Enden in einer einzigen Reaktion phosphoryliert werden.
   1. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch für die Phosphorylierung von Oligos und das Glühen von oberen und unteren Strängen auf Eis gemäß den nachstehenden Anweisungen vor.
      Anmerkung: Alle Oligos können in einer Reaktion zusammengefasst werden; Im Falle eines 4-gRNA-Verkettungsvektors werden beispielsweise 8 Oligos zusammengelegt.
   2. Verwenden Sie für 3 Verschreibungspunkte 3,0 μl gRNA Oberstrang (1,0 μl aus jeder gRNA; 10 μM, 1 μL/gRNA), 3,0 μl gRNA Unterstrang (1,0 μl aus jeder gRNA; 10 μM, 1 μL/gRNA), 2,0 μl T4 DNA-Ligase-Puffer (10x), 1,0 μl T4 PNK und fügen Sie H₂O bis zu einem Gesamtvolumen von 20,0 μl hinzu.
   3. Durch Pipettieren gut mischen und in einem Thermocycler mit den folgenden Einstellungen laufen lassen: 37 °C für 30 min, 95 °C für 5 min, herunterfahren auf 25 °C bei 0,3 °C/min, bei 4 °C halten.
2. BbsIch schiebe Reaktion
   Anmerkung: In diesem Abschnitt werden die vorgeglühten gRNA-Oligos in einem Schritt durch abwechselnde Zyklen von Verdau und Ligation in die entsprechende Position des Verkettungsvektors eingebaut.
   1. Das Reaktionsgemisch wird 1:100 in DNase/RNase-freiem Wasser verdünnt, um 3 und 4 gRNA-Verkettungsvektoren zu erzeugen.
      Anmerkung: Bei der Klonierung von 2 gRNA-Koncatemeren ist dieser Schritt nicht erforderlich.
   2. Montieren Sie die BbsI Mischreaktion auf Eis, wie unten beschrieben. Fügen Sie ein Negativsteuerelement hinzu, das nur den Vektor enthält.
   3. Verwenden Sie 100 ng CRISPR-Verkettungsvektor, 10,0 μl Oligogemisch, 1,0 μl BSA-haltigen Restriktionsenzympuffer (10x), 1,0 μl DTT (10 mM), 1,0 μl ATP (10 mM), 1,0 μl BbsI, 1,0 μl T7-Ligase und H₂O bis zu einem Gesamtvolumen von 20,0 μl.
   4. Durch Pipettieren gut mischen und in einem Thermocycler mit den folgenden Einstellungen durchführen: 50 Zyklen für die Klonierung von 3 und 4 gRNA-Konkateneren und 25 Zyklen für 2 gRNA-Verkettungssysteme, beide bei 37 °C für 5 min, 21 °C für 5 min, 15 min bei 37 °C und dann für immer 4 °C halten.
3. Exonuklease-Behandlung
   Anmerkung: Dieser Schritt wird dringend empfohlen, da er die Effizienz der Klonierung erhöht, indem alle Spuren linearisierter DNA entfernt werden.
   1. Behandeln Sie die BbsI Shuffling-Reaktion mit einer DNA-Exonuklease (siehe Materialtabelle) wie folgt.
   2. Nehmen Sie 11,0 μl Ligationsmischung aus dem vorherigen Schritt (2.2.3), fügen Sie 1,5 μl Exonuklease-Puffer (10x), 1,5 μl ATP (10 mM), 1,0 μl DNA-Exonuklease hinzu und erhöhen Sie das Gesamtvolumen mit Wasser auf 15,0 μl. 30 min bei 37 °C inkubieren, gefolgt von 30 min
      Anmerkung: Dieser Schritt entfernt alle linearisierten DNA-Reste in der Mischung und erhöht so die Klonierungseffizienz.
   3. 2 μl des Reaktionsgemisches zur Umwandlung in chemisch kompetente E. coli-Bakterien durch Hitzeschock verwenden.
      HINWEIS: Alternativ kann die Reaktion bis zu einer Woche bei -20 °C gelagert werden.

<p class="jove_title">3. Transfektion von Darmorganoiden durch Elektroporation

HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass dieses Verfahren auf dem von Fujii et al. im Jahr 2015 veröffentlichten Protokoll basiert, mit Anpassung für Dünndarm-Organoidkulturen von Mäusen.

