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Abstract

Quelle: Hanna-Addams, S., et al. Verwendung einer zweidimensionalen, halbdenaturierenden Agarose-Gelelektrophorese zur Bestätigung der Größenheterogenität von Amyloid oder Amyloid-ähnlichen Fasern. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video demonstriert die auf zweidimensionalen halbdenaturierenden Agarosegelelektrophoresen basierende Trennung von Amyloidfasern. Die Technik trennt die polymorphen Amyloid-Aggregate anhand ihrer heterogenen Größe.

Protocol

<p class="jove_title">1. Proben vorbereiten

1. Kultur von 2 x 10⁶ Amyloid-produzierenden HT-29-Dickdarmkrebszellen in einer 10-cm-Gewebekulturschale in 10 ml Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Rinderserum und Penicillin-Streptomycin. Kultivieren Sie die Zellen über Nacht in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂.
   1. Nachdem die Zellen auf 80 % Konfluenz angewachsen sind, waschen Sie die Zellen mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). 3 ml Trypsin-Lösung zugeben und 3 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
   2. Nachdem die Zellen vollständig von der Schale dissoziiert wurden, fügen Sie 10 ml Kulturmedium hinzu und übertragen Sie die Zellen mit einer 10-ml-Pipette in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.000 x g für 3 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie das Medium, resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml Kulturmedium und zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler. Teller 2 x 10^{je 6} Zellen in zwei 10-cm-Schalen.
   3. Lassen Sie die Zellen über Nacht in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂ anhaften und sich erholen. Die Behandlung wird auf eine Schale angewendet, um die Bildung von Amyloiden mit 20 ng/ml Tumornekrosefaktor-Alpha (TNF-α), 100 nM Smac-Mimetikum und 20 μM Pan-Caspase-Inhibitor Z-VAD-FMK zu induzieren. Die Kombination wird als TSZ abgekürzt. Behandeln Sie das andere Gericht mit dem Vehikel als Kontrolle.
2. Nach der entsprechenden Zeitspanne, in der Regel 6 Stunden, ernten Sie das Zelllysat.
   1. Kratzen Sie die Zellen mit einem Plastikschaber von der Platte ab und verwenden Sie eine 10-ml-Pipette, um sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen zu überführen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.000 x g für 3 min bei 4 °C.
   2. Waschen Sie die Zellen 2 Mal, indem Sie sie in 10 mL eiskaltem PBS resuspendieren und bei 1.000 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren. Aspirieren Sie die PBS-Lösung.
      Anmerkung: Hier kann der Prozess pausiert werden, indem das Zellpellet in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zu 1 Monat bei ˗80 °C gelagert wird.
   3. Übertragen Sie das Zellpellet in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie es 30 Minuten lang in 0,3 mL Lysepuffer auf Eis. Zentrifugieren Sie bei 20.000 x g für 15 min bei 4 °C. Der Überstand ist das Ganzzelllysat.
      Anmerkung: Hier kann der Prozess pausiert werden, indem die Probe bis zu mehreren Monaten bei -20 °C gelagert wird.
   4. Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem Bradford-Assay. Fügen Sie 4x SDD-AGE-Ladepuffer hinzu, um 20 μl der 3 μg/μl Probe vorzubereiten, und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

<p class="jove_title">2. Gele vorbereiten und ausführen

1. 2 g Agarose zu 200 mL 1x Trisacetat-Puffer (TAE) in ein Becherglas geben und in der Mikrowelle erhitzen, um die Agarose zu schmelzen. Fügen Sie 1 ml 20 % SDS hinzu, um eine Endkonzentration von 0,1 % SDS zu erhalten. Vorsichtig schwenken, um sich zu vermischen. Achten Sie darauf, dass nach der SDS-Zugabe keine Blasen entstehen.
2. Gießen Sie die Agaroselösung in eine 15 cm x 14 cm große Gelplatte. Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, um Blasen zu entfernen. Legen Sie einen 20-Well-Kamm an die Spitze.
3. Erste Dimension: Pipettieren Sie 60 μg Ganzzelllysat auf der äußersten rechten Spur. Lassen Sie das Gel etwa 4 h lang bei 60 V laufen (bis die Farbstofffront etwa 3/4 durch das Gel hindurch ist), wobei der TAE mit 0,1 % SDS als Laufpuffer verwendet wird.
4. Zweite Dimension: Drehen Sie das Gel vorsichtig um 90° gegen den Uhrzeigersinn (Abbildung 1A). Lassen Sie das Gel bei 60 V für ca. 4 h.
   laufen Anmerkung: Der allgemeine Betriebszustand beträgt 4 V/cm Gellänge. Es ist wichtig, dass die Laufbedingungen für die erste und zweite Dimension genau gleich sind.

Representative Results

Materials

gel electrophoresis unit	Fisher	HE99XPRO	appratus for gel running.
agrose	VWR	97062-250	For agarose gel.
DMEM	Sigma	D6429	for cell culture
fetal bovine serum	Sigma	F4135	for cell culture
penicilin-streptomycin	Sigma	P4333	for cell culture
Trypsin solution	Sigma	T4049	for cell culture
PBS for tissue culture	Sigma	D8662	for cell culture
recombinant TNF	made in our lab		for inducing necroptosis.
smac-mimetic	gift from Dr. Xiaodong Wang		for inducing necroptosis. See reference 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	for inducing necroptosis. See reference 11.
Cell Counter	Bio-Rad	1450102	Model TC20; for counting cells
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	for measuring protein concentration in cell lysates
Cell lifter	Fisher	07-200-364	to remove cells from dish
Lysis Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4<br/> 10 mL glycerol<br/> 30 mL 5 M NaCl<br/> 840 mL ddH<sub>2</sub>O<br/> 10 mL Triton-X100<br/> (protease and phosphates inhibitors as desired)
10X TAE (1 L)			48.4 g Tris base<br/> 11.42 mL glacial acetic acid<br/> 20 mL 0.5M EDTA pH 8<br/> ddH20 to 1 L
4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)			5 mL 10X TAE<br/> 10 mL glycerol<br/> 4 mL 20% SDS<br/> 0.5 mL 10% bromophenol blue<br/> 31 mL ddH<sub>2</sub>O
PBST Wash Buffer (1 L)			100 mL 10xPBS<br/> 800 mL ddH<sub>2</sub>O<br/> 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl<br/> 20 g KCl<br/> 144 g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>&middot;2H<sub>2</sub>O<br/> 24 g KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub><br/> add ddH<sub>2</sub>O to 10 L