Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

Abstract

Quelle: Agamasu, C. et al. Vollständig verarbeitetes rekombinantes KRAS4b: Isolierung und Charakterisierung des farnesylierten und methylierten Proteins. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video demonstriert die Kationenaustauschchromatographie-Technik zur Isolierung von rekombinantem Protein aus dem Insektenzellproteinlysat.

Protocol

1. Protein-Aufreinigung

1. Bereiten Sie die Puffer A–H vor, wie in Tabelle 1 dargestellt.

kg kg kg kg kg kg kg kg

Pufferlösung	Puffermittel (alle 20 mM)	Ph	NaCl (mM)	Imidazol (mM)	MgCl2	TCEP
ein	HEPES	7,3	300	–	5	1
Vgl.	HEPES	7,3	300	35	5	1
C	HEPES	7,3	300	500	5	1
D	Mes	6,0	200	–	5	1
E	Mes	6,0	–	–	5	1
F	Mes	6,0	100	–	5	1
G	Mes	6,0	1000	–	5	1
H	HEPES	7,3	300	–	1	1

2. Bereiten Sie die Aufreinigungsmaterialien vor (siehe Materialtabelle): Proteaseinhibitor-Cocktail ohne EDTA oder andere Chelatoren; immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie-Säule (IMAC); Kationenaustauschchromatographie-Säule (CEX); 0,45-μm-Spritzenvorsatzfilter; 2 M Imidazol (pH = 7,5); Ultrazentrifuge mit einer Kapazität von 100.000 x g; Hochgeschwindigkeits-Tischzentrifuge mit einer Kapazität von 4.000 x g; Zentrifugalfilteranlagen (10 KDa NMWL); Spektralphotometer zum Ablesen bei 280 nm; Protease des His6-Tabak-Ätzvirus (TEV); und Chromatographie-Instrumente, die in der Lage sind, zwei Pufferlösungen zu mischen, Lösungen auf Säulen aufzutragen, Gradientenelutionen aus der Säule zu erzeugen und Fraktionen aus Säulen zu sammeln.
3. Entfernen Sie das Insektenzelllysat aus der Dialyse und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 4.000 x g, um eventuellen Niederschlag zu entfernen. Die endgültige, dialysierte, geklärte Probe ist zu diesem Zeitpunkt noch oft trüb, kann aber ohne weitere Verarbeitung auf die nachfolgende CEX-Säule aufgetragen werden.
4. Eine 20-ml-Kationenaustauschsäule (siehe Materialtabelle) wird durch Waschen mit drei CVs Puffer G und dann mit drei CVs mit Puffer F.
   Anmerkung: Während wir andere Harze nicht sorgfältig evaluiert haben, haben mehrere Kollegen bei anderen Harzen als SP Sepharose High Performance eine schlechte Auflösung festgestellt.
5. Verdünnen Sie 20 mL der dialysierten Probe auf eine NaCl-Endkonzentration von 100 mM durch Zugabe von 20 mL Puffer E und tragen Sie die verdünnte Probe auf die Kationenaustauschersäule auf.
6. Fahren Sie mit der Beladung der Säule fort, indem Sie frisch verdünnte Proben, die wie oben beschrieben vorbereitet wurden, in das Laderöhrchen geben, da sich die vorherige Verdünnung dem Ende der Beladung nähert.
   Anmerkung: Die Verdünnung der gesamten Probe auf einmal auf 100 mM NaCl hat zu einem erheblichen Verlust des Zielproteins durch Fällung geführt.
7. Waschen Sie die Säule mit Puffer F auf den Ausgangswert Abs280. Dies erfordert in der Regel 3 CV. Das Protein wird während eines 400 ml (20 CV) Gradienten von Puffer F zu 65 % Puffer G aus der Säule eluiert und in 6 ml-Fraktionen gesammelt (Abbildung 1B).
8. Waschen Sie die Säule für weitere 1,5 CV (65 % Puffer G), sobald der Gradient abgeschlossen ist.

Representative Results

Materials

1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural	Eppendorf	22363204
11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials	Thermo Scientific	30211SS-1232
5427R Centrifuge	Eppendor
Acetonitrile, HPLC Grade	Fisher Chemical	A998-1 1L
Cation Exchange Chromatography (CEX) column	GE Healthcare Life Sciences	29018183	HiPrep SP Sepharose High Performance
Exactive Plus EMR Mass Spectrometer	Thermo Scientific
Gilson vials 7×14 mm Tubes	GE Healthcare	BR-1002-12
High speed/benchtop centrifuge	Thermo Fischer Scientific	05-112-114D	Capable of up to 4,000 xg
His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease	Addgene	92414	Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY
Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators	Millipore Sigma	P8849
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	09689-250g
Argon gas	Airgas	ARUP
Formic Acid	Sigma-Aldrich	F0507-500MI	Use Reagent Grade or better
NGC Chromatography System	BioRad	78880002	NGC QuestTM 100 Chromatography system
Lipid extruder set with holder	AVANTI POLAR LIPIDS	610023
Liquid nitrogen	Airgas	NI-DEWAR
Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL	Millipore Sigma	UFC901008	PES membrane
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters	Amicon	UFC501024
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima – L80K	capable of 100,000 xg
CHAPS	Sigma	C3023