1. Vor-Elektroporation
   Anmerkung: In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie die Darmorganoide der Maus vor der Elektroporation vorbereitet werden, indem alle Antibiotika und konditionierten Medien aus dem Nährmedium entfernt werden. Dadurch werden mögliche toxische Wirkungen bei der Elektroporation vermieden.
   1. Am Tag 0 der Transfektion werden die Organoide im Verhältnis 1:2 gespalten
      HINWEIS: Darm-Organoidkulturen können durch die Durchführung einer Kryptenisolierung gemäß zuvor festgelegten Protokollen gewonnen werden. Bitte beziehen Sie sich auf Tabelle 2 für alle Medienzusammensetzungen.
      1. Bei der Spaltung von Organoiden für die Elektroporation ist die Aussaat von mindestens 6 Vertiefungen einer 48-Well-Platte pro Transfektion zu säen.
      2. Die Organoide werden in 20 μL-Basalmatrixtropfen gesät und in WENR + Nic Medium (Wnt + EGF + Noggin + R-Spondin + Nicotinamid) bei 37 °C, 5% CO₂ in einem befeuchteten Inkubator (wie zuvor beschrieben) gezüchtet.
   2. Wechseln Sie am Tag 2 das Medium, indem Sie WENR+Nic durch 250 μl EN (EGF + Noggin) + CHIR99021 (Glykogensynthase-Kinase-3-Hemmer) + Y-27632 (ROCK-Inhibitor) ohne Antibiotika ersetzen (siehe Tabelle 2).
      HINWEIS: In allen Schritten beträgt die Menge des Mediums, die in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte gegeben wird, 250 μl.
   3. An Tag 3 wird das Organoidmedium auf EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25 % v/v Dimethylsulfoxid (DMSO) ohne Antibiotika umgestellt.
2. Vorbereitung der Zellen
   Anmerkung: Hier beschreiben wir, wie Organoide durch mechanische und chemische Dissoziation in kleine Zellcluster fragmentiert werden können. Diese Schritte sind entscheidend für den Erfolg des Verfahrens.
   1. Brechen Sie an Tag 4 die Matrizenkuppeln des Untergeschosses mit einer 1-ml-Pipettenspitze auf und übertragen Sie die Organoide in ein 1,5-ml-Röhrchen. Poolinhalt von vier Vertiefungen einer 48-Well-Platte in ein Rohr.
   2. Zerlegen Sie Organoide mechanisch in kleine Fragmente, indem Sie mit einer P200-Pipette etwa 200 Mal auf und ab pipettieren. Zentrifugieren Sie bei Raumtemperatur, 5 min bei 600 x g.
   3. Entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml einer rekombinanten Protease in Zellkulturqualität (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie maximal 5 Minuten bei 37 °C und überprüfen Sie dann einen 50-μl-Probentropfen unter einem inversen Lichtmikroskop mit einem 4-fach-Objektiv.
      Anmerkung: Cluster von 10-15 Zellen sind wünschenswert, da dies das Überleben der Zellen nach der Elektroporation erhöht.
   4. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein niedrig bindendes 15-ml-Röhrchen und stoppen Sie die Dissoziation durch Zugabe von 9 mL Basalmedium ohne Antibiotika (siehe Tabelle 2). Zentrifugieren Sie bei Raumtemperatur 5 min bei 600 x g, verwerfen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL reduziertem Serummedium (siehe Materialtabelle).
   5. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einer Bürkerkammer und verwenden Sie mindestens 1 x 10⁵ Zellen pro Elektroporationsreaktion. Geben Sie 9 mL reduziertes Serummedium in das 15 mL Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei Raumtemperatur, 3 min bei 400 x g.
3. Elektroporation
   Anmerkung: In den folgenden Abschnitten finden Sie Anweisungen, wie Sie die Elektroporation durchführen und die Organoide anschließend wiederherstellen können.
   1. Entfernen Sie den gesamten Überstand und suspendieren Sie das Pellet in einer Elektroporationslösung (siehe Materialtabelle). Geben Sie eine Gesamtmenge von 10 μg DNA in die Zellsuspension und fügen Sie Elektroporationslösung bis zu einem Endvolumen von 100 μl hinzu und halten Sie das Zell-DNA-Gemisch auf Eis. Verwenden Sie CRISPR-Concatamer-Vektoren in Kombination mit einem Cas9-Expressionsplasmid (z.B. Addgene #41815) im Verhältnis 1:1.
      Anmerkung: Das Gesamtvolumen der zugegebenen DNA sollte kleiner oder gleich 10 % des Gesamtreaktionsvolumens sein.
   2. Fügen Sie eine separate Transfektionsmischung hinzu, die ein GFP-Plasmid enthält, um die Transfektionseffizienz zu bewerten (z. B. pCMV-GFP, Addgene #11153 oder ein generisches GFP-exprimierendes Plasmid).
   3. Geben Sie das Zell-DNA-Gemisch in die Elektroporationsküvette und legen Sie es in die Elektroporatorkammer. Messen Sie die Impedanz, indem Sie den entsprechenden Knopf am Elektroporator drücken, und stellen Sie sicher, dass sie 0,030-0,055 kΩ beträgt. Führen Sie die Elektroporation gemäß den in Tabelle 3.
      gezeigten Einstellungen durch. Anmerkung: Wenn der Impedanzwert außerhalb des zulässigen Bereichs liegt, stellen Sie das Lösungsvolumen in der Küvette ein.
   4. Geben Sie 400 μl Elektroporationspuffer + Y-27632 in die Küvette und geben Sie dann alles in ein 1,5-ml-Röhrchen. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren, damit sich die Zellen erholen können, und anschließend 3 min bei Raumtemperatur bei 400 x g schleudern.
   5. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 20 μl/Vertiefung der Kellermatrix. Säen Sie ca. 1 x 104 bis 1 x 105 Zellen pro Well in einer 48-Well-Platte und fügen Sie EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25 % v/v DMSO-Medium hinzu. Inkubieren bei 37 °C.
   6. Wechseln Sie am Tag 5 das Medium auf EN + CHIR99021 + Y-27632 und überprüfen Sie die Transfektionseffizienz, indem Sie die GFP-Expression beobachten (Abbildung 2). Halten Sie die Organoide bei 37 °C und aktualisieren Sie EN + CHIR99021 + Y-27632 nach 2 Tagen auf Medium.
   7. An Tag 9 das Medium auf WENR + Nic + Y-27632 umstellen und bei 37 °C inkubieren.
      Anmerkung: Y-27632 kann nach 7-10 Tagen (an den Tagen 16-19) entfernt werden.

