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Abstract

Quelle: Bird, L. E., et al. Grün fluoreszierendes Protein-basiertes Expressionsscreening von Membranproteinen in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)

In diesem Video demonstrieren wir eine Fluoreszenzdetektionsgrößenausschlusschromatographie-Technik, um die Stabilität von grün fluoreszierendem Protein (GFP)-fusionierten Membranproteinen in Escherichia coli nach Detergenzsolubilisierung zu untersuchen. Proteine, die einen symmetrischen Peak im Größenausschlussprofil mit wenig oder keinem freien GFP aufweisen, weisen auf gereinigte Proteine mit minimalem Abbau und Aggregation hin, die anschließend für die Struktur-Funktions-Analyse ausgewählt werden können.

Protocol

1.Solubilisierung und Analyse der Membranfraktion

1. Tauen Sie die Membranfraktion auf (falls erforderlich) und aliquotieren Sie für jedes Detergens, das zur Solubilisierung verwendet werden soll, 900 μl der Membransuspension in ein 1,5-ml-Polyallomer-Mikrozentrifugenröhrchen.
2. 100 μl jedes frisch zubereiteten Reinigungsmittels (10 % w/v Lösungen von DDM, DM, Cymal-6 und LDAO) in einer Endkonzentration von 1 % in das angegebene 1,5-ml-Röhrchen geben. Zur Solubilisierung von eukaryotischen Membranproteinen kann den Detergenzien Cholesterin-Hemisuccinat (0,2 % Endkonzentration) zugesetzt werden.
3. Die Mischungen werden bei 4 °C 1 Stunde lang unter leichtem Rühren inkubiert.
4. Die unlösliche Fraktion des Reinigungsmittels wird mit einer Ultra-Zentrifuge auf dem Tisch pelletiert, wobei darauf zu achten ist, dass die Röhrchen mindestens halb voll sind, bei 150.000 g bei 4 °C für 45 min und den Überstand zurückhalten.
   Anmerkung: Die Wirksamkeit der Detergenz-Solubilisierung kann unter Verwendung eines Fluoreszenzplatten-Readers abgeschätzt werden, indem die GFP-Fluoreszenz der löslichen Membranen mit der unlöslichen Detergenzienfraktion gemessen wird, die im gleichen Volumen PBS resuspendiert ist.
5. Analysieren Sie die Monodispersität der verschiedenen Detergenzien-Membran-Proteinkomplexe mit Hilfe der fluoreszenzdetektierten Größenausschlusschromatographie (FSEC).
6. Für die FSEC-Analyse äquilibrieren Sie eine Größenausschlusssäule mit einem breiten Fraktionierungsbereich, z. B. 5.000 bis 5.000.000 Molekulargewicht, mit einem Laufpuffer (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,03 % DDM) bei einer Flussrate von 0,3 ml/min. Verwenden Sie diesen Puffer für alle Proben, d. h. er wird nicht für jedes getestete Detergens geändert.
7. Injizieren Sie 100 μl gelöste Membranen mit einer Flussrate von 0,3 ml/min auf die Säule. Überwachen Sie das Elutionsprofil mit Hilfe der Fluoreszenzoptik (Anregung bei 488 nm und Emission bei 512 nm). Wenn kein Inline-Fluoreszenzmonitor verfügbar ist, sammeln Sie die Fraktionen und lesen Sie die Fluoreszenz in einem Platten-Reader ab.
8. Importieren Sie Daten zum Elutionsvolumen und zur Fluoreszenzintensität in ein Tabellenkalkulationsprogramm zur grafischen Anzeige.

Materials

Cholesterol hemisuccinate 	Sigma-Aldrich 	C6512
CYMAL-6 (6-Cyclohexyl-1-Hexyl-βD-Maltoside)	Anatrace 	C326
DDM (n-Dodecyl β-maltoside) 	Generon 	D97002
DM (n-Decyl β-maltoside) 	Generon 	D99003
LDAO (N,N-Dimethyl-ndodecylamine N-oxide) 	Generon 	D71111
BenchMark Fluorescent Protein Standard	 Life Technologies 	LC5928
Optima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor	 Beckman Coulter 	393253
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor 	Beckman Coulter 	393315
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector 	Shimadzu
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column 	GE Healthcare 	17-5172-01