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Abstract

Quelle: Lovely, C. B. et al. Quantifizierung des Ethanolgehalts in Zebrafischembryonen mittels Kopfwelt-Gaschromatographie. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video zeigt die Verwendung von Headspace-Gaschromatographie zur Bestimmung der Ethanolkonzentrationen in Zebrafischembryonen. Diese Methode stellt ein nützliches Werkzeug für die qualitative und quantitative Analyse flüchtiger organischer Verbindungen dar.

Protocol

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Messung des embryonalen Volumens mit Hilfe der Wasserverdrängung

HINWEIS: In diesem Protokoll werden Embryonen 24 h nach der Befruchtung (hpf) verwendet (Abbildung 1). Die Embryonen, die bei den Volumenmessungen verwendet werden, werden bei der Ethanolanalyse nicht verwendet.

1. Geben Sie 10 Embryonen und extraembryonale Flüssigkeit in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit einem Volumen von 250 μl markiert ist (Abbildung 2A). Geben Sie Wasser in die 250 μL-Fülllinie (siehe Beispiel mit gefärbtem Wasser in Abbildung 2B).
2. Wiederholen Sie Schritt 1.1, um Gefäße für Embryonen einzurichten, denen die Chorionen entnommen wurden.
   1. Um das Chorion zu entfernen, legen Sie die Embryonen in ihre Chorionen in eine 100 mm Petrischale mit 2 mg/ml Proteasecocktail in einem Embryomedium bei Raumtemperatur (RT) für 10 Minuten. Schwenken Sie die Embryonen alle paar Minuten vorsichtig, um das Chorion zu brechen.
   2. Sobald alle Embryonen von ihrem Chorion befreit sind, nehmen Sie die dechorionierten Embryonen aus dem Protease-Cocktail-/Embryomedium und legen Sie sie in eine neue 100-mm-Petrischale mit frischem Embryomedium, um die Embryonen zu waschen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch 1 Mal (für insgesamt 2 Wäschen). Übertragen Sie die Embryonen in eine frische 100 mm Petrischale.
3. Entfernen Sie mit der kleinstmöglichen Spitze und ohne die Embryonen zu beschädigen vorsichtig alle Flüssigkeit aus der Umgebung der Embryonen mit einer p200-Mikropipette (Abbildung 2C) und wiegen Sie das Wasser mit einer Waage mit einer Genauigkeit von <0,1 mg. Um das Volumen der Probe von 10 Embryonen zu bestimmen, subtrahieren Sie das Gewicht/Volumen des entnommenen Wassers (1 ml Wasser = 1 g Wasser.) von 250 μl. Um das Volumen eines einzelnen Embryos zu bestimmen, dividieren Sie die Differenz zwischen 250 μl und dem Gewicht des entnommenen Wassers durch 10,
   
   

2. Behandlung von Embryonen mit Ethanol

1. Entnehmen Sie Embryonen aus Paarungstanks und legen Sie sie in eine Standard-100-mm-Petrischale. Zählen Sie nicht mehr als 100 Embryonen pro Petrischale ab und inkubieren Sie bei 28,5 °C.
   Anmerkung: Wenn das Chorion entfernt werden soll (Schritt 1.2), muss es vor der Zugabe von Ethanol entfernt werden.
2. Bei 6 hpf werden bis zu 100 Embryonen in eine neue Standard-100-mm-Petrischale gegeben, entweder mit Embryomedien oder mit Embryomedien + 1 % Ethanol (v/v). Abdecken, aber NICHT versiegeln Sie die Petrischale. Legen Sie die Embryonen für 18 Stunden in einen auf 28,5 °C eingestellten Niedertemperatur-Inkubator oder bis die Embryonen den Entwicklungszeitpunkt von 24 hpf erreicht haben.

