Quelle: Merenda, A. et al., Ein Protokoll für den multiplen Gen-Knockout in Dünndarm-Organoiden der Maus unter Verwendung eines CRISPR-Verkettungsgeräts. J. Vis. Exp. (2017).
Dieses Video beschreibt eine Gen-Knockout-Technik, bei der ein CRISPR-Verkettungsgerät verwendet wird, um mehrere Gene in kultivierten Darmorganoidzellen von Mäusen gleichzeitig auszuschalten. Diese Methode wird verwendet, um ein erkranktes Gen auszuschalten und die Funktion eines Gens und seiner Parameter aufzuklären.
HINWEIS: Das Ziel dieses Abschnitts ist es, zu erklären, wie man sich für die beste Targeting-Strategie entscheidet und wie man gRNAs mit spezifischen Überhängen für den CRISPR-Verkettungsvektor entwirft.
HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass dieses Verfahren auf dem von Fujii et al. im Jahr 2015 veröffentlichten Protokoll basiert, mit Anpassung für Dünndarm-Organoidkulturen von Mäusen.
Kassette 1 | Kassette 2 | Kassette 3 | Kassette 4 | |
Sequenz (5′-3′) | CACCGG[gRNA1]GT | ACCGG[gRNA2]G | CCGG[gRNA3] | ACACCGG[gRNA4]GTT |
Sequenz (5′-3′) | TAAAAC[RC-gRNA1]CC | AAAAC[RC-gRNA2]C | AAAC[RC-gRNA3] | CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG |
Tabelle 1: Überhänge für jede Kassette des CRISPR-Verkettungsvektors.
Basales Medium | Kommentare | |
4 Wochen bei 4 °C lagern | ||
Zellkulturmedium | 500 mL | Siehe Werkstofftabelle |
L-Glutamin | 100x 5 mL | |
Puffermittel 1 M | 5 mL | Siehe Werkstofftabelle |
Penicillin Streptomycin | 100x 5 mL | |
WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + Rspondin + Nicotinamid) | ||
2 Wochen bei 4 °C lagern | ||
Basales Medium | bis zu 50 mL | |
Nahrungsergänzungsmittel ohne Serum für neuronale Zellen (50x) | 1 mL | Siehe Werkstofftabelle |
Nahrungsergänzungsmittel ohne Serum für neuronale Zellen (100x) | 500 μL | Siehe Werkstofftabelle |
n-Acetylcystein (500 mM) | 125 μL | |
EGF für Maus (100 μg/ml) | ca. 25 μl | |
Maus Noggin (100 μg/ml) | 50 μL | |
R-Spondin konditioniertes Medium | 5 mL | |
Wnt3a konditioniertes Medium | ca. 25 mL | |
Nicotinamid (1 M) | 250 μL | |
EN + CHIR + Y-27632 (EGF + Noggin + CHIR + Y-27632) | ||
2 Wochen bei 4 °C lagern | ||
Basalmedium ohne Penicillin Streptomycin | bis zu 20 mL | |
Nahrungsergänzungsmittel ohne Serum für neuronale Zellen (50x) | 400 μL | Siehe Werkstofftabelle |
Nahrungsergänzungsmittel ohne Serum für neuronale Zellen (100x) | 200 μL | Siehe Werkstofftabelle |
n-Acetylcystein (500 mM) | 50 μL | |
EGF für Maus (100 μg/ml) | 10 μL | |
Maus Noggin (100 μg/ml) | ca. 20 μl | |
Y-27632 (10 μM) | ca. 20 μl | |
CHIR99021 (8 μM) | 10 μL | |
EN (EGF + Noggin) | ||
4 Wochen bei 4 °C lagern | ||
Basales Medium | bis zu 50 mL | |
Nahrungsergänzungsmittel ohne Serum für neuronale Zellen (50x) | 1 mL | Siehe Werkstofftabelle |
Nahrungsergänzungsmittel ohne Serum für neuronale Zellen (100x) | 500 μL | Siehe Werkstofftabelle |
n-Acetylcystein (500 mM) | 125 μL | |
EGF für Maus (100 μg/ml) | ca. 25 μl | |
Maus Noggin (100 μg/ml) | 50 μL |
Tabelle 2: Zusammensetzung organoider Medien.
Poren-Puls | Impuls übertragen | |
Spannung | 175V | 20V |
Pulslänge | 5 ms | 50 ms |
Puls-Intervall | 50 ms | 50 ms |
Anzahl der Impulse | arabische Ziffer | 5 |
Abbaurate | 10 % | 40% |
Polarität | + | +/- |
Tabelle 3: Elektroporationseinstellungen.
The authors have nothing to disclose.
Optimized CRISPR Design Tool | Feng Zhang group | CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/ | |
Webcutter 2.0 | restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/ | ||
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) | New England Biolabs | M0201L | |
T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | M0202S | |
T7 DNA Ligase | New England Biolabs | M0318L | |
DTT (dithiothreitol) | Promega | P1171 | |
ATP (adenosine triphosphate) | New England Biolabs | P0756S | |
FastDigest BbsI (BpiI) | Thermo Fisher | FD1014 | |
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer) | Thermo Fisher | BY5 | |
BglII | New England Biolabs | R0144 | |
EcoRI | New England Biolabs | R0101 | |
Plasmid-safe exonuclease | Cambio | E3101K | |
Thermal cycler | Applied biosystems | 4359659 | |
10G competent E. coli bacteria | Cambridge Bioscience | 60108-1 | |
Advanced DMEM/F12(cell culture medium) | Invitrogen | 12634-034 | |
Glutamax (L-Glutamine) | 100x Invitrogen | 35050-068 | |
HEPES 1 M (buffering agent) | Invitrogen | 15630-056 | |
Penicillin-streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Mouse EGF 500 μg/mL | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
Mouse Noggin 100 μg/mL | Peprotech | 250-38 | |
Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
R-Spondin conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
Wnt conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2014 |
Y-27632 10 μM | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
48-well Plate | Greiner Bio One | 677980 | |
CHIR99021 | Sigma-Aldrich | A3734-1MG | |
IWP-2 | Cell Guidance Systems | SM39-10 | |
TrypLE (recombinant protease) | Invitrogen | 12605-010 | |
Opti-MEM (reduced serum medium) | Life technologies | 51985-034 | |
Electroporation Cuvettes 2 mm gap | NepaGene | EC-002S | |
Low binding 15 mL tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
Bürker’s chamber | Sigma-Aldrich | BR719520-1EA | |
NEPA21 Super Electroporator | NepaGene | contact supplier | |
Protein LoBind tubes low binding | Thermo Fisher | 10708704 | |
BTXpress electroporation buffer | Harvard Apparatus | 45-0805 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | AppliChem | A3672 |