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Abstract

Quelle: Lu, Y., et al. Bewertung von In-vitro-DNA-Schäden mit dem Comet Assay J. Vis. Exp. (2017)

In diesem Video demonstrieren wir einen alkalischen Einzelzell-Elektrophorese-Assay zur Quantifizierung von Einzel- und Doppelstrang-DNA-Brüchen in Doxorubicin-behandelten Zellen. Alkalische Bedingungen stören die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen DNA-Basenpaaren, was zu einer vollständigen Abwicklung und Trennung der DNA-Stränge führt. Dies ermöglicht eine differentielle Migration von unbeschädigten und beschädigten DNA-Fragmenten im Agarosegel nach der Elektrophorese, wodurch eine kometenförmige Struktur aus langsam wandernder, unbeschädigter DNA, die den kreisförmigen Kometenkopf bildet, und schnell wandernden beschädigten DNA-Fragmenten, die den länglichen Kometenschweif bilden, sichtbar wird.

Protocol

<p class="jove_title">1. Reagenzien vorbereiten

1. 1x PBS
   1. Verdünnen Sie 100 mL 10x PBS mit 900 mL dH₂O und stellen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät auf 7,4 ein. Bei Raumtemperatur lagern.
2. Lyselösung (LS)
   1. Bereiten Sie 2,5 M NaCl, 100 mM Dinatrium-EDTA, 10 mM Tris-Base und 200 mM NaOH in 900 mL dH₂O vor; es dauert in der Regel etwa 20 Minuten, bis sich die Mischung vollständig aufgelöst hat. Stellen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät auf 10 ein. Fügen Sie 1 % Natriumlaurylsarkosinat und 1 % Triton X-100 hinzu und stellen Sie das endgültige Volumen auf 1.000 ml ein. Vor Gebrauch mindestens 30 Minuten auf 4 °C abkühlen lassen.
3. Alkalische Elektrophoreselösung (AES), pH >13
   1. Bereiten Sie 200 mM NaOH und 1 mM Dinatrium EDTA in 800 mL dH₂O vor. Stellen Sie den pH-Wert ein und stellen Sie sicher, dass er einen pH-Wert von >13 hat. Stellen Sie das endgültige Volumen auf 1.000 ml ein. Vor Gebrauch frisch machen und vor Gebrauch mindestens 30 Minuten auf 4 °C abkühlen
   lassen
4. Lösung zum Färben
   1. 1. 1 μl 10.000x grün fluoreszierenden Nukleinsäure-Farbstoff (z. B. SYBR Green) in 30 mL Tris-EDTA-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM Dinatrium-EDTA, pH 7,4) geben und bei 4 °C lagern. Vor Licht schützen.
5. 1% niedrigschmelzende Agarose
   1. Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (1 g in 100 mL dH₂O) wird in der Mikrowelle geschmolzen. Schwenken Sie die Agarose alle 15-20 s, um sicherzustellen, dass die Agarose vollständig geschmolzen ist. Legen Sie die Agarose vor Gebrauch mindestens 20 Minuten in ein 37°C warmes Wasserbad.
6. Pipettenspitzen vorwärmen
   1. Schneiden Sie die schmalen Enden der P200-Pipettenspitzen um 3 mm ab und erwärmen Sie sie bei 37 °C, bevor Sie Agarose pipettieren.