3. Vorbereitung des Arbeitsablaufs vor der Verarbeitung der Embryonen für die Kopfwelt-Gaschromatographie

1. Stellen Sie eine Lösung von 5 M NaCl in Wasser her (450 μl werden pro Probenröhrchen benötigt), um alle Proteine zu denaturieren und den Ethanolstoffwechsel zu verhindern. Den Protease-Cocktail in einer Konzentration von 2 mg/ml im Embryomedium herstellen.
2. Beschriften Sie für jede Probe ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und ein 2-ml-Gaschromatographenfläschchen. Beschriften Sie weitere 2-ml-Gaschromatographen-Fläschchen für die unten beschriebenen Ethanolstandards sowie Luft, Wasser und die 5-m-NaCl/Protease-Cocktailrohlinge.
3. Richten Sie drei p200-Mikropipetten ein, zwei auf 50 μl und den dritten auf 200 μl, einen p1000-Mikropipetten, der auf 450 μl und ein p2-Mikropipettenset auf 2 μl. Führen Sie bei den Glaspipetten, die zum Transfer von Embryonen aus den Petrischalen in die 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen verwendet werden, die Pipettenspitze schnell durch eine Flamme, um die Kanten zu glätten, damit die Embryonen beim Einziehen in die Pipette nicht beschädigt werden.

4. Verarbeitung von Embryonen für die Kopf-Weltraum-Gaschromatographie

HINWEIS: Sowohl Embryonen in ihren Chorionen als auch solche, die zuvor aus ihren Chorionen entnommen wurden, werden gleich behandelt, um die Konsistenz bei der Berechnung der Verdünnungsfaktoren zu gewährleisten.

1. Mit den beiden auf 50 μl eingestellten p200-Mikropipetten werden 50 μl der Protease-Cocktaillösung in eine und 50 μl Wasser in die zweite gezogen.
2. Legen Sie mit der Glaspipette und der Mikropipette schnell 10 Embryonen (aus Schritt 2.2) in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und schließen Sie die Kappe (wie in Abbildung 2A beschrieben). Wiederholen Sie den Vorgang für alle zu testenden Proben, Kontrollen und mit Ethanol behandelten Embryonen.
3. Öffnen Sie mit der auf 200 μl eingestellten p200-Mikropipette schnell die Kappe und entfernen Sie alle Embryomedienreste (wie in Abbildung 2C beschrieben). Legen Sie die Pipette mit 50 μl Wasser schnell in das Röhrchen und fügen Sie schnell, aber vorsichtig (um die Embryonen nicht zu beschädigen) das Wasser hinzu und entfernen Sie es dann. Geben Sie schnell 50 μl der Protease-Cocktaillösung aus der wartenden Pipette und schließen Sie den Röhrchendeckel (Abbildung 2D).
   Anmerkung: Führen Sie diesen Vorgang Probe für Probe durch.
4. Lassen Sie die Probe 10 Minuten lang bei RT ruhen, damit der Protease-Cocktail das Chorion abbauen kann. Fügen Sie dann schnell 450 μl 5 M NaCl hinzu und schließen Sie den Röhrchendeckel (Abbildung 2E). Die Proben 10 Minuten lang vortexen. Um den Prozess zu beschleunigen, stellen Sie den Mischer so ein, dass er mehrere Proben gleichzeitig vortext.
   HINWEIS: Geben Sie eine kleine Menge (~100 μl) einer Kieselsäurekügelchenmischung (2 Größen, 0,5 mm und 1 mm Kügelchen) in ein beliebiges Röhrchen mit Embryonen, die älter als 24 hpf sind. Bei älteren Embryonen bleibt die Chorda intakt, unabhängig davon, wie lange sie homogenisiert sind.
5. Nach 10 Minuten Homogenisierung schnell 2 μl des homogenisierten Embryoüberstands entfernen und in ein Gaschromatographenfläschchen geben. Verschließen Sie das Fläschchen schnell mit der Kappe aus Polytetrafluorethylen.