	Kassette 1	Kassette 2	Kassette 3	Kassette 4
Sequenz (5′-3′)	CACCGG[gRNA1]GT	ACCGG[gRNA2]G	CCGG[gRNA3]	ACACCGG[gRNA4]GTT
Sequenz (5′-3′)	TAAAAC[RC-gRNA1]CC	AAAAC[RC-gRNA2]C	AAAC[RC-gRNA3]	CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG

Tabelle 1: Überhänge für jede Kassette des CRISPR-Verkettungsvektors.

Basales Medium		Kommentare
4 Wochen bei 4 °C lagern
Zellkulturmedium	500 mL	Siehe Werkstofftabelle
L-Glutamin	100x 5 mL
Puffermittel 1 M	5 mL	Siehe Werkstofftabelle
Penicillin Streptomycin	100x 5 mL
WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + Rspondin + Nicotinamid)
2 Wochen bei 4 °C lagern
Basales Medium	bis zu 50 mL
Nahrungsergänzungsmittel ohne Serum für neuronale Zellen (50x)	1 mL	Siehe Werkstofftabelle
Nahrungsergänzungsmittel ohne Serum für neuronale Zellen (100x)	500 μL	Siehe Werkstofftabelle
n-Acetylcystein (500 mM)	125 μL
EGF für Maus (100 μg/ml)	ca. 25 μl
Maus Noggin (100 μg/ml)	50 μL
R-Spondin konditioniertes Medium	5 mL
Wnt3a konditioniertes Medium	ca. 25 mL
Nicotinamid (1 M)	250 μL
EN + CHIR + Y-27632 (EGF + Noggin + CHIR + Y-27632)
2 Wochen bei 4 °C lagern
Basalmedium ohne Penicillin Streptomycin	bis zu 20 mL
Nahrungsergänzungsmittel ohne Serum für neuronale Zellen (50x)	400 μL	Siehe Werkstofftabelle
Nahrungsergänzungsmittel ohne Serum für neuronale Zellen (100x)	200 μL	Siehe Werkstofftabelle
n-Acetylcystein (500 mM)	50 μL
EGF für Maus (100 μg/ml)	10 μL
Maus Noggin (100 μg/ml)	ca. 20 μl
Y-27632 (10 μM)	ca. 20 μl
CHIR99021 (8 μM)	10 μL
EN (EGF + Noggin)
4 Wochen bei 4 °C lagern
Basales Medium	bis zu 50 mL
Nahrungsergänzungsmittel ohne Serum für neuronale Zellen (50x)	1 mL	Siehe Werkstofftabelle
Nahrungsergänzungsmittel ohne Serum für neuronale Zellen (100x)	500 μL	Siehe Werkstofftabelle
n-Acetylcystein (500 mM)	125 μL
EGF für Maus (100 μg/ml)	ca. 25 μl
Maus Noggin (100 μg/ml)	50 μL