<p class="jove_title" style="margin-left: 14.2pt;">2. Comet-Dias vorbereiten

1. Beschichtung von Objektträgern
   1. 1% Agarose (1 g in 100 mL dH₂O) in der Mikrowelle für 2 – 3 min schmelzen oder bis die Agarose vollständig geschmolzen ist. Tauchen Sie die Objektträger aus Glas in die Agarose und wischen Sie eine Seite des Objektträgers mit einem fusselfreien Tuch ab.
   2. Legen Sie die Objektträger zum Trocknen an der Luft auf eine ebene Fläche oder erhitzen Sie sie bei 50 °C, um das Trocknen zu beschleunigen. Nach dem Trocknen sollte sich ein transparenter Agarosefilm bilden. Legen Sie die beschichteten Objektträger vor Gebrauch bei 37°C ab.
2. Herstellung von einzelligen Suspensionen
   1. Kultivierung und Behandlung der Gliomzelle
      1. Die U251 MG-Zellen werden in DMEM-Ham F-12-Medium kultiviert, das mit 10 % FBS, 100 μg/ml Penicillin und 10 μg/ml Streptomycin bei 37 °C und 5 % CO₂ ergänzt wurde.
      2. Verdauen Sie die Zellen 3 Minuten lang mit 1 ml Trypsin und neutralisieren Sie Trypsin mit DMEM-Ham F-12-Medium mit FBS. In einem 15-ml-Röhrchen sammeln, 4 Minuten lang bei 300 x g drehen, das Medium aspirieren und die Zellen bei 2 x 10⁵ Zellen/ml in 1x PBS suspendieren.
         Anmerkung: Die Zellprobe sollte unmittelbar vor Beginn des Assays vorbereitet werden, und alle Proben sollten in einer dunklen oder abgedunkelten Umgebung gehandhabt werden, um DNA-Schäden durch Licht zu vermeiden.
      3. Kombinieren Sie die Zellsuspension mit 1 % geschmolzener Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (bei 37 °C) im Verhältnis 1:10 (v/v), mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren, und pipettieren Sie sofort 30 μl auf einen mit Agarose beschichteten Objektträger. Verwenden Sie die Seite der Pipettenspitze, um das Agarose-Zell-Gemisch zu verteilen, um die Bildung einer dünnen Schicht zu gewährleisten.
      4. Legen Sie den Objektträger 10 Minuten lang flach bei 4 °C im Dunkeln. Eine Erhöhung der Gelierzeit auf 30 Minuten verbessert die Haftung der Proben in Umgebungen mit hoher Luftfeuchtigkeit.
      5. Tauchen Sie die Rutsche in 4°C LS im Dunkeln für 1 h bis über Nacht.
3. Einzelzell-Elektrophorese
   1. Für alkalische Kometen-Assays
      1. Entfernen Sie vorsichtig die Objektträger aus dem LS, lassen Sie überschüssigen Puffer ab und tauchen Sie es vorsichtig 1 h lang bei 4 °C in AES ein, damit sich die DNA abwickeln kann. Bewahren Sie die Dias im Dunkeln auf.
      2. Geben Sie vorgekühltes AES in die Elektrophorese-Objektträgerschale, überschreiten Sie nicht mehr als 0,5 cm über den Objektträgern (dies hängt von der Größe der Elektrophoreseeinheiten ab), legen Sie die Objektträger hinein und decken Sie sie mit einer Kappe ab. Stellen Sie die Versorgungsspannung auf 1 V/cm (die Länge zwischen den Elektroden) ein und lassen Sie sie 30 Minuten lang bei 4 °C laufen.
      3. Überschüssige Elektrophoreselösung vom Objektträger ablassen. Tauchen Sie die Objektträger zweimal für jeweils 5 min bei Raumtemperatur vorsichtig in dH₂O ein.
      4. Tauchen Sie die Objektträger vorsichtig 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in 70%iges Ethanol. Fahren Sie mit dem Färben fort.
4. Stain Comet Dias
   1. Trocknen Sie die Objektträger bei 37°C für 10 – 15 min im Dunkeln.
   2. 50 – 100 μl grün fluoreszierende Nukleinsäure-Färbelösung auf jede getrocknete Agarose geben und 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln färben.
   3. Spülen Sie die Objektträger kurz in dH₂O ab und trocknen Sie sie vollständig bei 37°C im Dunkeln. Fahren Sie mit der Bildaufnahme und -analyse fort.

Materials

10x PBS(Ca<sup>++</sup>, Mg<sup>++</sup> free)&nbsp;	TEKnova&nbsp;	P0196
NaCl&nbsp;	Sigma&nbsp;	S5886
EDTA&nbsp;	TEKnova&nbsp;	E0308
Trizma base&nbsp;	Sigma&nbsp;	T1503
NaOH&nbsp;	Sigma&nbsp;	72068
Sodium lauryl sarcosinate&nbsp;	Sigma&nbsp;	L7414
Triton X-100&nbsp;	Sigma&nbsp;	93443
SYBR Green&nbsp;	Invitrogen&nbsp;	S33102
Low melting point agarose&nbsp;	Invitrogen&nbsp;	16520
Agarose&nbsp;	Invitrogen&nbsp;	16500
95% ethanol&nbsp;	WARNER-GRAHAM&nbsp;	#64-17-5
Trypsin&nbsp;	GIBCO&nbsp;	25300-054
Glass tissue slides&nbsp;	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES&nbsp;	63422-11
Kimwipes&nbsp;	KIMberly-Clark
1.5 mL Microcentrifuge Tubes&nbsp;	DENVILLE
Pipette Tips&nbsp;	SHARP
Microwave&nbsp;	Avanti
Waterbath&nbsp;	PRECISION
Horizontal electrophoresis chamber&nbsp;	TREVIGEN&nbsp;	Cometassay ES II
Power supply&nbsp;	Bio-Rad
Incubator&nbsp;	Quincy Lab&nbsp;	Model 12-140E
Fluorescent microscope&nbsp;	Zeiss&nbsp;	LSM700
Micropipettor&nbsp;	Eppendorf