5. Vorbereitung von Medien und Ethanolnormen

1. Zur Herstellung der Medienstandards wird das Medium mit einer 5 M NaCl/Protease-Cocktaillösung um den Faktor 10 verdünnt. 2 μl jeder Probe werden in ein Gaschromatographenfläschchen gegeben und mit einer Polytetrafluorethylenkappe verschlossen
.
2. Um die Ethanolstandards vorzubereiten, erstellen Sie eine serielle Verdünnung von 100 % Ethanol in 5 M NaCl/Protease-Cocktaillösung auf die folgenden Konzentrationen: 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 und 40 mM. Geben Sie 2 μl jedes Standards in ein Gaschromatographenfläschchen und verschließen Sie es mit einer Kappe aus Polytetrafluorethylen.

6. Vorbereitung der Headspace-Gaschromatographie

HINWEIS: Die Headspace-Gaschromatographie wird zur Quantifizierung des Ethanolgehalts verwendet, nicht zur Trennung.

1. Stellen Sie die Heizung für den Autosampler auf 58 °C ein und schalten Sie sie ein. Lassen Sie die Heizung auf 58 °C ansteigen und schalten Sie die Luft- und Wasserstoffgasleitungen ein, die den Gaschromatographen speisen (für die Flammenionisation zur Quantifizierung des Ethanols).
   HINWEIS: Der psi-Wert sollte so eingestellt werden, dass der Chromatograph gemäß den Herstellerangaben ordnungsgemäß betrieben wird. Stellen Sie sicher, dass die Heliumleitung eingeschaltet und auf den richtigen psi-Wert eingestellt ist.
2. Stellen Sie für das Septum sicher, dass die Anzahl der injizierten Proben nicht >100 beträgt. Stellen Sie für die Injektionsfaser sicher, dass die Anzahl der injizierten Proben nicht >500,
   beträgt HINWEIS: Wenn eine der beiden Injektionen die Anzahl der Injektionen überschreitet, müssen sie vor der Durchführung der Testproben gewechselt werden.
3. Schalten Sie die Analysesoftware ein und stellen Sie sicher, dass die Workstation ordnungsgemäß eingerichtet ist. Speichern Sie alle Daten gemäß den Labor-/Abteilungsstandards. Erstellen Sie eine neue Beispielliste für die auszuführenden Beispiele.
4. Starten Sie die Startmethode und warten Sie, bis sich der Flammenionisationsdetektor stabilisiert hat, bevor Sie die Proben ausführen. Sobald sie stabil ist, führen Sie die Software-Startmethode aus, um die Faser zu reinigen.

7. Probenmessungen mittels Kopfraum-Gaschromatographie

1. Sobald die Startmethode abgeschlossen ist, erstellen Sie 1 neue Zeile pro Beispiel in der Beispielliste. Laden Sie aus dem Methodenmenü in der Analysesoftware 436 Current spme ethanol 2013 3min absorb 2_5min rg run. METH für jede Probe in der Probenliste.
   1. Füllen Sie die Probenliste aus, beginnend mit den Luft-, Wasser- und 5 M NaCl/Protease-Cocktail-Rohlingen. Geben Sie dann die Standards in der Reihenfolge ein, von 0,3125 bis 40 mM. Befolgen Sie die Standards mit einer zweiten Runde Luft, Wasser und 5 M NaCl/Protease-Cocktailrohlingen.
   2. Geben Sie alle homogenisierten Embryoüberstandsproben ein, die getestet werden sollen, von der niedrigsten bis zur höchsten vorhergesagten Ethanolkonzentration. Zum Schluss gibt es eine dritte und letzte Runde mit Luft, Wasser und 5 M NaCl/Protease-Cocktailrohlingen.
2. Geben Sie die Gaschromatographenfläschchen in der Reihenfolge, in der die Proben eingegeben wurden, in den Autosampler. Lassen Sie die Proben 10–15 Minuten erwärmen. Starten Sie die Beispielläufe in der Software.
3. Nachdem alle Proben und die endgültigen Rohlinge ausgeführt wurden, aktivieren Sie die Abschaltmethode in der Software, indem Sie ein endgültiges Muster in die Beispielliste einfügen und den Standby-Modus ausführen. METH. Sichern Sie alle Daten, die während der Beispielläufe erfasst wurden. Schalten Sie das Gerät in der folgenden Reihenfolge aus: Autosampler-Heizung, Wasserstofftank und erst wenn die Chromatographentemperatur 30 °C erreicht hat, den Lufttank. Lassen Sie den Heliumtank eingeschaltet, um die Wachssäule zu konservieren.