Tabelle 2: Zusammensetzung organoider Medien.

	Poren-Puls	Impuls übertragen
Spannung	175V	20V
Pulslänge	5 ms	50 ms
Puls-Intervall	50 ms	50 ms
Anzahl der Impulse	arabische Ziffer	5
Abbaurate	10 %	40%
Polarität	+	+/-

Tabelle 3: Elektroporationseinstellungen.

Representative Results

Materials

Optimized CRISPR Design Tool 	Feng Zhang group 		CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/
Webcutter 2.0 			restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) 	New England Biolabs 	M0201L
T4 DNA ligase buffer 	New England Biolabs 	M0202S
T7 DNA Ligase 	New England Biolabs	 M0318L
DTT (dithiothreitol) 	Promega 	P1171
ATP (adenosine triphosphate) 	New England Biolabs 	P0756S
FastDigest BbsI (BpiI) 	Thermo Fisher 	FD1014
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer)	Thermo Fisher 	BY5
BglII 	New England Biolabs 	R0144
EcoRI 	New England Biolabs 	R0101
Plasmid-safe exonuclease 	Cambio 	E3101K
Thermal cycler 	Applied biosystems 	4359659
10G competent E. coli bacteria 	Cambridge Bioscience 	60108-1
Advanced DMEM/F12(cell culture medium)	Invitrogen 	12634-034
Glutamax (L-Glutamine) 	100x Invitrogen 	35050-068
HEPES 1 M (buffering agent) 	Invitrogen 	15630-056
Penicillin-streptomycin 100x 	Invitrogen 	15140-122
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x	Invitrogen 	17504-044
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x	Invitrogen 	17502-048
n-Acetylcysteine 500 mM 	Sigma-Aldrich 	A9165-5G
Mouse EGF 500 μg/mL 	Invitrogen Biosource 	PMG8043
Mouse Noggin 100 μg/mL 	Peprotech	 250-38
Nicotinamide 1 M 	Sigma 	N0636
R-Spondin conditioned medium 	n.a. 	n.a. 	Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013
Wnt conditioned medium	n.a. 	n.a. 	Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2014
Y-27632 10 μM 	Sigma-Aldrich 	Y0503-1MG
Standard BD Matrigel matrix 	BD Biosciences	356231
48-well Plate 	Greiner Bio One 	677980
CHIR99021 	Sigma-Aldrich 	A3734-1MG
IWP-2 	Cell Guidance Systems 	SM39-10
TrypLE (recombinant protease)	 Invitrogen 	12605-010
Opti-MEM (reduced serum medium)	Life technologies	 51985-034
Electroporation Cuvettes 2 mm gap 	NepaGene 	EC-002S
Low binding 15 mL tubes 	Sigma-Aldrich 	CLS430791
Bürker’s chamber 	Sigma-Aldrich	 BR719520-1EA
NEPA21 Super Electroporator 	NepaGene 	contact supplier
Protein LoBind tubes low binding	Thermo Fisher 	10708704
BTXpress electroporation buffer 	Harvard Apparatus 	45-0805
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	 AppliChem	 A3672