8. Integration von Ethanol-Peaks in Proben und Analyse der Probenkonzentration

HINWEIS: Alle Werte ab 8.3 wurden in einer Excel-Datei berechnet, die alle Gleichungen vorausgefüllt hat.

1. Sobald die Abschaltmethode abgeschlossen ist, klicken Sie auf Chromatogramm öffnen. Öffnen Sie den Ordner mit den Ergebnissen. Proben werden automatisch in dieses Programm integriert.
2. Achten Sie darauf, dass in den Ergebnissen die richtigen Peaks integriert wurden (Ethanol-Peaks zwischen 2 und 2,5). Sobald alle Proben bestätigt wurden, drucken oder exportieren Sie die Ergebnisse.
3. Zeichnen Sie die Spitzenhöhe der Ethanolstandards in einem Diagramm auf. Berechnen Sie die Steigung, den Y-Schnittpunkt und die^R2-Werte für die Ethanolnormen (^R2 sollte >0,99 betragen).
   Anmerkung: Diese Werte werden verwendet, um die Ethanolkonzentration aus der Peakhöhe der Probe zu bestimmen.
4. Subtrahieren Sie für jede Probe die Peakhöhe der Probe vom Y-Schnittpunkt der Ethanolstandards. Dieser Wert wird durch die Steigung der Ethanolstandards dividiert, um den Ethanolwert für jede Probe in den GC-Fläschchen zu erhalten.
   
5. Um die Ethanolkonzentration in den Embryonen zu berechnen, berechnen Sie zunächst den Verdünnungsfaktor für jede Probe. Nehmen Sie das in Schritt 1.3 dieses Protokolls berechnete Volumenmaß und dividieren Sie es durch das Volumenmaß plus 500 μl. Dies entspricht der 5 M NaCl/Protease-Cocktaillösung, die jeder Probe während der Embryonalverarbeitung (Schritte 4.3 und 4.4) zugesetzt wurde.
   
6. Unter Verwendung dieses Probenverdünnungsfaktors wird für jede Probe mit dem Ethanolwert der Probe multipliziert. Die Ergebnisse werden in mM-Konzentration vorliegen. Berechnen Sie Medienreferenzproben durch Multiplikation des Ethanolwerts des Mediums mit dem Verdünnungsfaktor von 10,
   
   

Representative Results

Materials

AutoSampler, CP-8400	Varian		Gas Chromatograph Autosampler
Ethanol	Decon Labs	2701
Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL	Agilent	8010-0198	Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa
Gas Chromatograph, CP-3800	Varian
Helium			Provided by contract to the university
HP Innowax capillary column	Agilent	19095N-123I	30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick
Hyrdogen			Provided by contract to the university
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Fisher Scientific	2682002
Micropipette tips 10 μL	Fisher Scientific	13611106
Micropipette tips 1000 μL	Fisher Scientific	13611127
Micropipette tips 200 μL	Fisher Scientific	13611112
Pipetman L p1000L Micropipette	Gilson	FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette	Gilson	FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette	Gilson	FA10001M
Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap	Agilent	5190-7021	Replacement caps/septa for gas chromatograph vials
Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane	Millipore Sigma	57343-U	Replacement fibers
Star Chromatography Workstation	Varian		Chromatography software
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa	Millipore Sigma	23154	Replacement inlet septa